摘要：水稻作為世界重要的糧食作物，極易受到低溫侵襲，并伴隨著水稻機體內(nèi)一系列復雜的代謝變化及分子水平調(diào)控，以適應(yīng)低溫逆境。為了明確寒地水稻孕穗期低溫脅迫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控通路及基因，采集龍粳11（LG11）在孕穗期低溫處理下0、2、4 d的幼穗，用于孕穗期低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)分析。結(jié)果共鑒定得到14 236個差異表達基因（DEG），其中，低溫處理前2 d共得到11 724個DEG，在低溫處理4 d后共識別了11 057個DEG。GO功能富集分析，LG11低溫處理共包含144個顯著富集的生物進程GO類別，其中富集DEGs數(shù)量最多的集中在光合作用、葉綠體重定位、紅外光應(yīng)答等光合作用相關(guān)類別。KEGG富集分析共顯著富集到37個KEGG通路，其中與光合作用相關(guān)的光合作用-天線蛋白等KEGG通路顯著富集下降，進一步明確龍粳11光合作用在孕穗期低溫下顯著受抑制。這些結(jié)果為后續(xù)水稻孕穗期低溫脅迫應(yīng)答中轉(zhuǎn)錄組水平上的分子調(diào)控提供了理論指導。

關(guān)鍵詞：水稻；孕穗期；低溫；轉(zhuǎn)錄組測序

中圖分類號：S511.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0193-07

收稿日期：2024-01-24

基金項目：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技基礎(chǔ)創(chuàng)新項目杰出青年項目（編號：CX23JQ02）；黑龍江省省屬科研業(yè)務(wù)費項目（編號：CZKYF2021-2-C002、CZKYF2021-2-C007）；黑龍江省博士后面上資助項目（編號：LBH-Z21027）；國家水稻產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項（編號：CARS-01）。

作者簡介：郭震華（1985—），男，內(nèi)蒙古集寧人，博士，副研究員，主要從事水稻分子育種研究，E-mail：hljsdsgzh@163.com；共同第一作者：蔡麗君（1988—），女，云南昆明人，博士，助理研究員，主要從事作物高產(chǎn)研究，E-mail：lijun_cai@yeah.net。

通信作者：馬文東，碩士，研究員，主要從事水稻育種研究。E-mail：wendongma@163.com。

作為世界上重要的糧食作物之一，水稻養(yǎng)活了全球近半數(shù)人口［1］。水稻源自亞熱帶或熱帶地區(qū)，易受低溫冷害侵襲。目前每年約 1 500萬hm2 水稻受低溫威脅［2］。而伴隨著長時間的自然進化和人為馴化，水稻逐漸形成了對低溫逆境適應(yīng)和抵御的復雜調(diào)控機制［3］。當遭遇低溫冷害時，水稻體內(nèi)通過改變細胞膜結(jié)構(gòu)、調(diào)整物質(zhì)轉(zhuǎn)運代謝、加速保護性物質(zhì)及活性氧（ROS）的清除等一系列復雜的代謝變化，適應(yīng)低溫逆境［4-6］。伴隨著各種生理變化的同時，水稻體內(nèi)相關(guān)耐冷調(diào)節(jié)基因的表達也會相應(yīng)改變，其中涉及到眾多復雜的信號傳遞轉(zhuǎn)導途徑，最終形成了水稻體內(nèi)耐冷分子調(diào)控機制的重要組成部分。

眾多研究表明，水稻耐冷性是一個復雜的數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控［7-8］，目前與水稻耐冷相關(guān)基因已有超過70個被報道（www.ricedata.cn），且多為轉(zhuǎn)錄因子（TF）。OsWRKY71在遭受低溫脅迫時顯著上調(diào)，過表達該基因可顯著提高幼苗的存活率及光合能力等，表明該基因在水稻低溫脅迫應(yīng)答中發(fā)揮了積極的作用［9］。OsWRKY76作為另一個WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子，其過表達會顯著降低水稻對稻瘟病的抗性，但提高了低溫抗性［10］。有報道稱，作為OsWRKY63的直接靶基因，OsWRKY76通過與OsbHLH148間產(chǎn)生互作，共同誘導OsDREB1B的表達，進而增強了水稻的低溫抗性［11］。

近年來，伴隨著第二代高通量測序技術(shù)的不斷更新進步，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已在各類植物的低溫脅迫應(yīng)答研究中得到了成功的應(yīng)用，尤其是在水稻、大豆、玉米等多種作物中，在低溫抗性機制及基因表達調(diào)控中起到了重要的作用［12-16］。白李唯丹等通過對東鄉(xiāng)野生稻苗期低溫下的轉(zhuǎn)錄組測序分析，共檢測到10 200個差異表達基因，其中37個基因是耐冷調(diào)控相關(guān)的家族基因［17］。高紅秀等以水稻中花11為研究材料，經(jīng)低溫處理后，通過RNA-Seq技術(shù)分析植物激素調(diào)控水稻幼苗對低溫脅迫的應(yīng)答模式，其中植物激素信號轉(zhuǎn)導中低溫應(yīng)答的差異表達基因有31個，分別有25個上調(diào)表達基因和6個下調(diào)表達基因；主要參與了茉莉酸和脫落酸信號途徑［18］。

黑龍江省作為我國粳稻種植面積最大的省份，地處我國最北部，低溫冷害頻發(fā)，冷害是黑龍江省水稻安全生產(chǎn)的重要限制因子之一。為了深入了解當?shù)厮酒贩N的孕穗期低溫應(yīng)答機制，并進一步發(fā)掘孕穗期低溫應(yīng)答關(guān)鍵代謝調(diào)控通路及相關(guān)基因，本研究以黑龍江省水稻品種龍粳11（LG11）為研究材料，借助美國Illumina公司的HiSeq 2500平臺，對孕穗期低溫處理后的水稻幼穗開展轉(zhuǎn)錄組差異分析，在DEG分析的基礎(chǔ)上，繼續(xù)進行GO和KEGG富集分析，進一步揭示水稻對孕穗期低溫應(yīng)答響應(yīng)機制，并結(jié)合熒光定量PCR篩選驗證耐冷候選基因，以期為后續(xù)水稻孕穗期耐冷分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選取由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所育成的水稻品種龍粳11（LG11）作為研究材料。該品種曾為黑龍江省第三積溫帶的主栽品種，具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等眾多優(yōu)良性狀，但對溫度十分敏感，低溫造成嚴重的空殼。

1.2 材料種植及低溫處理

本研究采用盆栽試驗，試驗在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所田間試驗場（130°52′E，46°87′N）進行。挑選健康飽滿的LG11稻粒，置于1% NaClO溶液15 min，蒸餾水連續(xù)沖洗2～3次。將消毒過的稻粒移入培養(yǎng)箱催芽，溫度為30 ℃。試驗材料于2018年4月20日播種。待幼苗長至3葉1心期移栽至盆栽桶中，盆栽桶直徑34 cm，高35 cm。盆栽土壤pH值為6.56，有機質(zhì)含量為36.56 g/kg，速效氮、速效磷及速效鉀含量分別為106.65、85.58、93.8 mg/kg。每盆栽桶環(huán)形均勻種植LG11幼苗15株，為保證供試材料處于同一生長時期，盆栽桶中所有材料去除分蘗，只留主莖，共種植36盆。當LG11的劍葉葉枕距離倒二葉的葉枕在-4～0 cm時，即認為其進入孕穗期［19］，并對該單株進行掛牌標記。對進入到孕穗期的LG11，取18盆轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱（HPG-280，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）培養(yǎng)，生長條件設(shè)置為溫度12 ℃，光照—黑暗周期為8 h—16 h，相對濕度為80%；其余生長條件與處理組一致。當處理4 d后，返回到正常環(huán)境生長直到成熟。孕穗期低溫抗性通過幼穗結(jié)實率判定。水肥管理同黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所田間常規(guī)管理。

1.3 樣品采集

在12 ℃下處理0、2、4 d后，分別從LG11幼穗的上1/3 部分取下和收集長度在3.5～4.5 mm的新鮮穎花約0.5 g，立即用液氮冷凍，并儲存在 -80 ℃ 的超低溫冰箱中，每個處理重復3次。

1.4 RNA測序

將低溫保存樣品通過干冰包裹送至北京百邁客生物科技有限公司，委托其進行RNA抽提、質(zhì)控及建庫。利用 Nanodrop 8000 分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）測定RNA的純度和濃度，并用RNA 6000 Nano LabChip（美國安捷倫科技公司）檢測RNA的完整性和濃度。通過Illumina HiSeq 2500平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq），產(chǎn)生雙末端（2×150 bp）reads。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控

將LG11原始的下機數(shù)據(jù)以FASTQ文件格式進行儲存。進一步過濾含有接頭序列和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上通過對高質(zhì)量LG11文庫序列的GC含量、Q20和Q30等進行計算，進一步獲得高質(zhì)量序列（clean data）用于后續(xù)分析。本研究參考基因組為Oryza sativa L. ssp. Japonica （Oryza_sativa_IRGSP-1.0），利用HISAT2 v2.1.0軟件將clean data比對到參考基因組上，通過FPKM值判定轉(zhuǎn)錄本數(shù)或基因表達水平。

1.6 差異表達基因篩選

利用DEGseq2軟件進行差異基因分析，顯著差異的閾值為|log2 Fold Change |≥1，Plt;0.05［20］。其中Fold Change（FC）代表基因表達量變化倍數(shù)，|FC|≥2 表示該基因在2個比較組之間存在顯著差異，P是基因差異表達概率，Plt;0.05，即表示該基因是差異表達基因。

1.7 差異表達基因功能富集分析

基因本體 （GO，http：//www.geneontology. org/page/download-go-annotatios）和KEGG（京都基因與基因組百科全書，http：//www.genome.jp/kegg）分別用于GO和KEGG功能注釋。用Goseq進行GO富集分析，閾值為校正P值＜0.01。用KOBAS（v2.0）進行KEGG富集分析，富集因子越大，Q值＜0.01，對應(yīng)通路的富集程度越高。

1.8 qRT-PCR驗證分析

為了驗證RNA-Seq結(jié)果的準確性，選取測序結(jié)果中差異表達倍數(shù)較高的6個基因，開展qRT-PCR驗證分析。使用Trizol試劑提取LG11的12 ℃低溫處理0、2、4 d后的幼穗穎花的總RNA。進一步根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將樣品ＲNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計qRT-PCR引物，并通過英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司引物合成，內(nèi)參為Actin1。qRT-PCR反應(yīng)在SYBR Select Master Mix儀器上運行，供試樣本中每個基因均分別設(shè)3次生物學和3次技術(shù)重復，通過2-ΔΔCT法計算基因相對表達量變化。

1.9 數(shù)據(jù)處理

WPS office用于數(shù)據(jù)分析；SPSS 22.0軟件用于顯著性檢驗（α=0.05）；GraphPad Prism 9.0用于作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕穗期低溫處理不同時間段LG11的結(jié)實率

孕穗期低溫對水稻最直接的影響體現(xiàn)在結(jié)實率的變化上。本研究對LG11在12 ℃低溫處理下0、2、4 d后的結(jié)實率進行了調(diào)查分析，結(jié)果如圖1所示。在正常生長條件下（處理0 d），LG11的結(jié)實率為92.36%，該結(jié)果與之前報道結(jié)果［21］較為一致，表明LG11在正常溫度環(huán)境中可正常結(jié)實。當?shù)蜏靥幚? d后，LG11的結(jié)實率迅速降低至39.26%，極顯著低于對照。而當?shù)蜏乩^續(xù)，至處理4 d后，LG11的結(jié)實率較對照仍呈現(xiàn)極顯著下降趨勢，僅為8.14%，幾乎不結(jié)實。因此，孕穗期低溫導致LG11的結(jié)實率極顯著降低，表明LG11的孕穗期耐冷性弱。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果質(zhì)控分析

由表1可知，本研究通過對LG11在低溫處理0、2、4 d后的穎花進行RNA-Seq分析，構(gòu)建了9個文庫，通過篩選掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)，共得到540.27 Mb的clean reads，其中GC含量在53.40%～56.58%之間，Q30均≥91.10%，比對到參考基因組的片段在34 915 829～60 514 688 bp之間，比對到參考基因組上的比例在79.55%～82.84%之間。以上結(jié)果表明，LG11的RNA-Seq的測序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

2.3 低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組差異表達基因分析

以|log2 FC|≥1、Plt;0.05為閾值，分別對12 ℃低溫處理2、4 d的LG11進行DEG的篩選。由圖 2-a 可知，低溫脅迫下，將LG11不同處理時間下的DEG通過維恩圖分析，共得到14 236個DEG，其中，低溫處理前2 d共得到11 724個DEG，包含了 6 017 個上調(diào)及5 707個下調(diào)表達基因；而在低溫處理4 d后，LG11中共識別了11 057個DEG，包含了6 090個上調(diào)及4 967個下調(diào)表達的DEG。進一步的維恩圖分析結(jié)果（圖2-b）表明，LG11中分別有4 287個下調(diào)和4 195上調(diào)的DEG是低溫處理2、4 d 后共有的，分別占全部DEG的30.1%和29.5%；分別有1 812個和1 842個DEG是在低溫處理2、4 d后特異上調(diào)表達；另有1 367個和670個DEG是在低溫處理2、4 d后特異下調(diào)表達?？梢姡琇G11在12 ℃低溫脅迫2、4 d后，多數(shù)基因均呈現(xiàn)差異表達，表明LG11對低溫敏感，基因受低溫脅迫持續(xù)應(yīng)答。

2.4 DEG的GO功能富集分析

本研究以KS（Kolmogorov-Smirnov）lt;0.001為篩選閾值，對維恩圖中（圖2-b）各部分DEG進行GO功能富集分析，重點對生物功能類別（BP）展開分析。首先對上調(diào)基因展開分析（圖3-a、圖3-b），LG11低溫處理2、4 d后共得到54個生物進程GO類別。 其中， 37個生物進程GO類別是在低溫

處理2、4 d時在LG11中共同富集到的（2-4共同上調(diào)），分別有18個和7個生物進程GO類別是在低溫處理2 d（LG11-0-2-特異上調(diào)）和4 d（LG11-0-4-特異上調(diào)）時特異富集得到的，而僅有1個生物進程GO類別細胞對饑餓應(yīng)答在低溫處理2 d時上調(diào)而在處理4 d后下調(diào)。54個上調(diào)的生

物進程GO類別中，低溫處理2、4 d時在LG11中共同富集到（2-4共同上調(diào)）的細胞過程的調(diào)節(jié)GO類別包含的基因最多（545個DEG），之后依次是DNA模板轉(zhuǎn)錄的調(diào)控（300個DEG；2-4共同上調(diào)）、蛋白磷酸化（272個DEG；2-4共同上調(diào)）。在下調(diào)基因中，維恩圖各部分DEG同樣以KSlt;0.001為閾值共顯著富集到90個生物進程GO類別（圖3-c、圖3-d）。同樣的，低溫處理2、4 d時LG11中共同富集（2-4共同下調(diào)）到的生物進程GO類別最多，為74個。其中單一有機體過程包含基因數(shù)最多（1 738個DEG），然后依次是光合作用、質(zhì)體組織、ncRNA代謝進程等，分別含有233、220、178個DEG。

2.5 DEG的KEGG功能富集分析

在對DEG進行GO功能富集分析的同時，進一步對其進行KEGG的富集分析，用于發(fā)掘DEG參與的主要代謝調(diào)控及基因轉(zhuǎn)導途徑，并對關(guān)鍵基因功能及遺傳調(diào)控進行深入分析。以q值lt;0.001為篩選閾值，維恩圖各部分DEG分別進行KEGG富集分析，共得到37個顯著富集的KEGG通路（圖4）。維恩圖各部分DEG顯著富集最多的KEGG通路是在低溫處理2、4 d后LG11中共同下調(diào)的DEG部分（2-4 共同下調(diào)），共富集到19個KEGG通路中。在低溫處理2、4 d后LG11中共同下調(diào)的DEG（2-4共同下調(diào)）中顯著富集的碳代謝KEGG通路，含有的差異基因最多，為71個，之后依次是低溫處理2、4 d后LG11中共同下調(diào)的DEG（2-4共同下調(diào)）顯著富集的氨基酸生物合成KEGG通路（52個DEG），在低溫處理2、4 d后LG11中共同上調(diào)的DEG中（2-4共同上調(diào)）顯著富集到的植物激素信號轉(zhuǎn)導通路（42個DEG），低溫處理2、4 d后共同下調(diào)的DEG（2-4共同下調(diào)）中顯著富集到的光合有機物的碳固定通路（40個DEG）及光合作用（36個DEG）。而在低溫處理2 d后特異上調(diào)的DEG中，酮體的合成和降解通路含有的DEG最少，僅為3個，之后依次是在低溫處理4 d后特異上調(diào)的DEG中，黃酮和黃酮醇生物合成（4個DEG）及角質(zhì)、木質(zhì)及蠟質(zhì)生物合成（5個DEG）KEGG通路。

2.6 DEG的qRT-PCR驗證分析

基于LG11在低溫脅迫下基因的表達模式變化，從測序結(jié)果中隨機選擇6個DEG進行qRT-PCR分析，用于驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，引物序列見表2。由圖5可以看出，6個基因的表達模式變化均與轉(zhuǎn)錄組測序中各基因的結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性及可靠性。

3 討論與結(jié)論

作為我國北方第一水稻大省，黑龍江也是我國重要的水稻商品糧基地（水稻產(chǎn)量的70%作為商品）。然而，由于黑龍江位于我國最北部地區(qū)，低溫尤其是在孕穗期低溫嚴重制約了水稻的安全生產(chǎn)。LG11處黑龍江省第三積溫帶，具有良好的農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀，但孕穗期耐冷性極差［22］。因此，本研究以LG11為研究對象，通過對其進行孕穗期低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序研究，以進一步全面的研究寒地水稻孕穗期低溫脅迫下的代謝調(diào)節(jié)及應(yīng)答機制。本研究中LG11低溫處理前2 d和前4 d分別得到 11 724 和11 057個DEG，表明LG11中眾多基因在不同低溫處理時間段都呈現(xiàn)出高度差異表達，說明LG11低溫敏感，持續(xù)受低溫脅迫，此項結(jié)果也同樣與本研究中的LG11的低溫結(jié)實率結(jié)果呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)，再次印證了LG11的孕穗期低溫高度敏感性。

通過對DEG進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，在維恩圖各部分中共得到144個顯著富集的生物進程GO類別，其中下調(diào)GO類別為90個，明顯多于上調(diào)的GO類別（54個），再次表明LG11受低溫影響更加強烈。而這些下調(diào)GO類別中，富集基因數(shù)最多的多與光合作用相關(guān)，如光合作用（GO：0015979）、葉綠體重新定位（GO：0009902）、紅光應(yīng)答（GO：0010114）及遠紅光應(yīng)答（GO：0010218）等。此外，KEGG通路富集分析共得到37個顯著富集到的KEGG通路。其中下降KEGG通路為19條。而這其中與光合作用相關(guān)的光合作用（ko00195）及光合作用-天線蛋白（ko00196）同樣顯著富集下降。因此，結(jié)合GO功能富集及KEGG通路顯著富集分析，進一步明確LG11孕穗期低溫下光合作用受到明顯抑制。

光合作用是通過吸收光能轉(zhuǎn)化為植物體的化學能，是植物體內(nèi)有機物合成的起點。眾多報道稱，植物光合作用顯著受到低溫抑制［23-24］。低溫脅迫下，葉綠體的亞顯微結(jié)構(gòu)遭到破壞，阻礙其電子傳遞，導致光合作用受到抑制，進而降低光合速率［25］。低溫脅迫不僅影響了類囊體膜介導的光反

應(yīng)，抑制類囊體膜上PSⅡ光能的傳遞及轉(zhuǎn)換效率，減弱了CO2的同化能力，還會降低葉綠體基質(zhì)中光合作用暗反應(yīng)的活性［26-27］。對相關(guān)GO類別和KEGG通路所包含基因研究發(fā)現(xiàn)，低溫對光合作用涉及到多個方面的調(diào)控，如Os10g0496900（OsPORB，原葉綠素酸酯氧化還原酶B）、Os09g0346500（OsCAB1R，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因）、Os03g0563300（OsCHLI，鎂離子螯合酶I亞基編碼基因）［28-30］等。作為C3碳反應(yīng)中重要的羧化酶，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶的亞基編碼基因OsRBCS2、OsRBCS3、OsRBCS4及OsRBCS5等均在LG11中下調(diào)表達。以上結(jié)果再一次表明，孕穗期低溫對LG11的光合作用相關(guān)功能形成嚴重的抑制。

進一步通過對GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，LG11的維恩圖中各部分DEG中顯著富集到的生物進程的GO類別中，低溫應(yīng)答（GO：0009409）類別富集到的次數(shù)最多，表明孕穗期低溫脅迫嚴重影響了寒地水稻正常生長發(fā)育。對此GO類別中的DEG進一步研究發(fā)現(xiàn)， 孕穗期低溫脅迫下， OsMAP1、OsMPK2、OsMPK6等絲裂原活化蛋白激酶的編碼基因均在LG11中下調(diào)表達。而絲裂原活化蛋白激酶在平衡低溫等非生物脅迫產(chǎn)生過多積累的活性氧起到重要的調(diào)控作用，因此在寒地水稻孕穗期低溫應(yīng)答中，絲裂原活化蛋白激酶的相關(guān)編碼基因起到正向調(diào)控的作用，需進一步研究。

通過qRT-PCR分析驗證了一些DEG的表達模式或水平，初步證實這些基因在水稻在低溫應(yīng)答中發(fā)揮了積極作用，可以作為調(diào)控低溫抗性的候選基因。然而，為了解這些基因如何對低溫應(yīng)答作出貢獻，并識別真正的低溫應(yīng)答基因，須要對這些基因進行進一步的驗證和功能分析。

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