摘要：為明確梔子TCP基因家族及鹽脅迫響應(yīng)，利用生物信息學(xué)手段對梔子TCP基因家族進(jìn)行鑒定、分析和鹽脅迫表達(dá)試驗(yàn)分析。結(jié)果表明，在梔子中共鑒定出16個(gè)TCP基因，分為PCF、CYC和CIN共3個(gè)亞家族。保守基序、基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)表明，同亞家族基因保守基序相似，不同亞家族的基因保守基序差異較大，16個(gè)梔子TCP基因均為親水蛋白。染色體定位表明，16個(gè)梔子TCP基因不均勻地分布在8條染色體上，且包含多個(gè)片斷段復(fù)制事件。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，梔子TCP基因中含有多種與植物生長發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)及激素調(diào)節(jié)相關(guān)的作用元件，以脅迫響應(yīng)元件MYB和MYc最多；鹽脅迫表達(dá)量顯示，梔子TCP基因均能響應(yīng)鹽脅迫，部分基因在重度鹽脅迫特異性表達(dá)，推測GjTCP13、GjTCP12和GjTCP6可能為梔子耐鹽調(diào)控的關(guān)鍵基因。綜上所述，梔子TCP基因家族成員能夠積極響應(yīng)鹽脅迫，增強(qiáng)梔子的耐鹽抗性。

關(guān)鍵詞：TCP基因家族；梔子；生物信息學(xué)；鹽脅迫

中圖分類號：S188；S685.990.1" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0126-07

收稿日期：2024-03-18

基金項(xiàng)目：福建省林業(yè)科技推廣項(xiàng)目（編號：2022TG09、閩［2024］TG22號）；福建省科技廳高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目（編號：2022N5009）。

作者簡介：林宇清 （1999—），男，江西贛州人，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培與利用研究。E-mail：2397193102@qq.com。

通信作者：鄒雙全，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事森林培育、觀賞藥用植物研究。E-mail：zou@fafu.edu.cn。

梔子（Gardenia jasminoides）是優(yōu)質(zhì)茜草科灌木，耐陰和抗毒性強(qiáng)，是綠化和美化環(huán)境的優(yōu)質(zhì)園林樹種，果實(shí)為傳統(tǒng)藥材，富含天然梔子黃色素，是國際上流行的天然色素和食品添加劑［1］。梔子耐干旱、耐瘠薄，適應(yīng)力強(qiáng)，廣泛分布于我國大部分地區(qū)。研究表明，梔子對旱澇脅迫具有不同程度的適應(yīng)性，是優(yōu)良的園林植物材料［2］。筆者所在課題組在泉州濱海森林公園發(fā)現(xiàn)，梔子能在近海鹽堿地正常生長，但對其鹽脅迫響應(yīng)分子機(jī)制尚不清楚。

植物特異性TCP基因家族是一組編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因，在植物發(fā)育過程中起著核心作用［3］。TCP的命名源自TB1基因、CYC基因、PCF1和PCF2基因，該類基因編碼產(chǎn)物的N端均有1個(gè)55～59個(gè)氨基酸且高度保守的結(jié)構(gòu)域，并形成1個(gè)非典型的螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)（bHLH），其中2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)均由保守的親水氨基酸構(gòu)成［4-5］。因此，基于TCP基因家族結(jié)構(gòu)域同源性分析，可將TCP基因家族分為ClassⅠ（或者TCP-P）和ClassⅡ（或者TCP-C）2個(gè)類群［3］。ClassⅠ類又名PCF亞家族，ClassⅡ則進(jìn)一步劃分為CIN和CYC/TB1這2個(gè)亞家族［6］。目前，TCP基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、茄子（Solanum melongena）、穿心蓮（Andrographis paniculata）和苦蕎（Fagopyrum tataricum）等物種完成了鑒定［7-10］。已有研究表明，AtTCP15能參與葉片發(fā)育和節(jié)間長度的調(diào)控，AtTCP20參與茉莉酸（JA）代謝，AtTCP21、AtTCP22和AtTCP23調(diào)控植株生長［11-13］。西瓜（Citrullus lanatus）ClTCP14a和ClTCP15參與株高調(diào)控［14］。毛竹（Phyllostachys heterocycla）中PeTCP10可以通過MeJA途徑負(fù)調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育［15］。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)，TCP轉(zhuǎn)錄因子能夠提高植物多種生物脅迫和非生物脅迫的抗性。例如，在茄子中，ClassⅠ類TCP成員在熱脅迫下存在明顯上調(diào)響應(yīng)［8］。在穿心蓮中，結(jié)合逆境脅迫表達(dá)模式和 qRT-PCR 驗(yàn)證，預(yù)測到ApTCP4、ApTCP5、ApTCP6和ApTCP11可能參與響應(yīng)干旱、高溫和茉莉酸甲酯（MeJA）等多種非生物脅迫［9］。在苦蕎中，qRT-PCR驗(yàn)證表明，F(xiàn)tTCP3在應(yīng)對干旱和鹽脅迫時(shí)起正向調(diào)控作用［10］。以上研究表明，TCP轉(zhuǎn)錄因子能廣泛參與植物生長及非生物脅迫過程，然而在梔子中關(guān)于TCP基因家族及鹽脅迫研究還未有報(bào)道。因此，通過研究梔子全基因組鑒定分析TCP基因家族成員，探究其分子抗逆機(jī)制，對濱海梔子鹽堿品種培育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中搜索獲得梔子全基因組數(shù)據(jù)。從Ensembl plants（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載擬南芥和水稻的基因文件和GFF注釋文件。

1.2 梔子TCP基因家族的鑒定

通過Pfam（http：//pfam.xfam.org/）在線軟件下載TCP基因隱馬爾可夫模型Pfam（PF03634）。以擬南芥TCP基因家族的氨基酸序列作為對照，進(jìn)行本地BLAST，并按照閾值E-value≤1×10-5將可信度較高的梔子TCP基因初步篩選出來。再通過NCBI中的CDD（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）驗(yàn)證特征性蛋白結(jié)構(gòu)域，剔除不含特征性結(jié)構(gòu)域的基因。

1.3 梔子TCP基因染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

利用TBtools軟件對梔子TCP基因的染色體進(jìn)行定位，并通過TBtools軟件中Gene Location Visualize from GTF/GFF將可視化后再進(jìn)一步分析。

1.4 梔子TCP蛋白保守基序分析

通過網(wǎng)站MEME（https：//meme-suit.org/tools/meme）對梔子TCP基因進(jìn)行保守基序鑒定，（參數(shù)設(shè)置：任意重復(fù)次序，最大基數(shù)為10），并通過TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

1.5 梔子TCP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

選擇擬南芥、水稻和梔子TCP蛋白通過MAGE-X進(jìn)行氨基酸序列比對，采用N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹。并用在線軟件itol（https：//itol.embl.de）和Adobe Illustrator 軟件進(jìn)行美化。根據(jù)擬南芥已有分組對梔子TCP基因家族進(jìn)行聚類分析。

1.6 梔子TCP基因鹽脅迫表達(dá)特征

2021年8月7日選擇生長一致的1年生梔子扦插苗，置于福建農(nóng)林大學(xué)溫室大棚進(jìn)行鹽脅迫處理。脅迫試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)梯度（CK、LS、MS和SS），每個(gè)鹽濃度處理6盆，重復(fù)3次，共72盆。CK、LS、MS、SS 處理分別用0、50、100、200 mmol/L NaCl每天定時(shí)澆灌1次，每次每盆澆50 mL，共脅迫15 d。在脅迫結(jié)束后取功能正常無病害葉片，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，用于測定不同鹽濃度下梔子TCP基因家族成員表達(dá)量，通過TBtools軟件繪制表達(dá)量熱圖。

1.7 梔子TCP基因順式作用元件分析

用TBtools軟件提取梔子TCP基因的上游序列（2 000 bp）作為啟動子序列，并通過在線網(wǎng)站Plant CARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）預(yù)測各成員的啟動子數(shù)量，并通過TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 梔子TCP家族鑒定分析

對梔子TCP家族理化性質(zhì)分析表明，梔子氨基酸數(shù)量在183（GjTCP6）～472（GjTCP1）之間，分子質(zhì)量在19 819.43 u（GjTCP6）～52 523.41 u（GjTCP1）之間。梔子TCP基因平均疏水性均小于0，表明16個(gè)基因均為親水蛋白基因。其中，GjTCP1的氨基酸數(shù)量最多，為472個(gè)，分子質(zhì)量也最高，達(dá)到了 52 523.41。在亞細(xì)胞定位中，所有基因都位于細(xì)胞核中，這符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)可為研究其功能及二級結(jié)構(gòu)之間的相互作用模式提供理論基礎(chǔ)。梔子TCP二級蛋白結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，除GjTCP1、GjTCP2和GjTCP5這3個(gè)基因的α螺旋＜延伸鏈，其余蛋白均為無規(guī)則卷曲＞α螺旋＞延伸鏈＞β轉(zhuǎn)角（表1）。

2.2 梔子TCP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為研究梔子和模式植物擬南芥和水稻之間TCP基因家族的進(jìn)化關(guān)系，用MAGE X將擬南芥、水稻和梔子3個(gè)物種TCP家族成員序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。根據(jù)模式植物擬南芥TCP基因家族的分類方法，將梔子的16個(gè)序列分為3個(gè)亞家族，其中PCF亞家族有11個(gè)成員，分別是GjTCP8、GjTCP15、GjTCP13、GjTCP13、GjTCP2、GjTCP6、GjTCP9、GjTCP11、GjTCP5、GjTCP14、GjTCP16和GjTCP3；CIN亞家族有個(gè)3成員，分別是GjTCP1、GjTCP4和GjTCP7；CYC亞家族有2個(gè)成員，分別是GjTCP10和GjTCP12。

2.3 梔子TCP染色體定位

梔子16個(gè)TCP基因不均勻分布于8條染色體上。Chr9染色體中有9條基因，占總數(shù)的56.25%。剩余的7條染色體上都只各自分布1個(gè)基因，而染色體Chr3、Chr4和Chr5上則不含TCP基因成員（圖2）。

促進(jìn)基因家族進(jìn)化的主要原因是基因的串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制。為了解梔子TCP基因家族的擴(kuò)增機(jī)制，對梔子基因組復(fù)制事件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，16個(gè)梔子TCP基因家族成員中有9個(gè)基因（GjTCP16/GjTCP3、GjTCP4/GjTCP7、GjTCP6/GjTCP8、GjTCP7/GjTCP1和GjTCP9/GjTCP11）參與了5次片段復(fù)制事件。

2.4 梔子TCP基因家族結(jié)構(gòu)分析

梔子TCP基因的保守基序，保守蛋白結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)如圖3所示。所有基因都包含TCP domain或TCP superfamily。梔子16個(gè)TCP基因共鑒定到10個(gè)保守基序。所有梔子TCP基因都含有motif1，GjTCP14、GjTCP15和GjTCP8以外的基因都含有motif2。GjTCP5和GjTCP1含有最多的motif，有6個(gè)，GjTCP8含有最少的motif，僅為1個(gè)。僅GjTCP1、GjTCP4和GjTCP7同時(shí)含有motif1、motif2、motif3和motif9，且它們同屬CIN亞家族，說明這些基因可能具有相似的功能。梔子TCP基因結(jié)構(gòu)相對簡單，所有基因均有CDS（與蛋白序列一一對應(yīng)的DNA序列），均在1～3個(gè)之間。

2.5 梔子TCP家族啟動子順式作用元件

為確定梔子TCP基因潛在的生物學(xué)作用，對梔子16個(gè)TCP基因進(jìn)行2 000 bp啟動子順式元件分析。結(jié)果（圖4）顯示，梔子TCP基因包含了大量激素響應(yīng)、光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件。激素類響應(yīng)元件中，發(fā)現(xiàn)了ABRE、P-box和AuxRR-core等反應(yīng)元件，以ABRE元件最多；光響應(yīng)元件中，發(fā)現(xiàn)了Box4、G-Box和I-Box等響應(yīng)元件，以G-box和Box4元件數(shù)量最多；脅迫響應(yīng)元件中，發(fā)現(xiàn)了LTR、MBS和ARE等響應(yīng)元件，以MYB和Myc響應(yīng)元件最多。綜上所述，推測TCP基因家族成員在植物激素響應(yīng)、光響應(yīng)和逆境脅迫中均發(fā)揮重要作用。

2.6 梔子TCP基因表達(dá)模式分析

將梔子鹽脅迫下表達(dá)量繪制成熱圖（圖5）。結(jié)果顯示，GjTCP8、GjTCP7、GjTCP9、GjTCP15、GjTCP2、GjTCP14、GjTCP16和GjTCP11在輕度或中度鹽脅迫表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；GjTCP3和GjTCP10在輕度鹽脅迫下表達(dá)量減少，在中度鹽脅迫下增加，呈現(xiàn)先減后增的趨勢；GjTCP4隨著鹽脅迫程度加深其表達(dá)量遞減。此外，GjTCP6、GjTCP12和GjTCP13在重度鹽脅迫下表達(dá)量增加，分別為對照組的1.32倍、4.03倍和1.21倍。

3 討論

TCP基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長、發(fā)育和脅迫響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［16］。因此，研究TCP基因家族對梔子非生物脅迫調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究在梔子基因組中共鑒定出16個(gè)TCP基因成員，比水稻（27個(gè)）、擬南芥（23個(gè)）、茄子（32個(gè)）和苦蕎（28個(gè)）、牡丹（18個(gè)）數(shù)量更少，比莧菜（14個(gè)）數(shù)量更多，這說明植物TCP基因家族成員數(shù)量在不同物種間存在差異［7-8，10，17-18］。

TCP基因家族可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大類，其中ClassⅡ又分CYC和TB1這2個(gè)分支［3］。梔子TCP基因家族成員也分為CIN、PCF和CYC這3個(gè)亞家族。其中CIN亞家族包含梔子TCP基因家族成員3個(gè)，PCF亞家族包含11個(gè)，CYC亞家族包含2個(gè)。16個(gè)成員均為親水蛋白，且都位于細(xì)胞核中，這與莧菜和穿心蓮TCP基因家族的報(bào)道［9，18］一致。保守基序基因結(jié)構(gòu)分析顯示，16個(gè)梔子TCP基因均含有motif1，說明motif1在梔子TCP進(jìn)化過程中高度保守。同亞家族的基因保守基序相似，而不同亞家族的基因保守基序有差異。在GjTCP1、GjTCP4和GjTCP7中發(fā)現(xiàn)共同含有motif1、 motif2、 motif3和motif9，均屬于CIN亞家族，這說明這3個(gè)基因可能具有相似的功能。染色體定位發(fā)現(xiàn)，梔子TCP基因成員不均勻分布在8條染色體上，梔子TCP基因家族中不存在串聯(lián)重復(fù)事件，說明梔子主要由片段復(fù)制事件為TCP家族提供進(jìn)化動力。

TCP轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中具有重要調(diào)控作用［19-21］。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，梔子TCP基因成員包含ABRE、LTR和MBS等多個(gè)與非生物脅迫應(yīng)答元件，其中MYB和MYc最多，說明這些基因可能參與響應(yīng)高鹽或低溫脅迫過程。結(jié)合鹽脅迫下基因表達(dá)模式，多數(shù)TCP基因在輕度及中度鹽脅迫下響應(yīng)表達(dá)，在重度鹽脅迫下被抑制，部分TCP基因在重度鹽脅迫下高表達(dá)，這說明梔子TCP轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫中具有重要調(diào)控作用。已研究表明，水曲柳中FmTCP4基因?qū)洹Ⅺ}、旱等非生物脅迫響應(yīng)，說明其參與了水曲柳的生長發(fā)育和逆境平衡；沙棘TCP轉(zhuǎn)錄因子同樣也受到干旱、高鹽和激素誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控沙棘對干旱脅迫的響應(yīng)；馬鈴薯TCP基因在鹽和甘露醇脅迫下表達(dá)量下調(diào)［22-24］。本研究中，GjTCP4隨著鹽脅迫程度加深其表達(dá)量遞減。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，OsTCP1與GjTCP4為同源基因，OsTCP1在水稻中對干旱和鹽脅迫中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的響應(yīng)，推測GjTCP4在鹽脅迫中也具有重要調(diào)控作用［25］。此外，GjTCP13、GjTCP12和GjTCP6在重度脅迫下表達(dá)量上調(diào)顯著，推測其可能梔子耐鹽調(diào)控的關(guān)鍵基因。

綜上所述，本研究共鑒定出16個(gè)梔子TCP基因成員。它們在不同程度鹽脅迫下均有響應(yīng)。研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究梔子TCP基因家族及鹽脅迫下分子機(jī)制提供參考，對梔子鹽堿品種培育具有重要意義。

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