朱 立, 葉 明, 劉 冬, 范治均, 楊招娣

(合肥工業(yè)大學 生物與食品工程學院,安徽 合肥 230009)

0 引 言

鏈霉菌是微生物中產(chǎn)抗生素最多的種屬,很早就被開發(fā)利用的有抗細菌、抗真菌和抗腫瘤活性的各種抗生素?？股卦谂R床上不但可以控制若干由病原細菌和真菌引起的疾病,作為治療惡性腫瘤的藥物[1],在防治農(nóng)作物的病、蟲、草害上抗生素也得以廣泛地應用[2]。由于野生菌株的生產(chǎn)能力很低,限制了它的發(fā)展和利用,目前提高抗生素效價及其生產(chǎn)能力的主要方法有:組合生物合成[3]、誘變育種獲得高產(chǎn)菌株[4]和優(yōu)化發(fā)酵條件等。

鏈霉菌YH-2是從采自全國8個不同省份28份不同環(huán)境的土壤樣品中分離出的一株具有較強抑菌活性的菌株,該菌株及其發(fā)酵液對細菌具有較強的抑制作用。本文研究通過對鏈霉菌YH-2進行紫外、微波和DES誘變及其培養(yǎng)條件優(yōu)化,以提高菌株抑菌活性,為鏈霉菌資源的開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

(1)菌株。鏈霉菌YH-2,合肥工業(yè)大學微生物資源與應用研究室分離保藏菌株。

(2)培養(yǎng)基。見參考文獻[5]。

1.2 方 法

(1)抗生素發(fā)酵。將鏈霉菌YH-2斜面孢子用無菌水洗下,搖勻,取0.2 mL孢子懸液均勻涂布于高氏一號固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)96 h。用直徑為2 mm打孔器接菌塊于種子培養(yǎng)基,28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)24 h,以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)144 h;將發(fā)酵液離心(5000 r/min,10 min),取上清液備用。

(2)抑菌活性的測定。以金黃色葡萄球菌為指示菌,采用管碟法測定抑菌活性,3個重復。

(3)誘變。制備108個/mL的單孢子菌懸液。

微波誘變[4]:選用微波頻率2 450 MHz,功率600 W。將10 mL菌懸液置于微波爐中,分別輻射 10 、20、30、40、50 、60 s,然后稀釋 104倍后涂平板,3個重復。

紫外誘變(UV)[4]:取10 mL孢子懸液于培養(yǎng)皿中,磁力攪拌,于25 W紫外線下30 cm處分別照射 10 、20 、30 、40、50、60、70、80 、90 s,然后紅光下稀釋104倍后涂平板,3個重復。

硫酸二乙酯誘變(DES)[6]:取10 mL孢子懸液至無菌三角瓶內(nèi),加2%硫酸二乙酯0.1 mL,分別振蕩處理30～70 min,然后稀釋104倍后涂平板,3個重復。

(4)培養(yǎng)條件的優(yōu)化。以碳源、氮源、發(fā)酵溫度、起始pH 和接種量為因素分別用A、B、C、D、E表示,選取L25(56)正交表進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

(5)效價測定。以金黃色葡萄球菌為試驗菌,青霉素鈉為標準品,采用二劑量法[7]測定發(fā)酵液效價。

(6)抑菌物質(zhì)的提取與鑒定[8]。取30 mL上清液,分別用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇(1∶1)、氯仿以1∶1的體積比萃取,萃取3次,合并萃取相。粗提物的鑒定采用普魯士藍法[9]。

(7)抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性測定[10]。熱穩(wěn)定性試驗分別取發(fā)酵液l0 mL于30～100℃恒溫水浴30 min,待自然冷卻后測定抑菌活性;酸堿穩(wěn)定性試驗分別取發(fā)酵液l0 mL調(diào)節(jié)pH 2～11,測定抑菌活性。

(8)最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測定。取直徑為15 mm試管11支,分別加入含質(zhì)量濃度為1 092、546、273、136.5、68.3、34.2、17.1、8.6、4.3、2.2 、0 μ g/mL 抗生素的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基2 mL,向每管加入106個/mL金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL,37℃培養(yǎng)24 h,無菌生長的藥物質(zhì)量濃度即為MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變菌株的篩選

鏈霉菌YH-2的3種誘變效應如圖1～圖3所示,菌株YH-2微波誘變 30 s其致死率達到93.8%,紫外誘變處理 80 s其致死率達到78.12%,DES處理60 min其致死率為77.5%。誘變處理后選擇不同誘變劑量下透明圈和菌落直徑比值最大的菌株進行發(fā)酵。

由圖1～圖3可以看出,不同誘變處理獲得的突變株其發(fā)酵液抑菌活性最強者分別出現(xiàn)在微波40 s處、紫外20 s處和DES 60 min處,其中紫外20 s處菌株發(fā)酵液的抑菌活性最高,其抑菌圈直徑為32.43 mm。其菌株編號為鏈霉菌YH-UV-2。

圖1 微波誘變效應曲線圖

圖2 紫外誘變效應曲線圖

圖3 DES誘變效應曲線圖

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

以菌株YH-UV-2為實驗對象,選取L25(56)正交表進行發(fā)酵條件的優(yōu)化,其試驗方案與結(jié)果見表1所列。

表1 正交試驗方案與結(jié)果

由表1極差R值可以判斷因素A為抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的主要影響因素,其他各因素對抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生影響程度順序如下:D＞E＞C＞B,可以確定最佳組合條件為A2C4D4E3B4,即2%葡萄糖,1%酵母膏,0.05%K2HPO4?3H2O,0.05%NaCl,0.05%MgSO4?7H2O,0.001%FeSO4?7H2O,32℃,pH 7.6,接種量為8%。由二劑量法測得標準曲線回歸方程為:

其中,Y為效價(104U/mL);X為抑菌圈直徑。測得其效價為61 703 U/mL,比原始菌株發(fā)酵液效價47 314 U/mL提高了30.41%。

2.3 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性

溫度對抑菌物質(zhì)活性的影響,如圖4所示,在30～100℃范圍內(nèi)菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性。pH對抑菌物質(zhì)活性的影響,如圖5所示,當pH≤8時,該抑菌物質(zhì)具有較好的抑菌作用,但pH＞8時無抑菌作用,表明該抑菌物質(zhì)在pH≤8時具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 溫度對抑菌物質(zhì)活性的影響

圖5 pH對抑菌物質(zhì)活性的影響

2.4 抑菌物質(zhì)的提取

由表2所列可知不同溶劑萃取相抑菌活性:氯仿-甲醇＞正丁醇＞乙酸乙酯＞氯仿,萃余相:氯仿＞氯仿-甲醇＞正丁醇＞乙酸乙酯,可能是各有機溶劑所萃取的成分不同導致,采用氯仿-甲醇進行提取,最終獲得紅褐色粗提物27.3 mg。根據(jù)普魯士藍顯色反應可知,該物質(zhì)為多酚類化合物,該化合物具有鄰位酚羥基結(jié)構。

表2 各有機溶劑提取液抑菌活性

2.5 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

由于不同質(zhì)量濃度的抑菌物質(zhì)對受試菌的抑制作用不同,在達到一定質(zhì)量濃度后才表現(xiàn)出抑制作用。結(jié)果表明,1～5管培養(yǎng)液澄清,無細菌生長,故選擇第 5管的質(zhì)量濃度68.3 μ g/mL為MIC。

3 結(jié)束語

目前,盡管利用基因工程的方法[11]在抗生素的菌種選育上有些成功的報道,但是經(jīng)典的誘變育種仍是主要的育種手段。本文采用微波、紫外、硫酸二乙酯3種誘變方式對菌株YH-2進行誘變選育,結(jié)果表明紫外誘變效果最佳。將獲得的高產(chǎn)突變菌株YH-UV-2經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵,其效價較原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了30.41%,說明培養(yǎng)基成分對抗生素的產(chǎn)量具有調(diào)控作用。

不吸水鏈霉菌黃山變種2-16[12]是近年來報道的發(fā)酵液效價較高的菌株,其效價為8 952 U/mL。本研究獲得鏈霉菌YH-UV-2菌株發(fā)酵液效價為61 703 U/mL,為其 6.89倍。因此,本研究誘變選育的YH-UV-2菌株具有較高的開發(fā)應用價值,有望成為抗生素的生產(chǎn)菌種。

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