摘要：氮脅迫直接影響烤煙的生產(chǎn)與品質(zhì)。為探究烤煙對于低氮、高氮脅迫作出的響應，利用RNA-Seq方法對打頂后的烤煙葉片進行分子機制研究。結(jié)果顯示，在375個響應低氮脅迫的基因中，有240個基因表現(xiàn)出上調(diào)的特征，135個基因則出現(xiàn)了下調(diào)的情況；另外，在1 079個響應高氮脅迫的基因中，有691個基因表現(xiàn)出上調(diào)的特征，388個則出現(xiàn)了下調(diào)的情況。GO注釋和KEGG顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，氮信號主要對烤煙碳氮代謝、煙堿合成產(chǎn)生影響，篩選出氮代謝關鍵基因9個，碳代謝關鍵基因11個。低氮脅迫差異基因主要富集在各種轉(zhuǎn)移酶活性及轉(zhuǎn)運相關的囊泡等條目中，在低氮脅迫下，多種轉(zhuǎn)移蛋白酶活性被抑制，能量轉(zhuǎn)運減少；葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化被抑制，促使更多蔗糖合成，優(yōu)先補償碳代謝；L-天冬酰胺酶上調(diào)，天冬氨酸被更多地轉(zhuǎn)化為天冬酰胺而非α-亞氨基琥珀酸，影響煙堿形成。高氮脅迫的差異基因主要富集到與光合作用相關的條目與通路，葉綠素a/b結(jié)合蛋白7、葉綠素a/b結(jié)合蛋白16及葉綠素a/b結(jié)合蛋白40基因和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因上調(diào)，直接或間接地促進CO2固定，更多的碳代謝產(chǎn)物被用于氮代謝中，使烤后煙葉中氮含量過度積累，碳氮代謝失衡；谷氨酰胺合成酶下調(diào)，氮更多地流向了煙堿形成途徑而非氨基酸合成途徑；查爾酮合酶1B基因下調(diào)，優(yōu)先保證1-N甲基吡咯啉的轉(zhuǎn)化，促進煙堿形成。

關鍵詞：烤煙；RNA-seq；氮脅迫；碳氮代謝

中圖分類號：S572.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0111-09

收稿日期：2024-02-18

基金項目：中國煙草總公司貴州公司科技項目（編號：2023XM12）。

作者簡介：潘宇琪（1999—），男，貴州六盤水人，碩士研究生，主要從事煙草營養(yǎng)與施肥研究。E-mail：1552031764@qq.com。

通信作者：陳風雷，碩士，高級農(nóng)藝師，碩士生導師，主要從事優(yōu)質(zhì)煙葉栽培技術研究，E-mail：cfl-fenglei@163.com；黃 鶯，碩士，副教授，碩士生導師，主要從事煙草營養(yǎng)與施肥及土壤環(huán)境化學研究，E-mail：316452492@qq.com。

氮是影響烤煙品質(zhì)及產(chǎn)量的重要營養(yǎng)物質(zhì)，參與烤煙體內(nèi)碳、氮代謝等重要生物過程［1］。N的供應不足或過量都會對烤煙品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。植物在低氮脅迫下，葉片形態(tài)大小、干物質(zhì)質(zhì)量、硝酸還原酶（NR）、谷氨酸合成酶（GOGTA）以及亞硝酸還原酶（NiR）等氮代謝相關酶活性降低，全株氮積累量下降但利用效率提高［2-3］。低氮下光合作用基因受到顯著抑制，特別是葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因下調(diào)［4］。含氮化合物、煙堿含量與施氮量呈正相關，總糖、還原糖含量相反，各生育時期的淀粉酶活性都隨施氮量增加而增加［5-9］。過量施用氮肥則會導致烤煙根系發(fā)育受到抑制，防御相關蛋白酶活性降低，且烤煙生長后期貪青晚熟，烤后煙葉品質(zhì)不佳等情況［10-11］。研究認為隨著施氮量增加，導致煙草體內(nèi)糖代謝減弱以及α-酮戊二酸回補能力降低，是煙草體內(nèi)碳氮代謝失衡的主要原因之一［12］。以上結(jié)論只針對氮代謝的單一指標進行研究，很難真實反映出植物體內(nèi)錯綜復雜的含氮化合物的變化。組學技術為此提供了解決方法，利用組學技術對植物環(huán)境壓力進行篩選并揭示其機制成為近年來的研究熱點。張玉寧等利用蛋白組學、代謝組學等技術揭示了環(huán)境脅迫下氮代謝過程的復雜過程［13-15］。本研究用RNA-Seq的方法，分析氮脅迫下烤煙基因的變化，試圖從轉(zhuǎn)錄組學的角度分析烤煙響應氮脅迫相關的基因差異表達以及差異代謝途徑，為深入了解烤煙響應氮脅迫的耐性分子機制提供基礎數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

試驗于2022年在貴州省安順市西秀區(qū)楊武鄉(xiāng)（106°E、26°N）進行。供試土壤為黃壤，有機質(zhì)含量47.38 g/kg，全氮含量2.25 g/kg，堿解氮含量175.19 mg/kg，有效磷含量16.31 mg/kg，速效鉀含量84.38 mg/kg，pH值5.48。試驗品種為我國主要種植品種烤煙云煙87。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 試驗設計

設置3 個N肥施用水平（以N計），分別為低氮處理（LN）60 kg/hm2、正常氮處理（CK）105 kg/hm2、高氮處理（HN）150 kg/hm2。打頂后10 d，采集烤煙中部葉，混合后得到樣品，稱取20 g（鮮重）左右在超低溫冰箱（T≤-80 ℃）中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 化學成分含量測定

采用煙草行業(yè)的標準方法［16-18］，對煙葉煙堿、總氮、總糖以及還原糖的濃度進行測定。

1.2.3 經(jīng)濟性狀

根據(jù)烤煙42級國家標準［19］，對所有原煙的等級進行劃分，并以當?shù)厥召弮r格作為參考。此外，對每個等級的產(chǎn)量、平均價格、產(chǎn)值以及上等煙中上等煙的比重等進行精確的統(tǒng)計。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學測定

RNA提?。喝? g保存完好的鮮樣，置于研缽中倒入液氮研磨，使其呈細微的顆粒后加入1 mL RNA提取試劑，在室溫下靜置 5 min；加入1/5體量的三氯甲烷，上下?lián)u晃后再次在室溫下靜置5 min；在8 939 r/min、4 ℃的條件下離心15 min；將離心過后的上層清液取出倒入新的離心管中，加入與上清液等量的2-丙醇上下?lián)u晃至均勻狀態(tài)，在室溫下靜置5 min；在同上條件下離心10 min；加入1 mL 75%乙醇對離心管中的沉淀進行清洗；再次以上述條件離心5 min；保留沉淀并使其干燥；加DEPC水溶解沉淀。之后采用Nano Drop 2000分光光度計（Thermo Scientific，USA）和Agilent 2100 Bioanalyze （Agilent Technologies，Santa Clara，USA） 檢查RNA的純度和評估RNA完整性。

轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建：將mRNA分離與片段化。使用VAHTS Universal V5 RNA-Seq Library Prep Kit試劑盒構(gòu)建文庫。通過使用具有寡聚物（dT）的磁珠富集mRNA，并利用片段化技術將其轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。接著，使用模板和隨機引物，合成雙鏈cDNA，以實現(xiàn)更高效的cDNA轉(zhuǎn)錄。通過純化、末端修復以及添加polyA，雙鏈cDNA被連接到接合器上，并且根據(jù)片段的大小進行PCR擴增。使用Agilent 2100 Bioanalyzer評價構(gòu)建好的cDNA文庫質(zhì)量。

轉(zhuǎn)錄組測序：采用llumina Nova Seq 6000測序平臺（USA） 對文庫進行測序，并生成150 bp生物功能雙端讀長。采用Fastp軟件進行讀長過濾后獲得干凈讀長用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析［20］。使用HISAT2軟件將測序結(jié)果與烤煙的基因組比對，并進行基因表達量的計算，并通過 HTSeq-count獲得每個基因的讀長計數(shù)［21］。每個樣品3次生物學重復，使用R（v3.2.0）對基因進行PCA分析以及繪圖，以評估樣本生物學重復。利用DESeq2軟件進行差異表達基因分析，其中符合Q值lt;0.05且fold changegt;2或fold changelt;0.5閾值的基因被定義為差異表達基因［22］。

差異表達基因功能分析：通過歐易生物分析云平臺、茄科基因組數(shù)據(jù)庫（Sol Genomics network，SGN）、基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology Resource，GO）及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）深入探究差異表達基因的特殊功用，并將其特殊功用注解、富集，以期獲得更加準確的研究結(jié)果。然后從中篩選出與碳氮代謝相關的差異表達基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

對原始的測序結(jié)果進行過濾，得到的干凈讀長在38.62～40.32 Mb之間，Q30均在95.20%以上。97.28%～98.19%測序序列能映射到已公布的烤煙基因組數(shù)據(jù)庫（表1），唯一映射率為 84.40%～87.15%，各樣本的測序質(zhì)量較好，可以進行后續(xù)分析。

2.2 氮脅迫下的差異表達基因

由圖1可以看出，低氮脅迫下共獲得375個差異基因，其中240個差異基因上調(diào)，135個差異基因下調(diào)；高氮脅迫下共獲得1 079個差異基因，其中691個差異基因上調(diào)，388個差異基因下調(diào)。韋恩圖顯示響應低氮脅迫與高氮脅迫的相同基因有67個，

響應高氮脅迫的特有差異基因有1 013個，響應低氮脅迫的有309個，這說明高氮脅迫對烤煙生長代謝的影響更大。

GO功能注釋主要分為三大獨立板塊：生物過程、分子功能和細胞組分。將差異表達基因進行GO富集功能分類，LN和CK之間共富集到650條條目，HN和CK之間共富集到1 181條條目。在圖2中顯示出了GO富集最顯著的前30條條目。

由圖2可知，LN和CK的差異基因參與的生物過程除細胞過程外，還有化合物代謝過程、生物過程的調(diào)節(jié)、對環(huán)境變化的反應、生物調(diào)節(jié)及發(fā)育過程等，對免疫系統(tǒng)、生長過程等也有影響。低氮脅迫下差異基因描述的分子功能主要是結(jié)合，其次是催化活動、轉(zhuǎn)運體活動，還有酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和電子載流子活性等。差異基因所處的細胞組分主要是細胞、細胞組分，其次是細胞器、膜、膜組分、細胞器組分等，影響最小的主要是胞外區(qū)。

HN和CK的差異基因參與的生物功能主要是細胞過程，其次是各種化合物代謝過程、對外界刺激的響應、生物調(diào)節(jié)及生物過程的調(diào)節(jié)。高氮脅迫下差異基因參與的分子功能主要是結(jié)合，其次是催化活動以及轉(zhuǎn)運體活動等，對分子傳感器活性、翻譯調(diào)控活性等的影響較小。差異基因參與的細胞組分主要是細胞，其次是細胞組分、細胞器、膜、膜組分以及細胞器等，影響最小主要是膜封閉、胞外區(qū)和擬核。

LN脅迫下特有的條目有217條，包括生物功能中的DNA起始復制過程、沿微管的囊泡運輸、對二氧化碳的響應等，分子功能中的L-阿拉伯激酶活性、ATP-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性、ADP-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性、AMP-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性、tRNA-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性等，細胞組分中的原點識別復合體、復制識別復合物的核起源等。HN脅迫下特有的條目有748條，生物功能中的光合作用、光收集過程、調(diào)控次生芽形成過程、苯丙烷代謝過程的調(diào)控等，分子功能中核酮糖-二磷酸羧化酶活性、硫代葡萄糖苷生物合成過程的調(diào)控等是LN脅迫下沒有的。

通過KEGG通路數(shù)據(jù)庫對基因注釋進行解析。LN和CK之間共富集到50條通路，HN和CK之間共富集到91條。圖3顯示了富集最顯著的前20條。

由圖3可知，LN和CK中差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導，各種生物堿的生物合成，C-支鏈二元酸代謝，硫代葡萄糖苷生物合成，賴氨酸生物合成，玉米素生物合成，硫磺酸和次硫磺酸代謝，色氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，倍半萜類化合物和三萜類化合物生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，二萜類生物合成，異喹啉酸生物堿生物合成，硫胺素代謝，半乳糖代謝，賴氨酸降解，脂肪酸伸長率，泛酸和輔酶A的生物合成，苯丙烷生物合成，丙酮酸代謝等。

而在HN和CK中差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導，MAPK信號通路-植物，鞘糖脂生物合成神經(jīng)節(jié)系列，硫代謝，糖胺聚糖降解，黃酮類生物合成，氰基氨基酸代謝，二苯乙烯類二芳基庚烷類和姜辣素生物合成，光合作用-天線蛋白，各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，氮代謝，泛酸和輔酶A的生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，淀粉和蔗糖代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，半乳糖代謝，苯丙烷生物合成，谷胱甘肽代謝等。

僅在LN脅迫下富集的KEGG通路有4條，分別是萜類骨架生物合成通路、基礎轉(zhuǎn)錄因子、二萜類生物合成以及C-支鏈二元酸代謝。而HN中特有的通路有46條，其中有氮代謝、光合作用-天線蛋白、托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成、精氨酸生物合成、組氨酸代謝以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等。

2.3 烤煙氮代謝對氮脅迫的響應

通過比對茄科數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.sgn.cornell.edu/organism/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017）對不同處理篩選到的基因進行基因注釋。從LN vs CK的KEGG通路中共篩選到與氮代謝相關的基因3 個（表2），分別是編碼多酚氧化酶E基因（Nitab4.5_0003171g0010）、斷馬錢子苷合成酶基因（Nitab4.5_0001073g0090）和L-天冬酰胺酶/β-天冬氨酸肽酶基因（Nitab4.5_0000412g0050）。

從HN vs CK的KEGG通路中共篩選到相關基因6個（表2），分別是編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白2.5基因（Nitab4.5_0002255g0010、Nitab4.5_0007682g0010）、谷氨酰胺合成酶基因（Nitab4.5_0000777g0010）、尼古丁N-去甲基酶基因（Nitab4.5_0009277g0010）、查爾酮合酶1B基因（Nitab4.5_0003904g0060）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（Nitab4.5_0000052g0220）。

2.4 烤煙碳代謝對氮脅迫的響應

由表3可知，從LNvsCK的KEGG通路中共篩選到碳代謝相關的基因2個，分別是編碼丙酮酸激酶同工酶A基因（Nitab4.5_0003815g0060）和UDP-糖焦磷酸化酶基因（Nitab4.5_0002557g0050）。

從HNvsCK的KEGG通路中共篩選到相關基因9個（表3），分別是葉綠素a/b結(jié)合蛋白7基因（Nitab4.5_0004269g0080）、葉綠素a/b結(jié)合蛋白16基因（Nitab4.5_0000982g0200）、葉綠素a/b結(jié)合蛋白40基因（Nitab4.5_0001434g0050）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因（Nitab4.5_0000052g0220）、β-果糖呋喃糖苷酶基因（Nitab4.5_0003404g0040）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Nitab4.5_0009972g0030）、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶2基因（Nitab4.5_0000928g0020）、蔗糖合成酶6基因（Nitab4.5_0001180g0180）、1，4-α-葡聚糖支鏈酶2-2基因（Nitab4.5_0003541g0040）。

2.5 氮脅迫對烤煙生長及煙葉品質(zhì)的影響

從植物外觀形態(tài)鑒定氮脅迫最為直觀。圖4是不同供氮水平下烤煙的田間表現(xiàn)。試驗地力水平下，團棵期CK、HN差異不顯著，LN處理葉色較淺，略黃。采烤期，CK正常落黃，LN提前落黃且葉色淺淡、葉片窄小，HN葉片寬大且落黃延遲，LN、HN處理從外觀形態(tài)上表現(xiàn)出明顯的缺素或過量脅迫癥狀。

由表4可知，烤后煙葉氮的含量隨著施氮量的增加而顯著增加。LN脅迫下，還原糖、淀粉和煙堿含量與CK相比均未達到顯著差異，但總糖卻顯著高于CK；HN脅迫與LN脅迫相似，水溶性總糖、還原糖、淀粉和煙堿含量與CK相比均未達到顯著差異水平，但是水溶性總糖、還原糖以及淀粉含量均低于對照處理，且煙堿含量升高。糖氮比隨著施氮量的增加而降低，兩糖比以CK協(xié)調(diào)性最佳。

由表5可知，HN處理相較于CK生物產(chǎn)量提高，但是經(jīng)濟產(chǎn)量及產(chǎn)值均顯著降低。LN條件下，經(jīng)濟產(chǎn)量與CK無顯著差異，但是因為中上等煙率低，導致產(chǎn)值降低。

綜上，LN、HN處理相較于CK，從外觀、內(nèi)在化學成分和經(jīng)濟性狀上均表現(xiàn)出氮缺乏、氮過量的脅迫癥狀。

3 討論與結(jié)論

3.1 煙株氮脅迫的界定

氮是影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)最為重要的營養(yǎng)元素，輕微的氮脅迫會引起植株生理生化過程改變，嚴重的甚至導致外觀變化［23］。LN、HN處理的煙株，

在打頂后10 d外觀有明顯變化，烤后煙葉的化學品質(zhì)和經(jīng)濟性狀降低，說明均已處于缺氮和氮過量的脅迫狀態(tài)。

3.2 烤煙氮代謝及煙堿合成對氮脅迫的響應

氮是植物生長發(fā)育過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)以及信號分子，銨態(tài)氮與硝態(tài)氮是植物吸收無機態(tài)氮的主要形態(tài)。本研究中，高氮脅迫促使高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白2.5（NRT 2.5）基因顯著下調(diào)，這表示烤煙內(nèi)的低親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可能替代高親和力硝酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以此進行硝酸轉(zhuǎn)運， 減少植物對氮的轉(zhuǎn)

運，主動避免過多硝態(tài)氮累積對植物的傷害［24-25］。當銨態(tài)氮充足時，谷氨酰胺合成酶活性升高，以存儲更多的氮。研究中高氮條件下谷氨酰胺合成酶基因顯著下調(diào)，可能是因為氮更多地流向了生物堿合成途徑，而非氨基酸合成途徑。

在烤煙氮代謝中，煙堿是極為重要的品質(zhì)指標，是產(chǎn)生生理依賴的原因，還影響了煙草的香吃味［26］。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在植物體內(nèi)催化天冬氨酸和2-氧代戊二酸由草酰乙酸和谷氨酸生成的途徑，天冬氨酸作為烤煙煙堿合成的前體物質(zhì)，其含量也影響著煙堿的合成［27］。LN脅迫下，L-天冬酰胺酶基因顯著上調(diào)意味著天冬氨酸被更多地轉(zhuǎn)化為天冬酰胺而非α-亞氨基琥珀酸，這可能是低氮下煙堿含量較低的原因。HN處理則提高了天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，導致天冬氨酸含量升高進而使煙堿含量上升。

氮脅迫除了影響煙堿形成前體物外，對其形成和降解過程也產(chǎn)生了影響。在高氮脅迫下，查爾酮合酶1B基因下調(diào)，表明1-N甲基吡咯啉的轉(zhuǎn)化促進了煙堿的生物合成而非類黃酮類物質(zhì)的生成（圖5）。另外，尼古丁N-去甲基酶基因下調(diào)，表明去甲基尼古丁的生物合成在高氮下受到抑制，這一過程減少了去甲基煙堿的形成，也降低了煙堿的降解，可能是施氮水平高導致煙堿含量增加的又一途徑［28］。而在LN處理下，多酚氧化酶E基因下調(diào)影響了異喹啉生物堿的合成；斷馬錢子苷合成酶基因的上調(diào)可能導致茄堿和番茄堿含量上升，但由于其占烤煙總生物堿的比例太小，煙草總生物堿含量較CK依然降低。

3.3 烤煙碳代謝對氮脅迫的響應

碳代謝的中心是光合作用。煙草進行HN處理后，葉綠素a/b結(jié)合蛋白7、葉綠素a/b結(jié)合蛋白16及葉綠素a/b結(jié)合蛋白40基因顯著上調(diào)，合成更多的葉綠素以促進光合作用，進而促進C的固定［29-30］。與其他作物一樣，HN使煙葉天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因上調(diào)，促進CO2的固定。

作為植物能量代謝的碳代謝、蔗糖代謝兩大部分，蔗糖合酶（SS）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG）的催化作用使得蔗糖代謝發(fā)生了一種可逆的變化，即SS將果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖，從而維持植物體內(nèi)蔗糖濃度的穩(wěn)定性。HN下SS顯著下調(diào)，抑制了蔗糖合成，Yang等在烤煙根系中也觀察到了相同現(xiàn)象［31］。蔗糖的分解代謝中，β-果糖呋喃糖苷酶上調(diào)，使蔗糖持續(xù)分解為果糖及葡萄糖，積累量下降。HN處理可以顯著降低葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（GPAT）的活性，從而阻礙腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）的生成，這種情況下，淀粉的生產(chǎn)量可能會大幅度減少［32］。另外，HN下的1，4-α-葡聚糖支化酶2-2基因（GBSS2-2）的上調(diào)促進直鏈淀粉鏈合成支鏈淀粉，這表明了HN不僅抑制淀粉的合成，還會促使淀粉結(jié)構(gòu)改變。在LN條件下，UDP-糖焦磷酸化酶表達量下調(diào)（圖5），葡萄糖-1-磷酸鹽轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖的過程受抑制，而葡萄糖-1-磷酸來源于葡萄糖，所以這可能是LN下烤煙糖含量較高的原因之一。

ATP-磷酸果糖激酶是控制糖酵解/糖異生途

徑第一步的關鍵酶，催化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6-二磷酸，這個反應阻礙了果糖-6-磷酸向蔗糖和淀粉轉(zhuǎn)化，整個糖酵解/糖異生過程都受到該酶的控制。HN誘導該酶的基因顯著下調(diào)，抑制了糖酵解/糖異生途徑，蔗糖合成受抑制。丙酮酸激酶作為糖酵解的終止步驟，它通過無法逆轉(zhuǎn)的方式把磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸基團從ADP轉(zhuǎn)換到ATP和丙酮酸。在LN條件下，為了補償碳代謝，煙葉中丙酮酸激酶同工酶A顯著上調(diào)，促進丙酮酸的生成，以提高對碳的利用效率，這與Ambasht等的研究結(jié)果［33-34］一致。

3.4 氮代謝對烤煙碳氮平衡的影響

烤煙內(nèi)部的碳氮代謝平衡對于烤煙的產(chǎn)量品質(zhì)形成有著極為重要的影響，碳氮代謝是烤煙生長發(fā)育的基礎，它們之間的聯(lián)系非常密切，不僅存在著彼此的限制，也存在著協(xié)同的作用，即氮代謝的進行需要碳代謝提供碳源和能量，而碳代謝則需要氮代謝提供酶和光合色素，這種雙向的交換使得烤煙的生長發(fā)育受到至高的保障，從而決定了其產(chǎn)量和品質(zhì)的高低［35］。

對于差異基因的GO以及KEGG分析顯示，LN使各種轉(zhuǎn)移酶活性及轉(zhuǎn)運相關的囊泡等條目受到十分顯著的抑制，氮供應不足時碳代謝優(yōu)先滿足自身代謝所需能量，降低了轉(zhuǎn)移蛋白酶活性，這一點也可以從丙酮酸激酶同工酶A基因的顯著上調(diào)可以看出；此外，LN下減少葡萄糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)化，促使更多蔗糖合成，優(yōu)先補償碳代謝，煙葉葉色較淺，這些都體現(xiàn)了低氮下氮代謝強度不高、碳代謝增強。通過L-天冬酰胺酶上調(diào)，天冬氨酸被更多地轉(zhuǎn)化為天冬酰胺而非α-亞氨基琥珀酸，影響了煙堿形成。

HN的差異基因主要富集到與光合作用相關的條目與通路，葉綠素a/b結(jié)合蛋白和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的上調(diào)，直接或間接地促進了C固定，煙葉外觀葉色也較為濃綠。結(jié)合對烤后煙葉含氮量增加看來，光合作用強度增大是為了提供更多的能量來進行氮代謝，符合大部分研究報道的耗“碳”得“氮”的規(guī)律，這應該是導致高氮下碳氮代謝失衡的原因。值得一提的是，打頂后HN處理下煙株獲得的氮，因為谷氨酰胺合成酶的下調(diào)，更多地流向了煙堿形成途徑而非氨基酸合成途徑。此時，煙堿形成途徑也發(fā)生著變化，查爾酮合酶1B基因下調(diào)，阻止了氮代謝產(chǎn)物向非黃酮類化合物的轉(zhuǎn)移，保證了1-N甲基吡咯啉的轉(zhuǎn)化，以便合成更多的煙堿。

參考文獻：

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