通信作者簡介：郝新寶，醫(yī)學(xué)博士，血液/腫瘤學(xué)教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師（南京醫(yī)科大學(xué)及海南醫(yī)科大學(xué)）。海南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科學(xué)科帶頭人。長期從事血液病、腫瘤的醫(yī)療、教學(xué)和科研工作，同時開展小分子化合物、大分子蛋白藥物及細(xì)胞藥物開發(fā)、臨床研究轉(zhuǎn)化及項目管理30多年。曾承擔(dān)國家自然科學(xué)基金、軍隊及省部級課題共計20余項，在國內(nèi)外期刊發(fā)表論文逾100篇，谷歌學(xué)術(shù)統(tǒng)計總引用約2 600次，單篇最高引用797次，H-index 15，培養(yǎng)博士、碩士研究生30多人。E-mail：haoxb@hainmc.edu.cn。

【摘要】 免疫治療在臨床抗腫瘤治療中取得了良好的療效，尤其是嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法作為一種新興的腫瘤免疫療法，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床治療中取得了突破性的療效。但CAR-T細(xì)胞在治療過程中會面臨逐漸衰竭的問題，特別是在實體瘤的治療中，導(dǎo)致抗腫瘤療效欠佳及復(fù)發(fā)等風(fēng)險。文章分析了CAR-T細(xì)胞衰竭的可能機(jī)制，并闡述了抑制CAR-T細(xì)胞衰竭的相關(guān)研究進(jìn)展，以期設(shè)計合理的治療策略，減少CAR-T細(xì)胞的衰竭，提高CAR-T細(xì)胞的效能。

【關(guān)鍵詞】 CAR-T細(xì)胞；T細(xì)胞衰竭；衰竭機(jī)制；調(diào)控策略

Research on strategies to inhibit CAR-T cell exhaustion

FU Qiongyu， HAO Xinbao ， TAO Shi

（Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University， Haikou 570100， China）

Corresponding author： HAO Xinbao， E-mail： haoxb@hainmc.edu.cn

【Abstract】 Immunotherapy has achieved good efficacy in clinical anti-tumor therapy， especially chimeric antigen receptor T cell （CAR-T cell） therapy， as an emerging tumor immunotherapy， has achieved breakthrough efficacy in the clinical treatment of hematologic malignancies. However， CAR-T cell face the problem of gradual exhaustion during the treatment process， especially in the treatment of solid tumors， which will lead to poor anti-tumor efficacy and possible risks such as recurrence. This paper analyzed the possible mechanism of CAR-T cell exhaustion and describes the relevant research progress in inhibiting CAR-T cell exhaustion， with a view to designing reasonable therapeutic strategies to reduce CAR-T cell exhaustion and improve the efficacy of CAR-T cell.

【Key words】 CAR-T cell； T cell exhaustion； Mechanisms of exhaustion； Governance policies

免疫療法在腫瘤治療中取得了顯著的效果，尤其是嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法，在抗腫瘤方面取得了突破性的進(jìn)展。盡管CAR-T療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面取得了成功，但T細(xì)胞在體內(nèi)易耗盡，尤其是進(jìn)入實體腫瘤后，因此CAR-T細(xì)胞衰竭是實體腫瘤治療成功的主要障礙之一［1］。T細(xì)胞耗竭現(xiàn)象首次在慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎?。╨ymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）感染小鼠的CD8+ T細(xì)胞中被觀察到，并在癌癥和其他感染模型中得到證實［2］。在慢性感染或癌變過程中，由于病原體或腫瘤細(xì)胞的抗原或炎癥因子對T細(xì)胞的刺激持續(xù)時間較長，導(dǎo)致記憶和效應(yīng)T細(xì)胞功能逐漸喪失，這一過程即T細(xì)胞衰竭。T細(xì)胞衰竭的特征包括多種抑制受體的共同表達(dá)、效應(yīng)功能的逐漸喪失以及效應(yīng)細(xì)胞的過度分化。腫瘤中的T細(xì)胞衰竭與免疫治療的效果呈負(fù)相關(guān)，因此，探索CAR-T細(xì)胞衰竭的機(jī)制對于減少CAR-T細(xì)胞衰竭、提高CAR-T細(xì)胞效能以及設(shè)計新的治療策略至關(guān)重要。本文綜述了CAR-T細(xì)胞衰竭的機(jī)制以及基于這些機(jī)制的CAR-T細(xì)胞治療策略的最新研究進(jìn)展，旨在更好地理解CAR-T細(xì)胞療法在腫瘤治療中的作用，為提高其療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 CAR-T細(xì)胞衰竭的機(jī)制

1.1 CAR的結(jié)構(gòu)設(shè)計影響CAR-T細(xì)胞衰竭

CAR由3個主要部分組成：細(xì)胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CAR-T細(xì)胞技術(shù)經(jīng)歷了4代的發(fā)展，第一代CAR-T細(xì)胞只有CD3結(jié)構(gòu)域（CD3 domain，CD3ζ）；第二代CAR-T細(xì)胞包括CD3ζ和共刺激結(jié)構(gòu)域（costimulatory domain，CM）；第三代CAR-T細(xì)胞有2個不同的CM；第四代CAR-T細(xì)胞具有額外的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，用于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或其他共刺激分子的表達(dá)［3］。第一代CAR含有一個單鏈可變片段（single-chain fragment variable，scFv），該片段與CD3ζ的細(xì)胞內(nèi)信號域相連。這些CAR僅提供T細(xì)胞啟動信號而缺乏共刺激分子，通過CD3ζ的信號傳導(dǎo)不足以啟動靜息T細(xì)胞，由于信號傳導(dǎo)能力有限，第一代CAR-T細(xì)胞不能實現(xiàn)持續(xù)應(yīng)答［3-4］。第二代CAR包括一個CM（CD28、4-1BB、OX-40、ICOS和CD134），為T細(xì)胞的激活提供了第二個信號，可以防止CAR-T細(xì)胞的衰竭，其中含CD28和ζ鏈的CAR-T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell with CD28 and ζ-chain，CD28ζCAR-T細(xì)胞）與含4-1BB和ζ鏈的CAR-T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell with 4-1BB and ζ-chain，4-1BBζCAR-T細(xì)胞）相比，4-1BBζCAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性更強(qiáng)，但殺傷作用更弱，因此研究人員將這2種共刺激分子整合到CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)中，從而開發(fā)了第三代CAR-T細(xì)胞［3］。第三代CAR具有多個CM，進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；第四代CAR-T細(xì)胞被設(shè)計為在識別目標(biāo)抗原時分泌特定的細(xì)胞因子，這是通過在CAR結(jié)構(gòu)中添加第二個基因來實現(xiàn)的，該基因編碼細(xì)胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)因子（酶或配體）；第三代和第四代的抗腫瘤作用增強(qiáng)，但毒性和其他副作用增加［5］。見表1。

1.2 體外擴(kuò)增條件影響CAR-T細(xì)胞衰竭

在CAR-T細(xì)胞制造過程中，多個技術(shù)因素都會影響T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性和有效性，包括冷凍保存、培養(yǎng)中接收的激活信號的劑量和培養(yǎng)時間［6］。為了獲得足夠的CAR-T細(xì)胞數(shù)量，這些細(xì)胞需要在體外擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，通常添加細(xì)胞因子白介素-2（interleukin-2，IL-2），但這種做法可能導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞衰竭并降低它們在體內(nèi)的持久性。相比之下，在輔助性T細(xì)胞9（T helper 9 cell，Th9）培養(yǎng)條件下極化和擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞（T9 CAR-T）對已建立的腫瘤具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性。與IL-2極化的T1 CAR-T細(xì)胞相比，T9 CAR-T細(xì)胞分泌IL-9及少量干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），表達(dá)中樞記憶表型和較低水平的衰竭標(biāo)志物，并表現(xiàn)出強(qiáng)大的增殖能力，因此T9 CAR-T細(xì)胞比T1 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)對血液和實體腫瘤具有更大的抗腫瘤活性［7］。此外，CAR-T細(xì)胞的衰竭水平隨著體外擴(kuò)增時間的延長而增加，因此，培養(yǎng)時間較短的“年輕”細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出較低的衰竭標(biāo)志物和更強(qiáng)的長期殺傷功能［8］。這些發(fā)現(xiàn)提示在CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)中，需要精細(xì)調(diào)控培養(yǎng)條件和時間，以優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的持久性和療效。

1.3 抑制性受體持續(xù)高表達(dá)與T細(xì)胞衰竭相關(guān)

衰竭的T細(xì)胞表現(xiàn)出多種抑制性受體（inhibitory receptor，IR）過表達(dá)的特征，相關(guān)IR如程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）、淋巴細(xì)胞激活基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、2B4（CD244）、CD160、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T-cell immunoglobulin mucin-3，TIM-3）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）等。IR通過以下4種不同的方式誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭：①抑制激活受體的細(xì)胞內(nèi)信號，②上調(diào)T細(xì)胞衰竭相關(guān)基因，③影響T細(xì)胞的代謝，④阻止共刺激信號［9］。在慢性感染和癌癥中，由于抗原持續(xù)存在，多個IR表現(xiàn)出持續(xù)高表達(dá)的狀態(tài)，這是耗盡的CD8+ T細(xì)胞的生物標(biāo)志之一。IR在多種免疫細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)，它們與配體結(jié)合后，通過多種分子機(jī)制負(fù)向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，其中PD-1和CTLA-4與CD8+ T細(xì)胞衰竭的關(guān)系最為密切［10］。PD-1主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）。在活化的T細(xì)胞表面，外周抗原被T細(xì)胞識別后，PD-1表達(dá)上調(diào)；外周T細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）識別腫瘤抗原后，程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）或PD-L2會結(jié)合PD-1并激活下游相關(guān)信號通路，通過反饋抑制阻斷TCR信號通路，下調(diào)由B細(xì)胞淋巴瘤-2樣蛋白1（B-cell lymphoma-2-like 1，BCL2L1）編碼的B細(xì)胞淋巴瘤-超大蛋白（B-cell lymphoma-extra-large，Bcl-xL）等特異性抗凋亡蛋白分子和促炎因子的表達(dá)，最終抑制T細(xì)胞的存活、增殖和免疫功能［11］。CTLA-4在衰竭T細(xì)胞（exhausted T cell，Tex）、活化T細(xì)胞和Treg中高度表達(dá)，CTLA-4和CD28都是免疫球蛋白超家族成員（immunoglobulin superfamily，IgSF），CTLA-4對B7-1/2具有較高的親和力，CTLA-4與CD28 競爭結(jié)合B7-1/2，CD28與B7-1/2結(jié)合可促進(jìn)T細(xì)胞增殖和激活，而CTLA-4與B7-1/2結(jié)合則阻止早期T細(xì)胞激活［12］。

1.4 抗原持續(xù)暴露導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭

在慢性感染或癌癥中，T細(xì)胞在相關(guān)高水平抗原的慢性刺激下會依次分化至終末衰竭，Tex可表現(xiàn)為IR的持續(xù)表達(dá)（如PD-1、LAG-3、2B4和CTLA-4的持續(xù)表達(dá)），產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子如IFN-γ和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的能力減弱，以及T細(xì)胞增殖能力的降低［13］。在人和小鼠模型中，T細(xì)胞耗竭的程度與抗原刺激的持續(xù)時間呈正相關(guān)。一項關(guān)于CD8+ T細(xì)胞衰竭的研究顯示，T細(xì)胞與抗原短時間孵育后，部分Tex可以恢復(fù)功能，但長期孵育則無法恢復(fù)Tex的功能［9］。例如符合CAR-T細(xì)胞治療條件的患者通?；加袕?fù)發(fā)/難治性疾病，由于廣泛的癌癥病史，患者的T細(xì)胞暴露于慢性腫瘤抗原以及多種化學(xué)治療藥物，據(jù)報道，白血病誘導(dǎo)的T細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致自體CAR-T細(xì)胞的效果不理想。與健康個體產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞相比，這些CAR-T細(xì)胞清除腫瘤的效果較差［14］。因此CAR-T細(xì)胞的衰竭與長期暴露于抗原有密切關(guān)系。

1.5 腫瘤微環(huán)境影響CAR-T細(xì)胞的衰竭

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞以及可溶性因子如細(xì)胞因子、代謝物和細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）［15］。TME復(fù)雜的成分對CAR-T細(xì)胞發(fā)揮了復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。在TME中，存在多種機(jī)制阻礙CAR-T細(xì)胞的治療效果，包括代謝燃料的競爭、CAR-T細(xì)胞耗竭機(jī)制、物理障礙阻止有效CAR-T細(xì)胞浸潤、免疫抑制細(xì)胞因子和細(xì)胞類型。TME不僅阻礙CAR-T細(xì)胞運輸?shù)阶饔梦稽c，影響CAR-T細(xì)胞的代謝功能，還產(chǎn)生導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭的免疫抑制環(huán)境［16］。TME中的強(qiáng)抗炎信號，如細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β），誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和DC向免疫抑制活性極化，從而抑制CAR-T細(xì)胞功能；Treg、髓源性抑制細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）也有助于拮抗CAR-T細(xì)胞，最終導(dǎo)致惡劣的微環(huán)境使得CAR-T細(xì)胞衰竭和失活［1］。IL-10由癌細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞（Treg、DC、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等）分泌，IL-10對其他效應(yīng)免疫細(xì)胞有抑制作用，包括有效的抗腫瘤細(xì)胞毒性NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞［17］。TGF-β由許多腫瘤細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)TME中多種類型的免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；典型的TGF-β信號通路SMAD既控制腫瘤轉(zhuǎn)移，又控制免疫調(diào)節(jié)從而調(diào)節(jié)腫瘤免疫。TGF-β在TME中的主要作用之一是產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而抑制抗腫瘤免疫［18］。例如TGF-β下游激活的SMAD2/3誘導(dǎo)瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌患者的CD8+ T細(xì)胞功能障礙、衰竭和腫瘤生長增加［19］。

1.6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響CAR-T細(xì)胞的耗竭

Tex的轉(zhuǎn)錄譜與效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞明顯不同，多種轉(zhuǎn)錄因子包括干擾素調(diào)節(jié)因子4 （interferon regulatory factor 4，IRF4）、堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉(zhuǎn)錄因子（basic leucine zipper ATF-like transcription factor，BATF）、活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）、核受體亞家族4A組（nuclear receptor subfamily 4 group A，NR4A）、胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率組框蛋白（thymocyte selection-associated high mobility group box protein，TOX）、T細(xì)胞因子-1（T-cell factor 1，TCF-1）、T細(xì)胞中表達(dá)的T-box（T-box expressed in T cells，T-bet）、EOMES和B細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1（B lymphocyte-induced maturation protein 1，BLIMP1）等構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與T細(xì)胞耗竭的過程［20-21］。特別是IRF4、BATF、NR4A1等在T細(xì)胞抗原受體（T-cell receptor，TCR）信號下游發(fā)揮作用，參與T細(xì)胞衰竭狀態(tài)的形成，并且這些轉(zhuǎn)錄因子大多參與包括PD-1在內(nèi)的多種IR的表達(dá)，從而限制效應(yīng)因子的功能［21］。研究表明，在LCMV感染中，衰竭細(xì)胞比記憶T細(xì)胞具有更高的核EOMES∶T-bet比率，因此可以使用T細(xì)胞中T-bet和EOMES的相對水平來定義衰竭［22］。多種轉(zhuǎn)錄因子參與了CAR-T細(xì)胞衰竭的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子可以抑制CAR-T細(xì)胞的衰竭。

2 抑制CAR-T細(xì)胞衰竭的調(diào)控策略

2.1 優(yōu)化CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)

CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與其功能特性密切相關(guān)，包括scFv分子、CM和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的組成元件都對激活和耗竭具有調(diào)控作用，通過優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)和調(diào)控其表達(dá)模式，可以有效地減弱強(qiáng)直性CAR信號，防止CAR-T細(xì)胞衰竭［23］。例如，有研究者設(shè)計了帶有短或長scFv連接體的CD22 CAR和CD33 CAR，發(fā)現(xiàn)短scFv連接體（CART22-short或CART33-short）具有優(yōu)異的細(xì)胞毒性，分泌更多的IFN-γ、IL-2和TNF-α，導(dǎo)致衰竭相關(guān)表面蛋白的表達(dá)降低，具有顯著的抗白血病活性，提高了動物的存活率，因此CD22 CAR和CD33 CAR提高了CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的作用時間［24］。CD28和4-1BB是兩種最常見的共刺激分子，它們與CAR-T細(xì)胞中的抗原識別結(jié)構(gòu)域相連；與含有CD28/CD3的CAR-T細(xì)胞相比，含有共刺激分子4-1BB/CD3的CAR-T細(xì)胞可以延長存活時間，減少衰竭，并具有更好的分化表型［9］。在第二代CAR的結(jié)構(gòu)中加入了可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子（如IL-12、

IL-18、IL-21、IL-23）表達(dá)的結(jié)構(gòu)域，這些細(xì)胞因子的表達(dá)通過改善TME或促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的生成來增加CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性［3］。

2.2 改進(jìn)CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)

CAR-T細(xì)胞在體外擴(kuò)增是治療的一個關(guān)鍵步驟，這一過程會影響CAR-T細(xì)胞的衰竭。為了改進(jìn)體外擴(kuò)增技術(shù)，研究人員進(jìn)行了多項創(chuàng)新，例如CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增期間抑制從頭甲基化可以阻斷異常DNA甲基化（DNA methylation，DNAm），從而提高治療效果。Salz等［25］的研究結(jié)果證實了這些有害的DNAm變化是在培養(yǎng)擴(kuò)增過程中不斷獲得的，通過縮短培養(yǎng)期以避免功能失調(diào)的甲基化程序可能是提高過繼細(xì)胞療法的有前景的制造策略。

此外，CAR的強(qiáng)直信號傳導(dǎo)，即在沒有腫瘤抗原刺激的情況下自發(fā)的CAR激活被認(rèn)為是控制CAR-T療效的關(guān)鍵，如Chen等［26］的研究提出了一個CAR-T功能適應(yīng)度和CAR強(qiáng)直信號強(qiáng)度之間的關(guān)聯(lián)模型，該模型由CAR抗原結(jié)合域表面的帶正電荷貼片（positively charged patch，PCP）控制；在這個模型中，低效率的強(qiáng)直信號導(dǎo)致CAR-T缺乏持久性，而過度的強(qiáng)直信號導(dǎo)致CAR-T耗竭，因此通過在CAR設(shè)計中修改PCP或在離體培養(yǎng)過程中調(diào)整離子濃度來微調(diào)強(qiáng)直信號，可以獲得最佳的CAR-T細(xì)胞適應(yīng)性；合理調(diào)整PCP以優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的強(qiáng)直信號和體內(nèi)適應(yīng)性是下一代CAR的一種有前景的設(shè)計策略。

2.3 阻斷免疫檢查點的應(yīng)用

免疫檢查點阻斷在腫瘤免疫治療中對防止T細(xì)胞衰竭起著重要作用。靶向免疫檢查點可有效緩解T細(xì)胞衰竭，阻斷PD-1及其配體PD-L1與CTLA-4可顯著提高T細(xì)胞的殺傷功能，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）單克隆抗體已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床［20］。Chong等［27］的研究顯示，在靶向CD19的CAR-T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell targeting CD19，CD19 CAR-T細(xì)胞）治療后難治性和（或）復(fù)發(fā)的B細(xì)胞淋巴瘤患者中，使用PD-1抑制劑派姆單抗的患者有25%實現(xiàn)了完全緩解或部分緩解。使用飛行時間質(zhì)譜細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry by time of flight，CyTOF）的深度免疫分析顯示，臨床應(yīng)答者的CAR-T細(xì)胞活化和增殖增加，T細(xì)胞耗竭減少，這表明PD-1抑制劑在改善T細(xì)胞衰竭和增強(qiáng)CD19 CAR-T細(xì)胞療效方面具有一定的作用。此外，利用CRISPR-Csa9技術(shù)［一種高效、精準(zhǔn)的基因編輯工具，該系統(tǒng)由CRISPR相關(guān)蛋白Cas9和單導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）組成］破壞CAR-T細(xì)胞中的IR可顯著增強(qiáng)其對免疫抑制性TME的抗性，這是一種很有前景的癌癥免疫治療方式。研究表明，CAR-T細(xì)胞中CRISPR-Cas9對免疫檢查點的破壞，如PD-1破壞的表皮生長因子受體Ⅲ型突變體嵌合抗原受體（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ-chimeric antigen receptor，

EGFRvⅢ-CAR）-T細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞毒性和衰竭減少［28-29］。Agarwal等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，在臨床前白血病和骨髓瘤模型中，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的CTLA-4缺失可改善CAR-T細(xì)胞增殖和抗腫瘤療效，CTLA-4缺陷允許在高抗原負(fù)荷條件下無對抗CD28信號傳導(dǎo)和維持T細(xì)胞表面的CAR表達(dá)；在臨床研究中，CTLA-4的缺失挽救了之前CAR-T細(xì)胞治療失敗的白血病患者的T細(xì)胞功能，因此選擇性刪除CTLA-4可以激活功能失調(diào)的慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）患者的T細(xì)胞，為提高患者對CAR-T細(xì)胞治療的反應(yīng)提供了一種策略。這些研究強(qiáng)調(diào)了免疫檢查點阻斷在CAR-T細(xì)胞治療中的重要性，并指出了通過基因編輯技術(shù)改善CAR-T細(xì)胞衰竭的新途徑。

2.4 克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制提高CAR-T細(xì)胞療效

TME中的可溶性免疫抑制因子［如腺苷、吲哚胺2，3-雙加氧酶1（indoleamine2，3-dioxygenase1，IDO1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和TGF-β］、免疫抑制非腫瘤細(xì)胞［如髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）、基質(zhì)細(xì)胞］和膠原蛋白可促進(jìn)T細(xì)胞的衰竭［9］。近年來，為了克服復(fù)雜的TME以提高CAR-T細(xì)胞療效，研究者們開發(fā)了多種新策略。例如Li等［31］的研究發(fā)現(xiàn)，腺苷A2A受體（A2A receptor，A2AR）和腺苷A2B受體（A2B receptor，A2BR）在人源性CAR-T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且只有A2AR對腺苷誘導(dǎo)的CART細(xì)胞功能損傷負(fù)責(zé)；在體外用CRISPR-Cas9破壞人CAR-T細(xì)胞中的A2AR基因，可以增加CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功能并阻止其衰竭。Chen等［32］設(shè)計了CAR-T細(xì)胞，使其分泌雙特異性陷阱蛋白，共同靶向PD-1和TGF-β，這種改造的CAR-T細(xì)胞能夠減弱抑制性T細(xì)胞信號，增強(qiáng)T細(xì)胞的持久性和擴(kuò)張性，提高效應(yīng)細(xì)胞功能和抗衰竭能力。Liu等［33］研究了成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）靶向CAR-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可以通過重塑TME來增加序貫CAR-T治療的抗腫瘤活性。FAP靶向CAR-T細(xì)胞清除CAF，減少了MDSC的募集、分化和免疫抑制作用，改善了現(xiàn)有的CD8+ T細(xì)胞。此外，F(xiàn)AP靶向CAR-T細(xì)胞還能抑制腫瘤部位的MDSC，并促進(jìn)CLDN18.2靶向CAR-T細(xì)胞的浸潤和存活。

2.5 CAR-T細(xì)胞衰竭的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

在CAR-T細(xì)胞衰竭的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，多種轉(zhuǎn)錄因子扮演著關(guān)鍵角色。在連續(xù)的TCR信號傳導(dǎo)作用下，Tex細(xì)胞經(jīng)歷了從前體Tex（precursor Tex cells，Tpex）細(xì)胞到過渡性Tex細(xì)胞，最終到終末Tex（terminal Tex cells，Texterm）細(xì)胞的層次分化軌跡。在這個過程中，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如TCF-1、TOX和T-box家族成員（T-bet、Eomes）輪流調(diào)節(jié)不同Tex簇的衰竭程序［34］。Zheng等［35］的研究利用免疫功能正常的B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）小鼠模型證明，調(diào)節(jié)性核糖核酸酶1（Regnase-1）缺乏會促進(jìn)TCF-1表達(dá)，從而增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和記憶樣細(xì)胞的形成，改善CAR-T介導(dǎo)的腫瘤清除，并持續(xù)緩解和對繼發(fā)性腫瘤攻擊的保護(hù)。由于Regnase-1直接靶向轉(zhuǎn)錄因子7（transcription factor 7，Tcf7）信使RNA （messenger RNA，mRNA），其缺乏會增加TCF-1的表達(dá)，促進(jìn)Tpex的形成，支持CAR-T細(xì)胞的長期持久性和功能。Seo等［36］利用CAR-T細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，TOX和胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率組框蛋白2（thymocyte selection-associated high mobility group box protein 2，TOX2）在CD8+ CAR+ PD-1high TIM3high（耗盡）的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（chimeric antigen receptor-tumor infiltrating lymphocytes，CAR-TILs）中被高度誘導(dǎo)，并且TOX和TOX2雙缺位（TOX double-knock out，TOX DKO）的CAR-TILs在抑制腫瘤生長和延長腫瘤小鼠生存方面比野生型（wild-type，WT）、TOX缺位或TOX2缺位的CAR-TILs更有效。該研究表明TOX和NR4A轉(zhuǎn)錄因子對NFAT下游CD8+ T細(xì)胞衰竭的轉(zhuǎn)錄程序至關(guān)重要，提示破壞TOX和NR4A的表達(dá)或活性有希望作為癌癥免疫治療的策略。

2.6 CAR-T細(xì)胞衰竭的表觀遺傳調(diào)控

CAR-T細(xì)胞的表觀遺傳重塑被認(rèn)為是提升其療效的一種潛在手段，它可能通過減少耗竭、改善運輸和穿透能力、促進(jìn)記憶表型來實現(xiàn)這一目標(biāo)，從而增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞持久性和改善患者預(yù)后［37］。本文重點關(guān)注表觀遺傳調(diào)控對T細(xì)胞衰竭的影響。Zebley等［38］對復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者輸注后的CD8+ CD19-CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了縱向全基因組DNA甲基化分析，發(fā)現(xiàn)輸注后的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)為與記憶電位相關(guān)基因［如Tcf7和淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子1（lymphoid enhancer factor 1，LEF1）］的抑制以及DNA甲基化特征［如C-X3-C趨化因子受體1（C-X3-C chemokine receptor 1，CX3CR1）、BATF和TOX的去甲基化］，這些變化標(biāo)志著其向衰竭祖T細(xì)胞的過渡，因此CD19-CAR-T細(xì)胞經(jīng)歷了與耗竭相關(guān)的DNA甲基化編程。從頭DNA甲基化會促使T細(xì)胞衰竭，而甲基化抑制則會增強(qiáng)體內(nèi)T細(xì)胞恢復(fù)活力。例如地西他濱是一種被批準(zhǔn)用于臨床的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，在體外和體內(nèi)，地西他濱處理的嵌合抗原受體（decitabine-treated chimeric antigen receptor，dCAR）-T細(xì)胞的抗腫瘤活性、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和增殖都得到了增強(qiáng)，此外，dCAR-T細(xì)胞可以在低劑量下根除大體積腫瘤，且腫瘤浸潤的dCAR-T細(xì)胞在體內(nèi)保持相對較高的記憶相關(guān)基因表達(dá)和較低的衰竭相關(guān)基因表達(dá)［39］。這些發(fā)現(xiàn)表明了表觀遺傳調(diào)控有可能在未來成為逆轉(zhuǎn)CAR-T細(xì)胞衰竭的重要方法。

2.7 CAR-T細(xì)胞衰竭的代謝調(diào)節(jié)策略

代謝在T細(xì)胞存活、激活、發(fā)育、增殖、分化和抗腫瘤效應(yīng)功能中起著關(guān)鍵作用，通過體外代謝調(diào)節(jié)可以改善免疫功能和持久性，涉及的關(guān)鍵代謝途徑包括糖酵解、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）、線粒體生物發(fā)生和脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）［40］。目前，針對減少CAR-T細(xì)胞衰竭的代謝調(diào)節(jié)有很多新策略，例如Renauer等［41］用多組學(xué)方法鑒定了腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）和丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）作為人類原代T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶，研究表明ADA的過表達(dá)能夠改善不同供體來源的CD19特異性和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）特異性CAR-T細(xì)胞的功能，通過增強(qiáng)癌癥溶解、CAR-T細(xì)胞增殖、中樞記憶生成以及減少衰竭來評估。研究還顯示，ADA過表達(dá)在體內(nèi)實體瘤模型中顯著提高了HER2特異性CAR-T細(xì)胞的療效。Lontos等［42］的研究發(fā)現(xiàn)了一種抗抑制的工程版過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator 1 α，PGC-1α）可以代謝重編程人類CAR-T細(xì)胞，PGC-1α轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，這種方法有效地誘導(dǎo)了線粒體生物發(fā)生，但也上調(diào)了與效應(yīng)功能相關(guān)的程序；用這些細(xì)胞治療患有人類實體瘤的免疫缺陷動物，大大提高了體內(nèi)療效；該研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了代謝重編程在免疫調(diào)節(jié)治療中的作用，并強(qiáng)調(diào)了PGC-1α等基因作為有吸引力的候選基因，可與嵌合受體或TCR一起用于實體瘤的細(xì)胞治療。

2.8 增加記憶T細(xì)胞比例提高CAR-T細(xì)胞的持久性

T細(xì)胞有多種亞群，每個亞群都有不同的增殖潛能。初始T細(xì)胞（naive T cell，TN）、干細(xì)胞記憶T細(xì)胞（stem cell memory T cell，TSCM）和中樞記憶T細(xì)胞（central memory T cell，TCM）相較于效應(yīng)T細(xì)胞具有更高的增殖潛能，這些細(xì)胞比例的增加能夠提高CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性［43］。因此為了增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的持久性，研究者致力于提高記憶T細(xì)胞在CAR-T細(xì)胞中的比例。不同類型的細(xì)胞因子對免疫細(xì)胞有不同的激活作用，例如IL-2細(xì)胞因子傾向于激活CD8+ T細(xì)胞增殖產(chǎn)生效應(yīng)功能，而IL-21細(xì)胞因子則更傾向于激活具有中樞記憶表型的細(xì)胞，其在體內(nèi)的持久性更強(qiáng)，抗腫瘤活性更高，因此在設(shè)計和臨床應(yīng)用工程細(xì)胞因子時，需要考慮它們對免疫細(xì)胞激活的偏好，以確定不同工程細(xì)胞因子的具體應(yīng)用［44］。

TSCM樣特性對CAR-T細(xì)胞治療的成功至關(guān)重要，Kondo等［45］研究報道了NOTCH/OP9系統(tǒng)能有效地將傳統(tǒng)的人類CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為TSCM樣CAR-T細(xì)胞（CAR-iTSCM細(xì)胞），并且線粒體代謝重編程在這種轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，NOTCH信號在iTSCM形成過程中促進(jìn)線粒體生物發(fā)生和脂肪酸合成，這對iTSCM細(xì)胞的特性至關(guān)重要；叉頭框蛋白M1（Forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）被認(rèn)為是NOTCH的下游靶標(biāo)，負(fù)責(zé)這些代謝變化和隨后的iTSCM分化；與NOTCH誘導(dǎo)的CAR-iTSCM細(xì)胞一樣，F(xiàn)OXM1誘導(dǎo)的CAR-iTSCM細(xì)胞與常規(guī)CAR-T細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的抗腫瘤潛能，表明NOTCH或FOXM1驅(qū)動的CAR-iTSCM形成是改善癌癥免疫治療的有效策略。

3 結(jié)語與展望

本文探討了CAR-T細(xì)胞衰竭的可能機(jī)制，并概述了當(dāng)前抑制CAR-T細(xì)胞衰竭的主要策略。期待未來可以設(shè)計出能夠更有效地抵抗衰竭或靶向衰竭誘導(dǎo)因子的CAR-T細(xì)胞，以此提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤療效。在致力于延緩CAR-T細(xì)胞衰竭的同時，也需要關(guān)注CAR-T細(xì)胞療法可能產(chǎn)生的毒副作用，如細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性等，及時采取相應(yīng)措施預(yù)防及治療。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

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（責(zé)任編輯：鄭巧蘭）