摘要:轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控植物免疫響應(yīng)的關(guān)鍵因子之一。為鑒定水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及相互作用的靶基因,探究早期病原菌誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能,為水稻的免疫機(jī)制研究和抗病種質(zhì)創(chuàng)制提供理論依據(jù),利用生物信息學(xué)方法對水稻基因組中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定,通過水稻-稻瘟病菌互作轉(zhuǎn)錄組和Mfuzz表達(dá)模式特征分析,篩選受稻瘟病菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子和參與調(diào)控的功能。利用AlphaFold3對關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因構(gòu)建蛋白-DNA相互作用的復(fù)合體模型,并對轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合靶標(biāo)進(jìn)行篩選。結(jié)果在水稻中總共鑒定到1 948個轉(zhuǎn)錄因子,約89類轉(zhuǎn)錄因子。其中1、3、2、6號染色體的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目較多,分別為279、250、235、176個。共鑒定到673個轉(zhuǎn)錄因子受稻瘟病菌侵染水稻誘導(dǎo),其中主要包含11%的WRKY、11%的MYB和11%的C2H2轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原菌的相互作用和MAPK信號、響應(yīng)乙烯、響應(yīng)水楊酸、響應(yīng)茉莉酸、天然免疫和對細(xì)菌的防御響應(yīng)等功能;鑒定到集合1和集合6中的轉(zhuǎn)錄因子受病原菌特異性誘導(dǎo)后表達(dá)量持續(xù)增加;利用AlphaFold3發(fā)現(xiàn)Os5t0343400編碼的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與SIB1基因啟動子存在互作。結(jié)果表明,水稻在響應(yīng)稻瘟病菌早期侵染中,約172個轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控激素和免疫防御等途徑響應(yīng)稻瘟病菌的侵染,并預(yù)測到1個響應(yīng)病原菌的轉(zhuǎn)錄因子及作用靶標(biāo)在水稻免疫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子;稻瘟病菌;水稻;AlphaFold3;作用靶標(biāo)
中圖分類號:S435.111.4+1" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號:1002-1302(2025)04-0023-08
收稿日期:2024-11-04
基金項(xiàng)目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技服務(wù)項(xiàng)目(編號:KC23139);江蘇省徐州市科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(編號:KC21121)。
作者簡介:鳳舞劍(1976—),男,江蘇睢寧人,碩士,副教授,主要從事農(nóng)業(yè)有害生物菌原分離、鑒定及綜合防控技術(shù)研究。E-mail:fwjedu@126.com。
稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的重要病害,全球每年因?yàn)榈疚敛p失的水稻產(chǎn)量足以養(yǎng)活6 000萬人。我國每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失高達(dá)50萬t以上[1]。培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的病害防治手段。當(dāng)前,基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展,已經(jīng)成為創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)作物的重要工具。因此,探究水稻和病原菌的互作特征,挖掘水稻抗病的關(guān)鍵基因,有助于培育高產(chǎn)高抗的水稻新種質(zhì),同時(shí)也為水稻抗病育種提供理論基礎(chǔ)和資源。轉(zhuǎn)錄因子作為響應(yīng)生物脅迫功能的主調(diào)節(jié)因子,是改良作物的絕佳候選基因[2]。許多轉(zhuǎn)錄因子家族,包括 WRKY、MYB、NAC、C2H2和 bZIP,都有報(bào)道與植物響應(yīng)生物脅迫反應(yīng)有關(guān)[3]。Li等通過全基因組關(guān)聯(lián)分析在水稻中鑒定到1個保守的C2H2類轉(zhuǎn)錄因子,通過結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子MYB進(jìn)而抑制H2O2的降解,最終賦予水稻廣譜抗病能力[4]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是應(yīng)對病原體感染的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在棉花中,WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)GhMYC2介導(dǎo)的類黃酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá),激活GhMKK2-GhNTF6通路從而增強(qiáng)棉花對尖孢鐮刀菌的抗性[5]。在谷子中鑒定到SiMYB041、SiMYB074、SiMYB100、SiMYB177和SiMYB202基因在抗銹病過程中發(fā)揮重要作用[6]。由大麥柄銹菌(Puccinia hordei Otth.)侵染水稻引起的葉銹病是影響大麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害。Chen等通過精細(xì)定位鑒定的NAC轉(zhuǎn)錄因子Rph7,通過介導(dǎo)大麥的基礎(chǔ)防御反應(yīng)增強(qiáng)大麥對葉銹病的抗性[7]。AlphaFold2和RoseTTAFold人工智能工具的出現(xiàn),加速了對功能機(jī)制的研究。Xu等利用AlphaFold2對脂質(zhì)生物合成結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測。Xia等利用AlphaFold重新設(shè)計(jì)了一種植物果膠甲基酯酶抑制劑,以實(shí)現(xiàn)對真菌和卵菌的廣譜抗病性[8]。
人工智能(AI)作為一種新興的工具可以應(yīng)用到植物育種領(lǐng)域的多個方面,能有效提高預(yù)測、挖掘植物育種數(shù)據(jù)等多方面的應(yīng)用潛力[9-10]。當(dāng)前,對于植物早期響應(yīng)病原菌侵染的核心轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的鑒定策略研究較少。生物信息學(xué)和人工智能工具的交叉聯(lián)用已經(jīng)逐漸成為植物功能研究利器,能極大效率完成對核心功能基因的挖掘。本研究擬通過生物信息學(xué)和人工智能工具AlphaFold3對水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的核心轉(zhuǎn)錄因子和靶基因進(jìn)行鑒定,分析水稻轉(zhuǎn)錄因子早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染的功能。
1 材料與方法
1.1 水稻基因組和轉(zhuǎn)錄組的獲取
水稻基因組由Rap-db(The Rice Annotation Project Database)水稻數(shù)據(jù)庫(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/news.html)下載獲得,包括全基因組蛋白質(zhì)序列文件和全基因組包含上游2 kb的啟動子序列文件。水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),具體是將稻瘟病菌的分生孢子懸浮液(1×105 個/mL)噴施至水稻的葉鞘,分別選取稻瘟病菌侵染0、18、27、36、45、72 h的樣本用于轉(zhuǎn)錄組測序(PRJNA179498)。
1.2 水稻轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測
將水稻全基因組的蛋白質(zhì)序列上傳至植物轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測數(shù)據(jù)庫iTAK(http://itak.feilab.net/cgi-bin/itak/index.cgi) 進(jìn)行水稻全基因組的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測[11]。
1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析
首先使用eggNOG-Mapper(http://eggnog-mapper.embl.de/)數(shù)據(jù)庫對水稻全基因組蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測[12]。利用R軟件包Tidyverse包(https://cran.r-project.org/web/packages/tidyverse/index.html)對注釋完的GO功能和KEGG通路基因文件進(jìn)行整理[13]。隨后利用TBtools進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析[14-16]。對于基因的表達(dá)模式分析,使用R軟件包Mfuzz包(https://bioconductor.org/packages//2.7/bioc/html/Mfuzz.html)進(jìn)行表達(dá)模式的聚類分析[17]。
1.4 轉(zhuǎn)錄組因子靶基因預(yù)測
將候選轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)序列上傳至轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫JASPAR(https://jaspar.elixir.no/)進(jìn)行靶基因特征的預(yù)測。使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt對候選轉(zhuǎn)錄因子的靶基因互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測[18]。
1.5 AlphaFold3預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子的靶基因
使用AlphaFold3對潛在的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因進(jìn)行預(yù)測。將候選轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)序列與潛在靶基因的啟動子序列上傳AlphaFold3蛋白-分子互作預(yù)測數(shù)據(jù)庫(https://alphafoldserver.com/)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的靶基因預(yù)測[19]。利用Chemira對轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的啟動子結(jié)合模型進(jìn)行可視化分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 水稻轉(zhuǎn)錄因子篩選
為了鑒定水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄因子,首先使用iTAK數(shù)據(jù)庫對水稻基因組中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測,總共鑒定到1 948個轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子歸屬于89類(圖1-A)。其中MYB型、bHLH型、ERF型、C2H2型、NAC型、WRKY型和bZIP型轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目在水稻基因組存在比較多,分別為168、118、113、108、98、85、80個。隨后對水稻上每條染色體上的轉(zhuǎn)錄因子的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其中1號染色體上的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目最多,為279個,約占轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的14.32%;其次分別是3號、2號、6號和4號染色體,轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目分別為250、235、176、174個(圖1-B)。隨后對1號、2號、3號和6號染色體上的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖1-C),發(fā)現(xiàn)MYB(11%)、WRKY(10%)和bHLH(10%)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目最多;2號染色體主要為AP2/ERF(14%)、bHLH(10%)和MYB(8%);3號染色體主要為bHLH(10%)、C2H2(10%)和B3(8%);6號染色體主要為bHLH(8%)、NAC(8%)和bZIP(8%)。
2.2 水稻響應(yīng)稻瘟菌的轉(zhuǎn)錄因子篩選
利用水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組對關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選。熱圖分析發(fā)現(xiàn)有673個轉(zhuǎn)錄因子在病原菌侵染后表達(dá)量顯著增加(圖2-A)。對水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)有11%WRKY、11%的MYB和11%的C2H2轉(zhuǎn)錄因子在病原菌侵染后被誘導(dǎo)表達(dá)(圖2-B)。為了探究病原菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因功能,對這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行KEGG通路和GO功能進(jìn)行富集分析。在KEGG通路富集分析中發(fā)現(xiàn)植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原菌的相互作用和MAPK信號等通路顯
著富集(圖2-C)。在對篩選的病原菌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、響應(yīng)乙烯、響應(yīng)水楊酸、響應(yīng)茉莉酸、天然免疫和對細(xì)菌的防御響應(yīng)等功能顯著富集(圖2-D)。該結(jié)果表明在稻瘟菌侵染水稻早期,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的激素通路是抵御稻瘟病菌侵染的重要武器。
2.3 水稻響應(yīng)稻瘟菌侵染的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子篩選
為了鑒定水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的核心轉(zhuǎn)錄因子,對潛在轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)特征進(jìn)行分析,總共鑒定到6個不同表達(dá)趨勢的基因集合,其中集合1和集合6中的轉(zhuǎn)錄因子在稻瘟病菌侵染后表達(dá)量顯著增加,表明這些轉(zhuǎn)錄因子受病原菌特異性誘導(dǎo)(圖
3-A)。對集合1和集合6中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行GO功能富集分析,2個基因集總共鑒定到152個功能因子,其中激素響應(yīng)、DNA結(jié)合、幾丁質(zhì)響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、茉莉酸響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能顯著富集(圖3-B,圖3-C)。對這集合1和集合 6中的富集到152個GO功能的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在集合1中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目最多(圖3-D),約為16.98%,其次是bZIP(15.09%)、MYB(13.21%)和NAC(13.21%);Cluster 6中WRKY和C2H2轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目最多,約為13.64%,其次是bZIP(11.36%)和MYB(11.36%)轉(zhuǎn)錄因子。
2.4 核心轉(zhuǎn)錄因子的靶基因鑒定
鑒定到8個轉(zhuǎn)錄因子在水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染中表達(dá)量大量增加(圖4-A)。對Os5t0343400編碼的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進(jìn)行預(yù)測,通過JASPAR預(yù)測發(fā)現(xiàn)Os5t0343400存在4個結(jié)合基序,主要結(jié)合基序特征為GTCAA(圖4-B)。使用UniProt對Os5t0343400的靶基因進(jìn)行預(yù)測,總共預(yù)測到10個潛在調(diào)控的靶基因(圖4-C)。為了鑒定Os5t0343400潛在的關(guān)鍵靶基因,利用AlphaFold3對Os5t0343400和8個高親和的靶基因的啟動子結(jié)合特征進(jìn)行了模型構(gòu)建,分析發(fā)現(xiàn)Os5t0343400編碼的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與SIB1基因啟動子可信性較高,ipTM和pTM分別為0.49和0.42(圖4-D),該結(jié)果表明SIB1可能為Os5t0343400的靶基因。
3 討論
稻瘟病作為水稻的一大病害,嚴(yán)重影響著我國的糧食安全。而植物與病原體之間的相互作用中,轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)的中心調(diào)節(jié)因子對于植物抵御病原菌的侵染至關(guān)重要。因此,對于水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染的挖掘仍需進(jìn)一步探究,其早期病原菌響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的挖掘?qū)τ谒究沟疚敛〔牧系膭?chuàng)制和抗病機(jī)制的研究具有重要意義。
3.1 水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄因子鑒定
轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、功能代謝和應(yīng)對脅迫等中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[20-21]。植物在抵御病原菌的侵染過程中,PTI免疫和ETI發(fā)揮著重要作用。而在PTI和ETI發(fā)揮功能的過程中,轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)是調(diào)節(jié)這些防御機(jī)制的必要條件[22]。在水稻中,轉(zhuǎn)錄因子HOS59通過抑制水稻中NLR免疫受體BRG8介導(dǎo)的免疫反應(yīng),賦予水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性[23]。轉(zhuǎn)錄因子IPA1是水稻理想株型建成的關(guān)鍵基因,當(dāng)感知稻瘟病菌侵染時(shí),IPA1通過磷酸化Ser163位點(diǎn),通過結(jié)合抗病基因WRKY45的啟動子從而增強(qiáng)水稻的抗病性[24]。在本研究中,對水稻響應(yīng)稻瘟菌菌侵染的轉(zhuǎn)錄因子中,鑒定到WRKY、MYB、C2H2、bZIP和NAC等轉(zhuǎn)錄因子受稻瘟病菌的侵染后表達(dá)量顯著增加。同時(shí)在基因表達(dá)模式特征的鑒定中,發(fā)現(xiàn)
WRKY、MYB、C2H2、bZIP和NAC等轉(zhuǎn)錄因子隨著稻瘟病菌侵染時(shí)間的增加,表達(dá)量持續(xù)增加,該結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)錄因子在水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染中發(fā)揮重要作用。而WRKY、MYB、C2H2、bZIP和NAC等轉(zhuǎn)錄因子已在植物抗病中被廣泛報(bào)道。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MYB44是MPK3和MPK6觸發(fā)的免疫級聯(lián)調(diào)控所必需的,MYB44通過促進(jìn)級聯(lián)信號的表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥的PTI免疫[25]。稻瘟病菌侵染可以誘導(dǎo)OsWRKY7的表達(dá),過表達(dá)OsWRKY7賦予水稻對真菌稻瘟病菌和細(xì)菌白葉枯病菌的抗性[26]。
3.2 水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄因子的功能調(diào)控
轉(zhuǎn)錄因子通常通過調(diào)節(jié)或激活激素、抗病相關(guān)蛋白和抗病分子的積累增強(qiáng)植物的抗病性。在柿樹中DkWRKY8和DkWRKY10轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合DkCAD1的啟動子,通過增加葉片中木質(zhì)素的積累賦予柿樹對炭疽病的抗性[27]。在水稻中,鑒定發(fā)現(xiàn)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH6能夠與OsNPR1和OsMYC2相互作用,進(jìn)而調(diào)控植物激素水楊酸和茉莉酸,增強(qiáng)水稻抗病能力[28]。漸狹葉煙草中的轉(zhuǎn)錄因子NaWRKY70參與茉莉酸和乙烯信號的協(xié)同調(diào)控,同時(shí)也會促進(jìn)植保素含量的增加增強(qiáng)植物抗病力[29]。在本研究中,對cluster 1和cluster 6中表達(dá)量持續(xù)增加的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能富集,發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物激素和免疫防御等途徑。表明激素在植物早期免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。WRKY、MYB、NAC和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子均有報(bào)道與植物激素的生物合成和信號傳導(dǎo)有關(guān)[30-33],本研究結(jié)果與之一致。
3.3 稻瘟病菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因鑒定
轉(zhuǎn)錄因子作為中間因子需要激活下游的靶基因發(fā)揮免疫功能。在本研究中,利用生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)對稻瘟病菌響應(yīng)型轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進(jìn)行了篩選和預(yù)測。發(fā)現(xiàn)水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子Os5t0343400在響應(yīng)稻瘟病菌侵染中表達(dá)量持續(xù)增加,預(yù)測發(fā)現(xiàn)Os5t0343400的靶基因大多數(shù)包含VQ域,利用AlphaFold3預(yù)測發(fā)現(xiàn)Os5t0343400與SIB1基因的啟動子結(jié)合性最高。已有研究表明WRKY57可以與SIB1相互作用,增強(qiáng)擬南芥對灰霉菌的抗性[34]。人工智能工具已逐步在植物功能的研究中大放光彩,AlphaFold2、AlphaFold3和RoseTTAFold工具的出現(xiàn),加速了對未來蛋白結(jié)構(gòu)的特征解析和挖掘,同時(shí)也對蛋白和蛋白、分子和DNA、RNA的互作提供了有利的支持。Homma等利用AlphaFold-Multimer對番茄中的6個免疫相關(guān)水解酶和7種番茄病原菌分泌的1 879個胞間效應(yīng)蛋白進(jìn)行復(fù)合物的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)了15個新型的水解酶-抑制子的復(fù)合物模型,并發(fā)現(xiàn)4個新型抑制子蛋白可以顯著抑制水解酶P69B的活性[35]。Xia等利用AlphaFold結(jié)構(gòu)復(fù)合體預(yù)測工具,依據(jù)GmPMI1的特征設(shè)計(jì)了一種可以特異性靶向并抑制病原體分泌的果膠甲酯酶,而不影響植物自身與植物生長發(fā)育相關(guān)的果膠甲酯酶[9]。人工智能工具的快速發(fā)展,將極大促進(jìn)植物功能機(jī)制的研究和加速作物分子育種的速度。
4 結(jié)論
在水稻中共鑒定到172個轉(zhuǎn)錄因子受稻瘟病菌侵染所誘導(dǎo),主要為WRKY、MYB、C2H2、bZIP和NAC等轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子在水稻中主要通過調(diào)控激素代謝和免疫防御等功能響應(yīng)稻瘟病菌的侵染,同時(shí)鑒定到SIB1是WRKY轉(zhuǎn)錄因子Os5t0343400在早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染中的一個潛在靶標(biāo)。
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