摘要： 為測(cè)定白卡紙中的淀粉含量，本研究選用α-淀粉酶和糖化酶對(duì)白卡紙進(jìn)行雙酶協(xié)同降解，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法對(duì)酶解產(chǎn)物葡萄糖進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而計(jì)算白卡紙中的淀粉含量。在單因素實(shí)驗(yàn)分析研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化雙酶水解-DNS比色法測(cè)定淀粉含量的最佳條件，建立數(shù)學(xué)模型，回歸方程失擬誤差不顯著（Plt;0. 000 1），理論值與測(cè)定值吻合（R2為0. 988 6）；雙酶水解-DNS比色法測(cè)定淀粉含量的最佳條件為：雙酶添加量5 mg/mL，酶解時(shí)間75 min，酶解溫度40 ℃。對(duì)該方法進(jìn)行精密度和加標(biāo)回收率測(cè)試，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 8%，加標(biāo)回收率為96. 2%～98. 0%。

關(guān)鍵詞：白卡紙；淀粉；α-淀粉酶；糖化酶；測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：TS762. 2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10. 11980/j. issn. 0254-508X. 2025. 03. 016

白卡紙具有定量高、堅(jiān)挺厚實(shí)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于印刷和包裝行業(yè)，卷煙行業(yè)中白卡紙每年需求量達(dá)50～60萬(wàn)t[1]。作為一種高檔包裝材料，白卡紙應(yīng)具有良好的印刷適應(yīng)性和上機(jī)適應(yīng)性。為了使白卡紙的挺度、平滑度、光澤度、白度、層間結(jié)合強(qiáng)度等指標(biāo)滿(mǎn)足使用要求，在白卡紙的生產(chǎn)中需使用較多的原淀粉和改性淀粉[2]。原淀粉主要用于層間噴淋，增加纖維間的結(jié)合強(qiáng)度，使紙張厚度均勻，同時(shí)提高紙張的抗張強(qiáng)度、挺度、耐破度、層間結(jié)合強(qiáng)度；改性淀粉作為增強(qiáng)劑和助留助濾劑，廣泛應(yīng)用于造紙濕部，用于提高紙張的強(qiáng)度，改善紙張表面性能；原淀粉和改性淀粉還被廣泛用作表面施膠劑，提高紙張強(qiáng)度，改善紙張的印刷適應(yīng)性[3-4]。由此可知，淀粉在改善和提高白卡紙的性能方面發(fā)揮重要作用。對(duì)于造紙企業(yè)來(lái)說(shuō)，了解淀粉在紙張中的留著率，可以調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝，控制產(chǎn)品質(zhì)量；對(duì)于紙張研究而言，了解紙張中的淀粉含量，有利于研究淀粉對(duì)不同紙張性能的影響，從而開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品。因此，一種準(zhǔn)確測(cè)定白卡紙中淀粉含量的方法亟需被建立。

目前，我國(guó)還沒(méi)有紙張中淀粉含量測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)TAPPI T 419 om—2010提供了紙張中淀粉含量的測(cè)定方法，但該方法只適合紙張中原淀粉及僅通過(guò)常規(guī)氧化技術(shù)或酶轉(zhuǎn)化改性的淀粉定量測(cè)定，不適合陽(yáng)離子淀粉、取代淀粉、接枝淀粉或與樹(shù)脂結(jié)合的淀粉等含量的測(cè)定。國(guó)內(nèi)研究者依據(jù)淀粉遇碘會(huì)生成藍(lán)色絡(luò)合物的原理，建立了一種利用分光光度計(jì)測(cè)定紙張中淀粉含量的方法[5-7]，但由于影響淀粉-碘絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)的因素較多（如溫度、碘-碘化鉀濃度、淀粉聚合度等[8]），該方法的可靠性受到一定限制。

淀粉是天然存在的重要碳水化合物，廣泛存在于各種植物中；同時(shí)，淀粉在食品中有著廣泛的應(yīng)用。研究者對(duì)植物和食品中淀粉含量的測(cè)定提出了多種方法[9]，其中經(jīng)典的方法是淀粉經(jīng)酶解或酸水解產(chǎn)生葡萄糖，通過(guò)滴定法、分光光度法和色譜法等方法測(cè)定葡萄糖含量，并由葡萄糖含量推算出淀粉含量[10-12]。對(duì)于白卡紙，酸水解可能會(huì)降解纖維素和半纖維素，產(chǎn)生葡萄糖，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。酶解法包括糖化酶直接水解淀粉的方法[13]、α-淀粉酶和糖化酶的雙酶法[14]、α-淀粉酶和鹽酸的酶酸法[15]。由于α-淀粉酶和糖化酶均具有專(zhuān)一性，在酶解淀粉的過(guò)程中，對(duì)紙張中纖維素和半纖維素不起作用，因此，α-淀粉酶和糖化酶的雙酶體系適合紙張中淀粉的水解[16]。3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)，是目前還原糖實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最常用的方法[17]。針對(duì)白卡紙中淀粉難以分離、含量高、淀粉種類(lèi)復(fù)雜的特點(diǎn)，本研究采用α-淀粉酶和糖化酶對(duì)白卡紙中淀粉進(jìn)行酶解，生成葡萄糖，利用DNS法定量測(cè)定葡萄糖含量，再由葡萄糖含量計(jì)算出淀粉含量。該研究方法操作簡(jiǎn)單、測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為白卡紙中淀粉含量測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供新思路和新方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

白卡紙，湖北中煙技術(shù)中心；3，5-二硝基水楊酸（DNS） 顯色液，飛凈生物科技有限公司；陽(yáng)離子淀粉，江西六和化工實(shí)業(yè)有限公司；糖化酶（酶活性130 000 U/g），湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司；α-淀粉酶（酶活性4 000 U/g），北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；葡萄糖、冰醋酸、醋酸鈉、碘、碘化鉀，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1. 1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器

V-1100D可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SHZ-82B水浴恒溫振蕩器，常州市國(guó)旺儀器制造有限公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 水分的測(cè)定

紙張中水分按照GB/T 462—2008《紙、紙板和紙漿 分析試樣水分的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1. 2. 2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取在105 ℃的溫度下干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖0.5 g，加入少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至1 000 mL，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

1. 2. 3 淀粉溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.000 0 g淀粉于500 mL燒杯中，倒入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍尤氲秸诜序v的蒸餾水中，用蒸餾水對(duì)燒杯進(jìn)行少量多次洗滌，洗滌水也加入燒杯中，繼續(xù)加熱沸騰5 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至500 mL，淀粉溶液的質(zhì)量濃度為10 g/L。

1. 2. 4 白卡紙中淀粉的酶解及酶解液中葡萄糖含量的測(cè)定

稱(chēng)取0.5 g樣品，加入100 mL pH值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液浸泡12 h， 在分散器上分散， 用100 mL緩沖溶液分多次洗滌后，倒入500 mL的具塞三角燒瓶中，置于水浴恒溫振蕩器保溫30 min后，加入糖化酶與α-淀粉酶的混合液，使溶液的總體積為300 mL。反應(yīng)結(jié)束后用移液管吸取0.5 mL 酶解液，加入0.5 mL DNS 顯色液， 于沸水浴中加熱5 min，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，加入4.0 mL蒸餾水，搖勻， 用過(guò)濾頭過(guò)濾后在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。

1. 2. 5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在糖化酶與α-淀粉酶雙酶水解白卡紙淀粉的過(guò)程中，影響淀粉水解的因素主要有雙酶質(zhì)量比、雙酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度等。本研究選擇雙酶質(zhì)量比、雙酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)各單因素條件的酶解條件進(jìn)行設(shè)定，具體見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)操作按1.2.4 進(jìn)行。

1. 2. 6 淀粉含量的計(jì)算

白卡紙中淀粉含量由式（1）計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2. 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及方法檢出限

取6支10 mL比色管并編號(hào)，按表2順序加入各種試劑，混合均勻后置于沸水浴中加熱5 min進(jìn)行顯色處理，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，向各比色管中加入去離子水4.0 mL，搖勻，在540 nm波長(zhǎng)下，用0#管調(diào)零，分別讀取各管的吸光度值（A540）。以A540值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（m） 為縱坐標(biāo)，采用線(xiàn)性擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程見(jiàn)式（2），R2=0.999。

采用扣除空白樣吸光度后，A540=0.01所對(duì)應(yīng)的濃度值為檢出限，此時(shí)300 mL反應(yīng)液對(duì)應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度約為12.2 mg/L，換算為淀粉濃度約11.0 mg/L，因此紙張樣品中淀粉含量的檢出限為0.66%。

2. 2 白卡紙中淀粉含量測(cè)定單因素實(shí)驗(yàn)分析

2. 2. 1 雙酶質(zhì)量比對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響

圖1為雙酶質(zhì)量比對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響。由圖1可知，當(dāng)α-淀粉酶和糖化酶的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度最高，淀粉水解的最徹底。與此同時(shí)，反應(yīng)溶液與I2-KI溶液顯色為試劑本身的顏色，表明白卡紙中的淀粉已水解完全。因此，α-淀粉酶和糖化酶的最佳質(zhì)量比選為2∶1。

2. 2. 2 雙酶添加量對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響

圖2為雙酶添加量對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響。由圖2可知，隨著雙酶添加量的增加，白卡紙淀粉水解液中的葡萄糖質(zhì)量濃度也升高，這一階段影響淀粉水解的因素主要是雙酶添加量。當(dāng)雙酶添加量達(dá)5 mg/mL時(shí)，白卡紙淀粉水解液中的葡萄糖質(zhì)量濃度最高；之后再增加雙酶添加量，淀粉水解液中的葡萄糖質(zhì)量濃度基本不變。這是因?yàn)榇藭r(shí)影響淀粉水解的主要因素是底物的含量，雙酶添加量已達(dá)到飽和，沒(méi)有多余的底物與酶反應(yīng)。

2. 2. 3 酶解時(shí)間對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響

圖3 為酶解時(shí)間對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響。由圖3 可知，酶解時(shí)間對(duì)淀粉水解的影響顯著。隨著酶解時(shí)間的增加，酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度逐漸升高，但當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，說(shuō)明酶與淀粉已經(jīng)充分反應(yīng)。

2. 2. 4 酶解溫度對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響

圖4為酶解溫度對(duì)白卡紙中淀粉水解的影響。由圖4可知，酶解溫度對(duì)淀粉水解的影響不顯著。具體來(lái)說(shuō)，盡管酶解溫度從30 ℃逐漸升高到70 ℃，但葡萄質(zhì)量濃度量的變化幅度相對(duì)較小，表明酶解溫度變化并未顯著影響淀粉水解的效率。

2. 3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2. 3. 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

根據(jù)單因素探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以雙酶添加量（X1）、酶解時(shí)間（X2）、酶解溫度（X3） 3個(gè)參數(shù)為自變量，葡萄糖質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

2. 3. 2 回歸方程的建立及方差分析

對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)雙酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度的二次多項(xiàng)回歸方程見(jiàn)式（3）。

對(duì)該回歸方程及系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，R2 為0.988 6，失擬誤差不顯著（Plt;0.000 1），說(shuō)明該模型顯著，擬合程度良好。一次項(xiàng)X1、X2對(duì)響應(yīng)值的影響極為顯著，X3對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著，也即雙酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)淀粉水解的影響顯著，酶解溫度影響較?。欢雾?xiàng)X22的P 值lt;0.01，說(shuō)明響應(yīng)值的變化相對(duì)復(fù)雜，3個(gè)實(shí)驗(yàn)因子對(duì)淀粉水解的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，曲面效應(yīng)顯著；交互項(xiàng)X1X2、X1X3 的P 值為lt;0.05，說(shuō)明雙酶添加量與酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用差異顯著，X2X3的Pgt;0.05， 說(shuō)明酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用不明顯。

2. 3. 3 響應(yīng)面的分析

圖5～圖7為根據(jù)回歸分析結(jié)果做出的響應(yīng)面圖和等值線(xiàn)圖。由圖5～圖7可知，雙酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)白卡紙中淀粉水解葡萄糖質(zhì)量濃度影響明顯，酶解溫度影響不明顯；X1與X2，X1與X3，也即雙酶添加量與酶解時(shí)間，雙酶添加量與酶解溫度的交互作用顯著[17-18]，與上述分析結(jié)果一致。

2. 3. 4 最佳反應(yīng)條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert V 13.0.5 軟件分析得出最佳條件：雙酶添加量4.995 mg/mL，酶解時(shí)間74.7 min，酶解溫度40.1 ℃，該條件下葡萄糖的理論質(zhì)量濃度為0.219 mg/mL。考慮實(shí)際操作，將條件修正為雙酶添加量5 mg/mL，酶解時(shí)間75 min，酶解溫度40 ℃。在此條件下，通過(guò)6次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得最佳條件下白卡紙中淀粉水解葡萄糖質(zhì)量濃度為0.220 mg/mL，測(cè)得白卡紙中淀粉含量為13.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%。

2. 4 加標(biāo)回收率

稱(chēng)取實(shí)驗(yàn)紙張樣品，在反應(yīng)溶液中加入與紙張樣品中淀粉含量相近和加倍量的淀粉溶液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，紙張樣品加標(biāo)回收率為96.2%～98.0%。

3 結(jié)論

采用淀粉酶與糖化酶雙酶對(duì)白卡紙中的淀粉進(jìn)行水解， 使其生成葡萄糖， 利用3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法定量測(cè)定葡萄糖含量，再由葡萄糖含量計(jì)算出紙張中淀粉含量。雙酶水解-DNS比色法測(cè)定淀粉含量的最佳條件為雙酶添加量5 mg/mL，酶解時(shí)間75 min，酶解溫度40 ℃。該方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，加標(biāo)回收率為96.2%～98.0%，具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、回收率高、測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，可用于白卡紙中淀粉含量的測(cè)定，也為紙和紙板中淀粉含量的測(cè)定提供新思路、新方法。

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