摘要：煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)鉀素需求量較大。KUP家族是目前已知的最大的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面起著重要作用。對(duì)煙草KUP基因家族進(jìn)行鑒定和分析，并探究其在低鉀脅迫下的表達(dá)模式，可為進(jìn)一步研究和利用煙草KUP基因奠定基礎(chǔ)。本研究采用生物信息學(xué)方法在煙草基因組中鑒定KUP家族，且對(duì)家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、共線(xiàn)性分析、Ka/Ks值、順式作用元件等進(jìn)行分析，并探明KUP基因家族成員在根、莖、葉、花等不同組織及干旱脅迫條件下的表達(dá)模式；最后通過(guò)qRT-PCR方法分析其在低鉀脅迫下的表達(dá)模式。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：在煙草K326基因組中共鑒定出39個(gè)KUP基因，家族成員均含有一個(gè)典型的“K_trans superfamily”結(jié)構(gòu)域，其中26個(gè)被定位在13條染色體上，存在7對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)?，?對(duì)基因?qū)Φ腒a/Ks值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，有1對(duì)基因?qū)Φ腒a/Ks值大于1；KUP家族蛋白均為疏水性蛋白，其基因上游啟動(dòng)子區(qū)均包含多個(gè)激素和脅迫元件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明：NtKUP家族基因大部分成員在根和花中高表達(dá)，少部分在莖和葉中高表達(dá)，且部分成員在花中表達(dá)量隨著成熟度逐漸降低；大多數(shù)基因?qū)Ω珊得{迫存在響應(yīng)。挑選4個(gè)NtKUP基因進(jìn)行qRT-PCR分析，試驗(yàn)結(jié)果表明：KUP2、KUP4、KUP8在低鉀脅迫下根中的表達(dá)量有不同程度的上調(diào)，且根中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉，這和NtKUP家族大部分成員在根中參與低鉀脅迫響應(yīng)的生物信息學(xué)分析相一致。

關(guān)鍵詞：煙草；KUP基因家族；鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；生物信息學(xué)；表達(dá)模式；低鉀脅迫；干旱脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S188；S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0100-11

收稿日期：2024-05-16

基金項(xiàng)目：貴州省煙草公司重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：2021XM04）。

作者簡(jiǎn)介：石遠(yuǎn)帥（2000—），男，貴州黔南人，碩士研究生，主要從事煙草遺傳育種研究。E-mail：1765994937@qq.com。

通信作者：劉 洋，博士，副教授，主要從事煙草遺傳育種研究。E-mail：yliu21@gzu.edu.cn。

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)鉀素需求量較大，含量通常為氮素的1.4倍、磷素的3.5倍［1］。鉀離子不僅能夠滿(mǎn)足煙草的生長(zhǎng)發(fā)育需求，而且能夠提高煙葉的品質(zhì)，缺鉀會(huì)導(dǎo)致煙草代謝失調(diào)，光合速率下降，根系生長(zhǎng)受抑制，鉀對(duì)于提髙煙葉產(chǎn)量、改善品質(zhì)起著非常重要的作用［2］；研究表明，鉀離子能夠有效降低煙焦油以及其他部分有害物質(zhì)的含量［3］，含鉀高的煙葉色澤呈深橘黃色，香氣足，吃味好，富有彈性和韌性，填充性強(qiáng)，陰燃持火力和燃燒性好［4］。

由于土壤溶液中的大部分鉀離子與黏土礦物結(jié)合，有效鉀離子的濃度非常低［5］；所以，在低鉀環(huán)境下（鉀離子濃度低于0.2 mmol/L），高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將土壤溶液中的鉀進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，以滿(mǎn)足煙草本身對(duì)鉀營(yíng)養(yǎng)的高需求［6］。目前，鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白按結(jié)構(gòu)可分為：KUP/HAK/KT（K+uptake/high-affinity K+transporter/K+transporter）、HKT（high-affinity K+transporter）和CPA（cation-proton antiporter，CPA）。KUP家族是目前所知的最大的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，其成員最多，覆蓋面最廣，廣泛存在于各種植物的器官當(dāng)中，在細(xì)胞膜和液泡膜上起作用［7］；KUP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的共同特征是具有12個(gè)跨膜區(qū)域（TMS），在第2個(gè)和第3個(gè)TMS之間有一個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)環(huán)，其N(xiāo)-末端和C-末端均位于胞內(nèi)側(cè)［8］。擬南芥中，有關(guān)KUP家族的研究較多，AtHAK5在低鉀條件下表達(dá)上調(diào)，并且在根中定位于表皮和皮質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜，AtHAK5參與高親和力K+攝取，而且很大程度上是與shaker-type AtAKT1通道冗余的［9］；在低鉀條件下，AtKUP7功能的喪失導(dǎo)致木質(zhì)部汁液中鉀攝取率和鉀含量降低，且試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，AtKUP7對(duì)擬南芥根系的鉀離子攝取至關(guān)重要，并且還可能參與鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)到木質(zhì)部汁液中的過(guò)程，從而影響鉀離子從根部到芽的轉(zhuǎn)運(yùn)［10］；AtKUP1和AtKUP2可以補(bǔ)充大腸桿菌突變體的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)缺乏，并且過(guò)表達(dá)AtKUP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥懸浮細(xì)胞顯示出Rb攝取增加［11］；AtKUP2、AtKUP6、AtKUP8參與膨脹、細(xì)胞大小和氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)突變株中的AtKUP2、AtKUP6、AtKUP8被破壞時(shí)，突變株根系中的鉀離子穩(wěn)態(tài)受到影響，與野生型相比，相對(duì)短暫的鉀離子攝取上調(diào)［12］。眾多研究表明，KUP基因家族在鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制上起著重要作用。

迄今為止，KUP基因家族僅在擬南芥、水稻、小麥、大麥等植物中被報(bào)道，未見(jiàn)煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因KUP及其相關(guān)功能的報(bào)道。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法在普通煙草K326基因組中鑒定NtKUP基因家族成員，并系統(tǒng)分析其進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)及基因結(jié)構(gòu)，還利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR技術(shù)分析其時(shí)空表達(dá)模式和脅迫響應(yīng)模式，為探究該基因家族在煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收方面的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

煙草K326種子由貴州大學(xué)煙草品質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2024年3月20日播種于貴州大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，將飽滿(mǎn)的煙草種子裝入1.5 mL離心管中，先用1 mL 30% NaClO溶液消毒20 min，用移液槍吸出消毒液，再加入1 mL 30% NaClO溶液消毒 20 min，2次消毒期間都要不斷地振蕩或反復(fù)顛倒EP管。然后用無(wú)菌水反復(fù)清洗5～7次后，吸干種子表面水分，布于MS 培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱光照度15 000 lx、溫度20 ℃、光照16 h/d培養(yǎng)［13］，培養(yǎng)至3張真葉完全展開(kāi)。

1.2 煙草KUP基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

普通煙草K326基因組序列以及注釋文件通過(guò)茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//solgenomics.net/）獲得，由PFAM（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載KUP隱馬爾科夫模型（profile hidden markov models，profile HMMs）序列譜（PF02705）。利用hmmsearch軟件在K326蛋白組文件中檢索，將得到的KUP候選成員利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終獲得煙草KUP家族成員［14-15］。利用在線(xiàn)網(wǎng)站ExPasy （https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)煙草KUP家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析，包括氨基酸數(shù)目、分子量、蛋白質(zhì)疏水性值等指標(biāo)［16］。

1.3 煙草KUP基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI下載辣椒（Capsicum annum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）蛋白完整數(shù)據(jù)，同樣使用hmmsearch鑒定和篩選KUP家族蛋白序列，隨后利用MEGA 11對(duì)5個(gè)物種KUP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［17］，采用鄰接法，1 000次重復(fù)，利用Clustal X對(duì)KUP蛋白進(jìn)行多序列對(duì)比，利用ITOL（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)美化［18］。

1.4 煙草KUP蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

將煙草KUP蛋白上傳至MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）網(wǎng)站，保守基序設(shè)定為10個(gè)，其他采用默認(rèn)設(shè)定［19］。利用Tbtools進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域作圖，利用Tbtools軟件使用GFF注釋文件繪制基因結(jié)構(gòu)圖［20］。

1.5 煙草KUP基因定位、共線(xiàn)性分析及Ka/Ks計(jì)算

煙草KUP染色體定位利用Tbtools軟件中的Gene Location Visualize功能進(jìn)行作圖，并顯示各個(gè)染色體基因密度。利用Tbtools軟件對(duì)煙草KUP基因進(jìn)行復(fù)制分析以及物種間與煙草的共線(xiàn)性分析。擬南芥基因組數(shù)據(jù)從NCBI上獲得，辣椒基因組在ensemble上獲得，水稻基因組在rice上獲得。利用KaKs_Calculator v2.0軟件計(jì)算復(fù)制基因的Ka和Ks［21］。

1.6 煙草KUP基因順式作用元件分析

從煙草基因組中獲取每個(gè)KUP基因CDS序列上游2 000 bp序列，使用Plant_CARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/htm1/）獲得KUP基因啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件，并通過(guò)Tbtools進(jìn)行可視化［22］。

1.7 煙草KUP基因轉(zhuǎn)錄分析

在BioProject（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/）和GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）網(wǎng)站上下載PRJNA208209和GSE214048的表達(dá)量數(shù)據(jù)［23-24］。GSE95717測(cè)序背景：煙草幼苗在塑料盆中生長(zhǎng)，白天在28 ℃和晚上23 ℃下光照循環(huán)16 h，收集了8個(gè)代表性煙草組織（根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、未成熟花、成熟花和衰老花）樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。GSE214048測(cè)序背景：使用200 mmol/L甘露醇進(jìn)行模擬干旱處理5葉1心煙草幼苗，收集0、1、2、4、8 h的煙草葉樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用Tbtools軟件歸一化處理后進(jìn)行可視化作圖。分析煙草NtGH3基因家族成員的差異表達(dá)特征。

1.8 qPCR基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證NtKUP家族成員是否對(duì)低鉀脅迫進(jìn)行響應(yīng)，挑選4個(gè)NtKUP基因（NtKUP1、NtKUP2、NtKUP4、NtKUP8）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。待煙苗長(zhǎng)至3張真葉完全展開(kāi)時(shí)，挑選生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良一致的幼苗，去離子水中洗凈根系，放至不含鉀元素的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液鉀饑餓2 d后放入不同鉀濃度的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。鉀濃度分正常供鉀和低鉀2個(gè)水平，其中正常供鉀溶液鉀離子濃度為5 mmol/L，低鉀溶液鉀離子濃度為0.15 mmol/L。試驗(yàn)共2個(gè)處理，設(shè)3次重復(fù)。每3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 d后對(duì)根和葉分別取樣，及時(shí)存放于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于 RNA 的提取。用Plant RNA Kit純植物試劑盒（GenStar，R6827）從 4 ℃ 和的樣品中提取總RNA，使用StarScript Ⅱ RT Mix with gDNA Remover試劑盒（GenStar，A224）獲得cDNA，基因引物設(shè)計(jì)使用Primer-Blast（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)，以NtL25為內(nèi)參基因（表1）。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量［25］。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草KUP家族成員鑒定及編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

通過(guò)HMMER 5.0軟件在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到NtKUP家族成員，去除重復(fù)和冗余序列，在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)SMART中復(fù)篩，共鑒定得到39個(gè)NtKUP家族蛋白。其中26個(gè)成員分別被組裝在13條染色體上，根據(jù)基因在染色體中的相對(duì)位置對(duì)26個(gè)基因進(jìn)行命名，其余未能定位到染色體上的基因按照基因ID序號(hào)進(jìn)行命名。將其依次命名為NtKUP1～NtKUP39（表2）。

蛋白理化性質(zhì)分析表明，煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NtKUP家族成員的蛋白序列長(zhǎng)度在639～854個(gè)氨基酸之間，分子量為71.3～95.2 ku，其中NtKUP38的氨基酸數(shù)量最少，分子量?jī)H為71.3 ku；而NtKUP39的氨基酸數(shù)目最多，分子量為95.2 ku。NtKUP蛋白中有29個(gè)屬于堿性蛋白，1個(gè)屬于中性蛋白，9個(gè)屬于酸性蛋白；其中NtKUP33的等電點(diǎn)最高（9.38），NtKUP16的等電點(diǎn)最低（5.49），KUP1為電中性蛋白（7）。NtKUP蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為32.22～50.47，共有15個(gè)蛋白穩(wěn)定系數(shù)＞40，屬于不穩(wěn)定蛋白，且NtKUP25的穩(wěn)定系數(shù)達(dá)到50.47，極為不穩(wěn)定，其余24個(gè)蛋白為穩(wěn)定蛋白。NtKUP蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為97.56～114.56，表明該類(lèi)蛋白的極性氨基酸含量較低，具有較好的溶解性。同時(shí)NtKUP蛋白的親水系數(shù)為0.103～0.413，該家族39個(gè)蛋白均為疏水性蛋白，符合鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征。

2.2 煙草KUP基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用Hammer軟件分別在擬南芥中鑒定出13個(gè)基因，玉米22個(gè)基因，水稻19個(gè)基因，葡萄16個(gè)基因，并使用MEGA X軟件采用最大似然（ML）法與煙草KUP基因構(gòu)建了1個(gè)鄰接（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。109個(gè)基因可分為4個(gè)亞類(lèi)，在4個(gè)亞類(lèi)中，Ⅰ類(lèi)成員包括17個(gè)煙草成員、6個(gè)擬南芥成員、6個(gè)水稻成員、7個(gè)葡萄成員、8個(gè)玉米成員；Ⅱ類(lèi)成員包括7個(gè)煙草成員、3個(gè)擬南芥成員、2個(gè)水稻成員、1個(gè)葡萄成員、3個(gè)玉米成員；Ⅲ類(lèi)成員包括12個(gè)煙草成員、4個(gè)擬南芥成員、8個(gè)水稻成員、7個(gè)葡萄成員、8個(gè)玉米成員；Ⅳ類(lèi)成員包括3個(gè)煙草成員、2個(gè)水稻成員、1個(gè)葡萄成員、1個(gè)玉米成員。每一個(gè)亞家族都包含了至少4個(gè)物種家族成員，說(shuō)明KUP家族成員的分化時(shí)間是要早于5個(gè)物種的分化時(shí)間的。煙草家族成員的數(shù)量較多，說(shuō)明在煙草物種形成后，NtKUP家族成員在該物種形成之后可能經(jīng)歷了多次復(fù)制事件。

2.3 煙草KUP基因家族成員序列分析及啟動(dòng)子分析

一般序列相似的基因具有相似的生物學(xué)功能，為此采用在線(xiàn)網(wǎng)站MEME對(duì)煙草KUP家族成員的保守基序進(jìn)行了分析，結(jié)果表明NtKUP家族成員均包含14～20個(gè)基序，NtKUP家族成員除NtKUP13外均含有motif 7，表明這個(gè)基序是NtKUP家族成員

的保守序列（圖2-A）。CD Search分析顯示，NtKUP家族成員含有鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的保守結(jié)構(gòu)域（K_trans superfamily）（圖2-B）。NtKUP基因結(jié)構(gòu)表明，NtKUP基因家族成員均含有5～12個(gè)外顯子（圖2-C）。

利用Plant CARE在線(xiàn)軟件對(duì)NtKUP基因家族成員上游2 000 pb序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上游序列中有許多與激素響應(yīng)、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)以及厭氧誘導(dǎo)的調(diào)控等相關(guān)的元件（圖3），其中與激素響應(yīng)相關(guān)的元件有IAA（TGA-element、AuxRR-core）、SA

（TCA-element）、ABA（ABRE）、MeJA（CGTCA-motif）、GA（P-box）；與光反應(yīng)相關(guān)的元件有ACE、G-Box、circadian、GT1-motif、MRE；與非生物脅迫相關(guān)的元件有TC-rich repeats、LTR、MBS；另外還有1個(gè)參與厭氧調(diào)節(jié)的順式作用元件ARE。與脫落酸相關(guān)的ABRE、與厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的ARE、以及與光響應(yīng)相關(guān)的G-Box存在于大多數(shù)家族成員之中，表明大多數(shù)NtKUP成員可能直接或者間接參與脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)以及光反應(yīng)。

2.4 煙草KUP基因定位與共線(xiàn)性分析

Tbtools軟件分析和可視化NtKUP基因的染色體定位結(jié)果表明，有26個(gè)NtKUP基因分布在13條染色體上，其中2、3、7、8、13號(hào)染色體上各有1個(gè)成員；4、12、21、23、24號(hào)染色體上分別有2個(gè)成員；17號(hào)染色體上有3個(gè)成員；19和20號(hào)染色體上分別有4個(gè)成員；13個(gè)NtKUP基因未定位到染色體上（圖4）。煙草基因組內(nèi)共線(xiàn)性分析表明，在Circos圖中發(fā)現(xiàn)了7對(duì)片段重復(fù)的基因?qū)?，均為大片段?fù)制，用黑色曲線(xiàn)連接（圖5）。由于植物基因家族的擴(kuò)展主要是由片段重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)事件促進(jìn)的，所以推測(cè)NtKUP基因家族的擴(kuò)展與串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制事件有關(guān)，而片段復(fù)制是NtKUP基因家族新成員的主要來(lái)源。

通過(guò)軟件計(jì)算Ka和Ks值（表3），除NtKUP18/NtKUP26外，其余3對(duì)基因的Ka和Ks值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，主要為同義替換，基因受純化選擇；而NtKUP18/NtKUP26這對(duì)基因的Ka和Ks值大于1，主要為異義替換，基因受正選擇，即異義替換有可

能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能，因此會(huì)造成適應(yīng)性的變化，從而帶來(lái)自然選擇的優(yōu)勢(shì)或者劣勢(shì)（一般是劣勢(shì)）。

煙草分別和擬南芥、辣椒、水稻的KUP成員共線(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn)（圖6）：5個(gè)NtKUP基因與7個(gè)AtKUP基因組成8個(gè)基因?qū)Γ?9個(gè)NtKUP基因與5

個(gè)CaKUP基因組成9個(gè)基因?qū)Γ?個(gè)NtKUP基因與1個(gè)OsKUP基因形成1個(gè)基因?qū)Γ?說(shuō)明基因復(fù)制有可能是煙草基因組NtKUP基因擴(kuò)增和進(jìn)化的動(dòng)力。

2.5 煙草KUP家族基因表達(dá)分析

正常生長(zhǎng)條件下的不同煙草組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明NtKUP基因在不同部位的差異表達(dá)（圖7）。NtKUP家族大部分成員都在根和花中表達(dá)，NtKUP19、NtKUP9等9個(gè)基因主要在根部表達(dá)，且在其他部位表達(dá)很少甚至不表達(dá)；NtKUP12、NtKUP14等6個(gè)基因僅在衰老花中表達(dá)，在其他組織部位不表達(dá)；NtKUP4在花和葉中表達(dá)較多，在幼花、幼葉尤其明顯；NtKUP8在各個(gè)部位表達(dá)分布較為均勻，在幼花表達(dá)量達(dá)到峰值；NtKUP2和NtKUP5在各組織表達(dá)分布也較為均勻，在根和莖

當(dāng)中表達(dá)量較高；NtKUP1、NtKUP10等10個(gè)基因的表達(dá)量趨勢(shì)基本一致，均是在根、花的各個(gè)時(shí)期、以及成熟葉和衰老葉中表達(dá)，在根和花中表達(dá)量較高，且隨著花的衰老，表達(dá)量不斷增高，在葉片中表達(dá)不明顯。

用200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理煙草幼苗的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到的26個(gè)NtKUP成員（圖8）。干旱脅迫后，NtKUP2、NtKUP4等10個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)；KUP8的表達(dá)量下調(diào)；NtKUP3、NtKUP7等8個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；NtKUP15、NtKUP22等2個(gè)基因呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)；NtKUP6、NtKUP14等5個(gè)基因不受干旱脅迫的影響。

2.6 低鉀脅迫對(duì)部分NtKUP基因表達(dá)分析

由于NtKUP家族屬于鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，大部分成員和根系鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，因此，對(duì)煙草幼苗進(jìn)行低鉀脅迫處理12 d，分析NtKUP1、NtKUP2、NtKUP4、NtKUP8等4個(gè)基因的表達(dá)變化，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，在低鉀脅迫下，4個(gè)基因在根和葉上均表現(xiàn)出不同程度的變化，12 d低鉀處理過(guò)后，葉片NtKUP1表達(dá)量極顯著下調(diào)，根無(wú)明顯變化；根NtKUP2表達(dá)量極顯著上調(diào)，葉片與處理前無(wú)明顯變化，但根表達(dá)量極顯著高于葉片；各部位NtKUP4表達(dá)量與處理前均無(wú)顯著差異，但根表達(dá)量還是略高于葉片；根NtKUP8表達(dá)量極顯著上調(diào)，葉片表達(dá)量與處理前無(wú)顯著差異，但明顯低于根中表達(dá)量。這些結(jié)果表明，NtKUP1、NtKUP2、NtKUP4、NtKUP8均在根中表達(dá)，參與低鉀脅迫的響應(yīng)均在根中進(jìn)行。

3 結(jié)論與討論

本研究在煙草全基因組（K326）范圍內(nèi)對(duì)煙草NtKUP進(jìn)行鑒定，共鑒定到39個(gè)NtKUP基因家族成員。NtKUP家族成員均含有1個(gè)典型的“K_trans superfamily”結(jié)構(gòu)域（PF02705），該結(jié)構(gòu)域是KUP鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員所特有的，這與在大麥中的預(yù)測(cè)結(jié)果［26］相似。Ka/Ks（有時(shí)稱(chēng)為dN/dS，非同義替換率/同義替換率）通常用于幫助理解編碼序列中的進(jìn)化方向及其選擇強(qiáng)度Ka/Ksgt;1 表示基因受正選擇，Ka/Kslt;1表示基因受純化選擇，Ka/Ks=1表示基因受中性進(jìn)化［27］。共線(xiàn)性基因?qū)χ杏?對(duì)基因?qū)Φ腒a/Ks值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，有1對(duì)基因?qū)a/Ks大于1，結(jié)果表明NtKUP家族基因大多在復(fù)制之后進(jìn)行了純化選擇。推測(cè)KUP家族的分化早于6個(gè)物種的形成，但是由于后期分化導(dǎo)致煙草與擬南芥和辣椒的親緣關(guān)系較近，與水稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)［28］。煙草的KUP成員明顯多于擬南芥、玉米、水稻、葡萄，說(shuō)明發(fā)生在煙草KUP家族中的復(fù)制事件多于其余物種［29］。

在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，基因啟動(dòng)子及其順式作用元件起著重要的調(diào)控作用，編碼蛋白質(zhì)的基因的核心啟動(dòng)子通常包含1個(gè)“TATA-box”［30］。順式作用元件和核心啟動(dòng)子可以成為轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合位點(diǎn)［31］。通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子序列的分析發(fā)現(xiàn)：NtKUP家族成員上游含有許多與激素響應(yīng)、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)以及厭氧誘導(dǎo)的調(diào)控等相關(guān)的元件識(shí)別位點(diǎn)，推測(cè)NtKUP可通過(guò)激素來(lái)對(duì)外界環(huán)境變化做出響應(yīng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，脫落酸觸發(fā)多種生理過(guò)程，如氣孔閉合、根系調(diào)節(jié)、組織土壤微生物群落、激活轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的激活以及代謝改變等多種生理過(guò)程［32］。與脫落酸相關(guān)的ABRE存在于絕大多數(shù)NtKUP家族成員當(dāng)中，推測(cè)NtKUP直接或間接參與脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)，并以此來(lái)應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化。以往的研究也表明KUP家族是最大的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鉀離子積累以維持植物生長(zhǎng)和發(fā)育方面起著至關(guān)重要

的作用［33-34］。因此可以推測(cè)NtKUP有可能通過(guò)參與脫落酸的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)響應(yīng)鉀離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

通過(guò)對(duì)不同煙草組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因各部位和器官中也有表達(dá)，但部分成員表達(dá)量極低，表達(dá)量之間和各部位之間也存在差異，大部分成員在根和花中高表達(dá)，少部分在莖和葉中高表達(dá)，且部分成員在花中表達(dá)量隨著成熟度逐漸降低［23］。在根中高表達(dá)與高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白根部吸收鉀離子特征相印證，有研究表明擬南芥KUP4最初被鑒定為微小根毛1（TRH1），是根毛擴(kuò)張和正常發(fā)育所必需的［35］。甚至還有一些KUP鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的敲除不僅影響鉀離子的獲得和易位，還影響根系形態(tài)和枝條表型，這種表型缺陷無(wú)法通過(guò)增加鉀供應(yīng)來(lái)挽救［36］。NtKUP基因家族成員還包含許多逆境脅迫應(yīng)答元件，本研究探討了NtKUP家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式；干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明，大多數(shù)基因?qū)Ω珊得{迫存在應(yīng)答，隨著脅迫時(shí)間出現(xiàn)上調(diào)、下調(diào)、先上調(diào)后下調(diào)以及先下調(diào)后上調(diào)4種情況，其次從qRT-PCR結(jié)果可以看出，在低鉀脅迫下NtKUP家族4個(gè)基因出現(xiàn)不同程度的影響，其中3個(gè)基因（KUP2、KUP4、KUP8）在低鉀處理后根中的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，且根中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉中，這更加印證了NtKUP家族大部分成員在根中參與調(diào)控。

綜上所述，本研究分析確定了煙草NtKUP基因家族的39個(gè)家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、蛋白保守結(jié)構(gòu)、染色體定位、共線(xiàn)性和表達(dá)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。確定了煙草KUP家族成員為鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，啟動(dòng)子和表達(dá)分析表明該家族在干旱、低鉀等逆境脅迫方面發(fā)揮作用。因此NtKUP基因家族可以作為研究鉀轉(zhuǎn)運(yùn)和逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制的候選基因，為煙草的遺傳與改良提供理論基礎(chǔ)，對(duì)選育優(yōu)質(zhì)的煙草品種具有重要意義。

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