摘 要：為了解不同貯藏溫度下調(diào)理牛排微生物多樣性和細(xì)菌之間的相互作用關(guān)系，比較分析冷藏（4 ℃）和脫冷貯藏（15 ℃）牛排菌群結(jié)構(gòu)。將新鮮調(diào)理牛排進(jìn)行冷藏（4 ℃）和脫冷貯藏（15 ℃），基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)分析不同貯藏溫度下過(guò)保質(zhì)期牛排菌群動(dòng)態(tài)變化和相互作用。結(jié)果表明，牛排4 ℃貯藏下的菌落總數(shù)（7.4×108 CFU/g）極顯著低于15 ℃（5.2×109 CFU/g）（P＜0.001）。菌群動(dòng)態(tài)變化結(jié)果表明，冷藏或脫冷貯藏不影響牛排菌群組成，但優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生更替。肉桿菌屬（Carnobacterium）、彎曲乳桿菌屬（Latilactobacillus）及假單胞菌屬（Pseudomonas）是2 種貯藏溫度下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬。索絲菌屬（Brochothrix）僅為4 ℃貯藏下的優(yōu)勢(shì)菌屬，沙雷氏菌屬（Serratia）僅為15 ℃貯藏下的優(yōu)勢(shì)菌屬。菌屬豐度相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中PageRank＞0.4且出現(xiàn)頻率最高的菌屬分別為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和索絲菌屬。不動(dòng)桿菌屬與沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、索絲菌屬，沙雷氏菌屬與索絲菌屬，索絲菌屬與假單胞菌屬相對(duì)豐度在特定貯藏溫度和時(shí)間下存在相關(guān)性，這表明牛排腐敗菌之間存在潛在種間相互作用。索絲菌屬、彎曲乳桿菌屬及假單胞菌屬可能是牛排優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

關(guān)鍵詞：貯藏溫度；高通量測(cè)序技術(shù)；微生物多樣性；種間相互作用

Dynamic Changes and Interactions of Bacterial Communities in Processed Beef Steak at Different Storage Temperatures

SHI Na1， XING Chao1， SONG Liping1， MAO Ting2， DU Jianping1， LI Long3， GENG Jianqiang1，*， SUN Xiaodong1， YANG Limei1， LI Li1

（1. Beijing Institute of Food Inspection and Research （Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment）， Laboratory of Key Technologies of Major Comprehensive Guarantee of Food Safety for State Administration for Market Regulation， Beijing 100094， China; 2. Beijing Inspection and Testing Certification Center， Beijing 101300， China;

3. Beijing Institute of Metrology and Testing Science， Beijing 100029， China）

Abstract： In this study， we aimed to understand the bacterial diversity and interactions in processed beef steak at different storage temperatures. Comparative analysis of the bacterial community structure in chilled （4 ℃） and non-chilled （15 ℃） steak was performed， and the dynamic changes and interactions of bacterial communities in spoiled meat during storage at different temperatures after shelf life were analyzed using traditional microbial culture method and high throughput sequencing technology. The results showed that the total number of colonies was significantly lower at 4 ℃ than that at 15 ℃ （7.4 × 108 CFU/g versus 5.2 × 109 CFU/g） （P lt; 0.001）. The microbiota in steak was unaffected by storage temperature， but the dominant bacterial genera varied. Carnobacterium， Latilactobacillus and Pseudomonas were the dominant spoilage genera at both storage temperatures， Brochothrix being the only dominant genus at 4 ℃ and Serratia at 15 ℃. The results of microbial community abundance correlation network analysis showed that the genera with the highest frequency of occurrence at

PageRank gt; 0.4 were Acinetobacter and Brochothrix. There was a correlation between the relative abundance of Acinetobacter and that of Serratia， Pseudomonas， and Brochothrix， between the relative abundance of Serratia and that of Brochothrix， and between the relative abundance of Brochothrix and that of Pseudomonas at a certain storage temperature and time， indicating a potential interaction between steak spoilage bacteria. Brochothrix， Latilactobacillus and Pseudomonas may be dominant spoilage bacteria in steak.

Keywords： storage temperature; high throughput sequencing technology; bacterial diversity; inter-species interactions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241016-264

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.52 " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2025）04-0030-10

引文格式：

史娜， 邢超， 宋麗萍， 等. 不同貯藏溫度下調(diào)理牛排菌群動(dòng)態(tài)變化和相互作用[J]. 肉類(lèi)研究， 2025， 39（4）： 30-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241016-264. " "http：//www.rlyj.net.cn

SHI Na， XING Chao， SONG Liping， et al. Dynamic changes and interactions of bacterial communities in processed beef steak at different storage temperatures[J]. Meat Research， 2025， 39（4）： 30-39. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241016-264. " "http：//www.rlyj.net.cn

2022年，中國(guó)牛肉市場(chǎng)消費(fèi)量為9 86.1萬(wàn) t，位居全球第二。在牛排、生冷鮮牛肉、牛肉卷、牛肉丸等眾多牛肉產(chǎn)品中，國(guó)民對(duì)牛排的消費(fèi)熱情持續(xù)升高。據(jù)《2022年牛排消費(fèi)趨勢(shì)洞察》報(bào)告顯示，2021年線上牛排消費(fèi)增速持續(xù)上漲，同比增長(zhǎng)7 倍。牛肉中的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠?yàn)槲⑸锾峁┥L(zhǎng)條件，如假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等，這些微生物可導(dǎo)致牛肉腐敗[1-4]。因此，腐敗微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)引起的牛肉腐敗成為肉類(lèi)工業(yè)的關(guān)注熱點(diǎn)。

貯藏溫度是影響鮮肉貨架期的主要因素[5]。目前，冷藏與冷凍是最常用的2 種肉類(lèi)貯藏方式，其對(duì)應(yīng)溫度范圍分別為0～10、－18～－20 ℃[6]。盡管大多數(shù)國(guó)家已經(jīng)規(guī)定了食品最高貯藏溫度限值，但據(jù)報(bào)道，由于配送系統(tǒng)、運(yùn)輸距離和時(shí)間的不穩(wěn)定性，運(yùn)輸過(guò)程中的溫度可能達(dá)到10 ℃甚至更高。這種不受控制的溫度條件可能會(huì)顯著縮短肉類(lèi)貨架期[7-8]。而且，一些鄉(xiāng)村市場(chǎng)的肉類(lèi)仍然在室溫下露天保存，這無(wú)疑會(huì)增加肉類(lèi)變質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此，有必要更深入地了解不同貯藏溫度下肉品中的微生物組成動(dòng)態(tài)變化及其相互作用。

高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)為食品中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)細(xì)菌的研究提供了高效的分析工具，使全面描述菌群的動(dòng)態(tài)變化、分析微生物代謝活動(dòng)與肉類(lèi)腐敗之間的相關(guān)性成為可能[10-11]。目前，已有關(guān)于采用高通量測(cè)序技術(shù)表征肉類(lèi)腐敗中微生物組成的報(bào)道[12]，然而肉類(lèi)菌群組成在不同貯藏溫度下的差異較大。目前，大多數(shù)研究集中在不同冷藏或過(guò)冷溫度（包括4、－1、－2、－3 ℃）或不同包裝方式（如氣調(diào)包裝）對(duì)菌群的影響[6，13-14]，比較脫冷貯藏下肉類(lèi)菌群組成和種間相互作用的研究較為少見(jiàn)。

本研究將新鮮調(diào)理牛排分別進(jìn)行冷藏（4 ℃）和脫冷貯藏（15 ℃），評(píng)估不同貯藏溫度與時(shí)間對(duì)牛排菌群組成的影響，旨在深入了解貯藏溫度對(duì)牛排菌群及菌種之間潛在相互作用的影響，確定牛排的關(guān)鍵致腐微生物。

1 材料與方法

1.1 材料

在北京大型商超采買(mǎi)3 個(gè)品牌的調(diào)理牛排（F1、F2、F3），共63 個(gè)樣品（每種品牌各21 個(gè)），樣品出廠日期均為當(dāng)天，保質(zhì)期2 d。

1.2 儀器與設(shè)備

BagMixer 400稀釋用電子秤、DiluFow基本型均質(zhì)器 " 法國(guó)Interscience公司；HPX-25085-III恒溫恒濕箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

因從保質(zhì)期內(nèi)牛排中鑒定的高豐度細(xì)菌無(wú)法與腐敗建立有效聯(lián)系，因此本研究以不同溫度下長(zhǎng)時(shí)間貯藏至過(guò)保質(zhì)期的調(diào)理牛排為樣品，分別在冷藏（4 ℃）、脫冷（15 ℃）條件下貯藏，在保質(zhì)期結(jié)束當(dāng)天、過(guò)保質(zhì)期3 d及過(guò)保質(zhì)期6 d取樣，進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定和16S rRNA基因高通量測(cè)序。

1.3.2 菌落總數(shù)測(cè)定

參考GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.3 16S rRNA基因高通量測(cè)序

1.3.3.1 PacBio文庫(kù)制備和測(cè)序

提取樣品總DNA后，根據(jù)全長(zhǎng)引物序列合成帶有Barcode的特異性引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成的測(cè)序文庫(kù)（SMRT Bell）質(zhì)檢合格后，采用PacBio Sequel II進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為CCS文件后，使用Lima v1.7.0軟件，通過(guò)Barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別，得到Raw-CCS序列數(shù)據(jù)。使用Cutadapt 1.9.1軟件對(duì)引物序列進(jìn)行識(shí)別與去除，并進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列。使用UCHME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective-CCS序列。

1.3.3.3 α-多樣性、主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）及屬水平網(wǎng)絡(luò)分析α-多樣性、PCoA及屬水平分布分析在BMKCloud中完成。其中，α-多樣性分類(lèi)水平選擇屬，組間差異檢驗(yàn)方法選擇Student’s t-test；PCoA分類(lèi)水平選擇屬；屬水平分布分析選擇相對(duì)豐度前10。屬水平豐度相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖基于R包igraph實(shí)現(xiàn)[15]，物種數(shù)量選擇前30，相關(guān)性類(lèi)型選擇Spearman，相關(guān)系數(shù)閾值選擇|0.6|，顯著性水平選擇0.05。采用Gephi v.0.9.2對(duì)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖的圖密度和PageRank值進(jìn)行計(jì)算，圖密度反映菌屬之間相互作用程度，圖密度越大，表示菌屬之間相互作用越頻繁[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，多組間數(shù)據(jù)比較使用SPSS 24.0中方差分析的鄧肯多重范圍檢驗(yàn)。使用R v.4.0.2軟件的Hmisc包對(duì)屬水平相對(duì)豐度的Pearson相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)理牛排菌落總數(shù)

由圖1a可知，4 ℃貯藏下，菌落總數(shù)為7.4×108 CFU/g，顯著低于15 ℃貯藏下菌落總數(shù)（5.2×109 CFU/g），脫冷貯藏下調(diào)理牛排的菌落總數(shù)極顯著升高（P＜0.001），加速了其腐敗變質(zhì)進(jìn)程。

由圖1b～d可知，F(xiàn)1在出廠當(dāng)天菌落總數(shù)為4.3×106 CFU/g。4 ℃和15 ℃貯藏下，在保質(zhì)期當(dāng)天，F(xiàn)1菌落總數(shù)分別為4.3×108 CFU/g和1.1×109 CFU/g；在過(guò)保質(zhì)期3 d，F(xiàn)1菌落總數(shù)分別為1.5×109 CFU/g和1.0×109 CFU/g；在過(guò)保質(zhì)期6 d，F(xiàn)1菌落總數(shù)分別為6.1×108 CFU/g和1.3×109 CFU/g。F2在出廠當(dāng)天菌落總數(shù)為1.0×106 CFU/g。4 ℃和15 ℃貯藏下，在保質(zhì)期當(dāng)天，F(xiàn)2菌落總數(shù)分別為5.0×106 CFU/g和2.5×108 CFU/g；

在過(guò)保質(zhì)期3 d，F(xiàn)2菌落總數(shù)分別為7.8×106 CFU/g和4.9×109 CFU/g；在過(guò)保質(zhì)期6 d，F(xiàn)2菌落總數(shù)分別為8.5×108 CFU/g和7.9×109 CFU/g。F3在出廠當(dāng)天菌落總數(shù)為2.3×107 CFU/g。4 ℃和15 ℃貯藏下，在保質(zhì)期當(dāng)天，F(xiàn)3菌落總數(shù)分別為2.3×108 CFU/g和1.2×1010 CFU/g；

在過(guò)保質(zhì)期3 d，F(xiàn)3菌落總數(shù)分別為1.0×109 CFU/g和9.1×109 CFU/g；在過(guò)保質(zhì)期6 d，F(xiàn)3菌落總數(shù)分別為1.7×109 CFU/g和5.9×109 CFU/g。目前，我國(guó)尚未針對(duì)生肉制定統(tǒng)一的菌落總數(shù)限量指標(biāo)。歐盟、美國(guó)及日本規(guī)定每克牛肉需氧平板計(jì)數(shù)約在5.0×106 CFU/g以下，視為合格。由上述結(jié)果可知，本研究所取調(diào)理牛排F1和F2菌落總數(shù)在出廠當(dāng)天均小于該限值，F(xiàn)3菌落總數(shù)則大于該限值。在保質(zhì)期當(dāng)天，僅4 ℃貯藏的F2菌落總數(shù)符合該限值標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)1和F3菌落總數(shù)均大于該限值。15 ℃貯藏下的牛排細(xì)菌生長(zhǎng)更快，可加速牛排腐敗變質(zhì)。

2.2 調(diào)理牛排菌群α-多樣性

α-多樣性反映牛排菌群物種豐富度和多樣性[11]。Shannon指數(shù)用以描述菌群多樣性。Chao1指數(shù)用以描述菌群物種豐富度，其值越高，菌群物種豐富度越高。由表1、2可知，不同貯藏溫度和時(shí)間下，F(xiàn)1、F2、F3菌群多樣性均未發(fā)生顯著改變，這表明初始菌群中的部分細(xì)菌參與了牛排的腐敗變質(zhì)過(guò)程，多種適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)菌在牛排腐敗過(guò)程依然保持生長(zhǎng)與繁殖。值得注意的是，F(xiàn)2菌群豐富度在一定程度上受到貯藏時(shí)間和溫度的影響，但與對(duì)照組相比差異不顯著。

2.3 調(diào)理牛排菌群屬水平相對(duì)豐度

本研究選擇相對(duì)豐度排名前10的菌屬（占總菌屬豐度的90%以上，為優(yōu)勢(shì)菌屬）進(jìn)行相對(duì)豐度分析。由圖2a可知，在出廠當(dāng)天，F(xiàn)1中相對(duì)豐度排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（52.4%）、肉桿菌屬（Carnobacterium）（15.3%）、索絲菌屬（Brochothrix）（13.5%）；F2中相對(duì)豐度排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為彎曲乳桿菌屬（Latilactobacillus）（34.8%）、肉桿菌屬（29.0%）、索絲菌屬（10.0%）；F3中相對(duì)豐度排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為肉桿菌屬（46.2%）、彎曲乳桿菌屬（20.1%）、索絲菌屬（12.6%）。其中，嗜冷桿菌屬、彎曲乳桿菌屬及肉桿菌屬分別為3 種牛排出廠時(shí)相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬。肉桿菌屬和索絲菌屬在3 種牛排中均為優(yōu)勢(shì)菌屬。Liang Ce等[6]對(duì)不同貯藏溫度下新鮮羊肉菌群變化的研究顯示，冷藏（4 ℃）和過(guò)冷（－1.5 ℃）貯藏下索絲菌屬為優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬，嗜冷桿菌屬則為超冷（－4 ℃）和超冷凍

（－9 ℃）貯藏下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬。Fang Jinyu等[17]研究表明，Brochothrix thermosphata BT27為4 ℃好氧貯藏條件下牛肉的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。由此可見(jiàn)，本研究中出廠當(dāng)天牛排已存在報(bào)道的腐敗菌屬。

a.出廠當(dāng)天；b、c.分別為4 ℃和15 ℃貯藏下保質(zhì)期當(dāng)天；d、e.分別為4 ℃和15 ℃貯藏下過(guò)保質(zhì)期3 d；f、g.分別為4 ℃和15 ℃下過(guò)保質(zhì)期6 d。圖3、4、6、7同。

圖 2 不同貯藏溫度和時(shí)間下調(diào)理牛排優(yōu)勢(shì)菌屬分布

Fig. 2 Distribution of dominant bacterial genera in processed beef steak at different temperatures and times

由圖2b、c可知，在保質(zhì)期當(dāng)天，與4 ℃貯藏相比，脫冷貯藏并不影響F1、F2與F3的菌群組成，但不同貯藏溫度下牛排優(yōu)勢(shì)菌屬存在差異。具體地，4 ℃貯藏F1中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬為索絲菌屬（34.1%），F(xiàn)2、F3中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬均為彎曲乳桿菌屬（F2：56.5%，F(xiàn)3：61.1%）；15 ℃貯藏下F1、F3中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬均為彎曲乳桿菌屬（F1：41.8%，F(xiàn)3：74.9%），F(xiàn)2中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬為肉桿菌屬（63.2%）。

由圖2d、e可知，在過(guò)保質(zhì)期3 d時(shí)，4 ℃和15 ℃貯藏下牛排均已徹底腐敗。4 ℃貯藏F1、F2、F3中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為索絲菌屬（51.5%）、肉桿菌屬（67.0%）、彎曲乳桿菌屬（43.8%），這與出廠當(dāng)天、保質(zhì)期當(dāng)天牛排的優(yōu)勢(shì)菌屬類(lèi)似。15 ℃貯藏F1、F2、F3中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為彎曲乳桿菌屬（40.2%）、假單胞菌屬（78.3%）、沙雷氏菌屬（Serratia）（30.2%），表明過(guò)保質(zhì)期后15 ℃貯藏牛排的優(yōu)勢(shì)腐敗菌發(fā)生改變。

由圖2f、g可知，過(guò)保質(zhì)期6 d時(shí)，隨著腐敗程度的增加，4 ℃貯藏F1、F3中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬均為索絲菌屬（F1：54.8%，F(xiàn)3：32.1%），F(xiàn)2中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬（86.8%）；15 ℃貯藏F1、F3中相對(duì)豐度最高的則為彎曲乳桿菌屬（F1：41.3%，F(xiàn)3：33.9%），F(xiàn)2中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬仍為假單胞菌屬（45.9%）。

對(duì)比可知，4 ℃貯藏時(shí)，F(xiàn)1中的索絲菌屬豐度逐漸升高，而15 ℃貯藏時(shí)，F(xiàn)1中的彎曲乳桿菌屬則始終為相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬；F2中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬的出現(xiàn)受冷藏影響呈現(xiàn)滯后性，即假單胞菌屬在過(guò)保質(zhì)期6 d時(shí)成為相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬，而在15 ℃貯藏時(shí)這一現(xiàn)象過(guò)保質(zhì)期3 d便已出現(xiàn)。F3中優(yōu)勢(shì)菌屬在2 種貯藏條件下呈現(xiàn)類(lèi)似的動(dòng)態(tài)演替，即在保質(zhì)期當(dāng)天出現(xiàn)相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，更多細(xì)菌出現(xiàn)相對(duì)豐度增高的現(xiàn)象。肉類(lèi)涉及分切、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等諸多環(huán)節(jié)，可能導(dǎo)致樣品中不同細(xì)菌豐度存在差異[18-20]。然而，本研究所抽取的F1和F3中的菌群結(jié)構(gòu)在4 ℃和15 ℃貯藏下比較穩(wěn)定，優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度變化明顯，未引入新的優(yōu)勢(shì)菌屬。這可能是由于從生產(chǎn)到銷(xiāo)售過(guò)程中F1和F3處于較為穩(wěn)定的環(huán)境，而F2在貯藏過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生改變，可能是由細(xì)菌種間的相互作用引起的生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致。

2.4 調(diào)理牛排菌群PCoA

由圖3可知，在出廠當(dāng)天，3 個(gè)品牌牛排樣品的置信區(qū)間相交，表明此時(shí)各樣品菌群組成相似。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4 ℃和15 ℃下，F(xiàn)1、F2、F3牛排樣品各自聚類(lèi)，表明3 個(gè)品牌的牛排菌群組成出現(xiàn)差異。

2.5 調(diào)理牛排菌群屬水平豐度相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)

為探究腐敗過(guò)程中低豐度菌屬與高豐度細(xì)菌屬之間的相關(guān)性，對(duì)F1、F2、F3菌屬相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，以相對(duì)豐度前30的菌屬構(gòu)建豐度相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。

由圖5可知，保質(zhì)期當(dāng)天、過(guò)保質(zhì)期3 d與過(guò)保質(zhì)期6 d牛排在4 ℃和15 ℃下的菌屬豐度相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖的圖密度均高于出廠當(dāng)天，表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌之間豐度變化更為復(fù)雜。此外，4 ℃貯藏下，相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖的圖密度明顯大于15 ℃，這表明4 ℃貯藏牛排中細(xì)菌之間的相互作用更加頻繁與復(fù)雜。

性[21-23]。由圖6可知，PageRank值排名前5的菌屬中，不動(dòng)桿菌屬和索絲菌屬出現(xiàn)頻率最高，共在5 個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中出現(xiàn)。不動(dòng)桿菌屬在4 ℃下的2 個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中出現(xiàn)。雖然不動(dòng)桿菌屬并不是優(yōu)勢(shì)菌屬，但相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示其重要性，強(qiáng)調(diào)非優(yōu)勢(shì)菌屬在牛排腐敗進(jìn)程中也具有關(guān)鍵作用。已有研究[24-27]表明，不動(dòng)桿菌屬能夠造成冷藏期間南美白對(duì)蝦、金槍魚(yú)、冰鮮雞肉及水煮小龍蝦等多種食品基質(zhì)腐敗。

微生物群落并非由眾多微生物簡(jiǎn)單拼湊而成，而是不同物種間通過(guò)資源競(jìng)爭(zhēng)、代謝互補(bǔ)、信號(hào)交流和基因水平轉(zhuǎn)移等相互作用形成的高度復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。微生物群落在地球化學(xué)元素馴化、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)健康等領(lǐng)域承擔(dān)著重要功能[28-29]。在食品領(lǐng)域，微生物平衡體系與食品腐敗密切相關(guān)。Andreevskaya等[30]探究3 種嗜冷乳酸菌（Leuconostoc gelidum、Lactococcus piscium和Lactobacillus oligofermentans）在肉類(lèi)腐敗中的相互作用發(fā)現(xiàn)，3 種嗜冷乳酸菌的種間相互作用強(qiáng)烈影響碳水化合物分解代謝/運(yùn)輸、發(fā)酵、能量產(chǎn)生和翻譯相關(guān)基因表達(dá)。Joishy等[31]通過(guò)構(gòu)建生凝乳（由生乳制備的凝乳）、煮沸乳與凝乳的核心細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，凝乳中Lactobacillus豐度具有優(yōu)勢(shì)，且與Enterococcus、Streptococcus及Leuconostoc豐度呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)與其內(nèi)部存在生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)。對(duì)與相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)菌屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)正/負(fù)相關(guān)的菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由圖7可知，優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬相對(duì)豐度和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)菌屬相對(duì)豐度之間存在相關(guān)性。例如，出廠當(dāng)天牛排菌群相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中，不動(dòng)桿菌屬與沙雷氏菌屬相對(duì)豐度相關(guān)性為0.72，保質(zhì)期當(dāng)天（4 ℃）的不動(dòng)桿菌屬與假單胞菌屬、索絲菌屬相對(duì)豐度相關(guān)性分別為0.75、0.78，沙雷氏菌屬和索絲菌屬相v對(duì)豐度相關(guān)性為0.75。4 ℃貯藏下，過(guò)保質(zhì)期3 d時(shí)不動(dòng)桿菌屬與索絲菌屬相對(duì)豐度相關(guān)性為0.83，過(guò)保質(zhì)期6 d時(shí)不動(dòng)桿菌屬與假單胞菌屬、索絲菌屬的相關(guān)性分別為－0.87、0.80；15 ℃貯藏下，過(guò)保質(zhì)期3 d時(shí)索絲菌屬與假單胞菌屬相對(duì)豐度相關(guān)性為－0.83。這表明致腐細(xì)菌在牛排腐敗過(guò)程中可能存在相互作用。值得注意的是，4 ℃貯藏下，保質(zhì)期當(dāng)天不動(dòng)桿菌和假單胞菌相對(duì)豐度呈現(xiàn)正相關(guān)性，而在過(guò)保質(zhì)期后，不動(dòng)桿菌和假單胞菌相對(duì)豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，提示致腐菌之間可能也存在相互競(jìng)爭(zhēng)。

3 結(jié) 論

索絲菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、肉桿菌屬及彎曲乳桿菌屬是牛排在不同貯藏溫度與時(shí)間下的優(yōu)勢(shì)菌屬。其中，肉桿菌屬、彎曲乳桿菌屬及假單胞菌屬為4、15 ℃下的優(yōu)勢(shì)菌屬。而索絲菌屬僅在4 ℃下成為優(yōu)勢(shì)菌屬、沙雷氏菌屬僅在15 ℃下成為優(yōu)勢(shì)菌屬，表明不同貯藏溫度下牛排腐敗菌群組成存在差異。不動(dòng)桿菌屬與沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、索絲菌屬，沙雷氏菌屬與索絲菌屬，索絲菌屬與假單胞菌屬相對(duì)豐度在特定貯藏溫度和時(shí)間下存在相關(guān)性，表明牛排腐敗菌之間存在潛在相互作用，這一結(jié)果提供了肉類(lèi)腐敗菌種間相互作用的高通量測(cè)序證據(jù)。本研究可為牛排質(zhì)量控制中腐敗菌評(píng)估體系的完善提供理論基礎(chǔ)。

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