摘要：實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術可為目的基因表達水平提供較為準確可靠的檢測結果，但量化目的基因表達水平時需要使用內參基因來計算，因此，內參基因的選擇合理與否會影響目的基因試驗結果的準確性。理想的內參基因應該在所研究生物體內的大多數(shù)細胞中具有一致的較高豐度的轉錄表達，且表達水平不受外界因素的影響。實際上這些內參基因可能受物種、品種、發(fā)育階段、器官以及處理條件等因素的影響而表達水平發(fā)生顯著改變，從而影響定量計算結果。隨著轉錄組測序技術的大量應用和數(shù)據(jù)積累，候選內參基因的選擇也不再局限于傳統(tǒng)的經(jīng)驗內參基因，利用公共數(shù)據(jù)庫進行候選內參基因的篩選逐漸成為一種可能，因此，開展水稻內參基因篩選的相關研究具有重要的實踐應用價值。本文綜述總結了內參基因的來源和后續(xù)的篩選與驗證方法，以及近幾年來水稻內參基因由傳統(tǒng)的管家基因向高通量測序數(shù)據(jù)中篩選出的適應水稻不同處理和組織的合適內參基因的轉變，并對未來水稻內參基因的研究方向進行了展望，旨在為提高水稻基因表達研究的準確性提供有價值的應用參考。

關鍵詞：內參基因；RT-qPCR；水稻；基因表達

中圖分類號：S511.01文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0007-07

水稻是我國最主要的糧食作物之一，同時也是用于遺傳和分子功能研究的模式單子葉植物。隨著水稻基因組被完整測序和分子生物學的發(fā)展，水稻的重要功能基因不斷地被鑒定、克隆和解析。對目的基因的表達模式進行分析是了解目的基因特點、功能和挖掘利用其潛能的最基礎研究內容之一，因此基因表達分析是分子研究中的重要基礎手段。由于基因表達在根本上是受轉錄水平調控的，因此研究往往需要量化目的基因的轉錄水平，即其mRNA的表達水平［1-2］。檢測目的基因表達水平的常用技術包括Northern印跡、原位雜交、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）、微陣列和轉錄組測序。其中，RT-qPCR由于其特異性強、靈敏度高、重復性好和分析便捷與準確等優(yōu)勢，更頻繁地用于量化目的基因的mRNA水平。在對RT-qPCR產(chǎn)物的定量分析過程中，其定量量化通常通過循環(huán)數(shù)與選擇的穩(wěn)定表達的內參基因的相對值來計算。因此，除非選擇了真正穩(wěn)定表達的內參基因作為參考，否則特定樣本中目的基因的表達水平往往被高估或低估。例如測量目的基因PIF3H在芍藥花的不同發(fā)育時期（花蕾期、初開期、盛開期、衰敗期）的表達模式時，利用常用的內參基因PP2A進行標準化時發(fā)現(xiàn)PIF3H的表達模式與利用其他常用內參基因標準化時存在顯著差異［3］。因此在基因表達測定中選擇不恰當?shù)膬葏⒒蚩赡軙玫讲豢煽康谋磉_水平變化趨勢的結論［4］。在不同的試驗條件下或者不同的組織中，通常使用的內參基因本身的表達水平可能也在變化中，因此每個試驗場景下應單獨選擇具有穩(wěn)定表達水平的內參基因［5］。因此，內參基因的正確選擇，對于產(chǎn)生可靠和準確的RT-qPCR結果乃至形成基本結論都至關重要。

本文綜述了植物研究中候選內參基因的選擇，候選內參基因穩(wěn)定性的評價和驗證方法以及水稻內參基因的研究進展，旨在為水稻分子機理及育種應用等相關領域研究提供內參基因選擇時的參考。

1內參基因的選擇

1.1理想候選內參基因篩選的標準

內參基因，曾一度也被稱為管家基因，后因發(fā)現(xiàn)其并非僅僅是起“管家”作用，故而“內參基因”一名更為廣泛地為大家使用。理想的內參基因應該具備以下標準：（1）非假基因，以避免因基因組DNA的污染而被擴增［6］；（2）轉錄水平為高度或中度表達，避免低表達水平的基因，有利于以此基因表達水平作為基礎的定量；（3）轉錄水平上穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織中，而且其表達量相近，至少無顯著性差別；（4）其轉錄表達水平與細胞周期或活躍時期無關；（5）其穩(wěn)定的表達水平與目的基因相對差異較?。?］；（6）受生長環(huán)境或內外界脅迫因子影響后的變化較?。?］。

1.2候選內參基因的來源

在植物中，RT-qPCR候選內參基因的表達通常要求其在不同組織的細胞之間和不同的試驗條件下保持穩(wěn)定。其中常用內參基因主要來源于以往普遍使用的經(jīng)“證實”的內參基因，這些內參基因主要包括ACTIN（肌動蛋白基因）、CYP（親環(huán)素基因）、EF1α（真核細胞延伸因子基因）、EIF（真核細胞引發(fā)因子基因）、GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶基因）、H3（組蛋白基因）、NADHD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶基因）、PGK（磷酸甘油酸激酶基因）、rRNA（核糖體RNA基因）、SAMSC（S-腺苷甲硫氨酸合酶基因）、TEFG（翻譯延伸因子基因）、TUB（微管蛋白基因）、UBC（泛素結合酶基因）以及UBQ（泛素基因）等［9］。隨著研究工作的深入和培育材料場景的多樣化，研究者發(fā)現(xiàn)，即使同一植物材料，在不同生長周期、不同組織、不同環(huán)境條件下，這些基因穩(wěn)定性差異很大，需要分別篩選。如de Andrade等以耐旱性不同的2個甘蔗品種為材料，進行了3個獨立的試驗，分析了內參基因在田間干旱脅迫下葉片、溫室干旱脅迫下葉片和在溫室水培環(huán)境中莖根缺水情況下的表達情況，結果表明，在田間干旱脅迫下葉片中表達最穩(wěn)定的基因是UBQ1；在溫室內處于干旱脅迫條件下的葉片中及在PEG-8000誘導的水分虧缺脅迫下的莖根樣品中，GAPDH基因的表達最穩(wěn)定［10］。

然而，隨著高通量測序等技術的發(fā)展，微陣列和轉錄組測序等數(shù)據(jù)越來越容易獲得，候選內參基因的來源不再局限于傳統(tǒng)的內參基因。越來越多的研究人員開始廣泛利用微陣列和轉錄組數(shù)據(jù)庫來篩選候選內參基因，因此涌現(xiàn)了許多新的更穩(wěn)定的內參基因。例如，利用轉錄組數(shù)據(jù)從葡萄中篩選出了7個新的候選內參基因（CYSP、EF-Hand、EIF5A2、GDT1、Gluc、NDUFS8和YLS8），它們在2種組織類型（葉和果）、3個發(fā)育階段（葉的3個發(fā)育階段和果發(fā)育的3個階段）以及葡萄藤葉病毒感染后的植株中分別穩(wěn)定表達，且在各個驗證算法中，這些新開發(fā)的內參基因幾乎都要比傳統(tǒng)的ACTIN和NAD5更穩(wěn)定［11］。在小麥上，為了尋找小麥短期干旱脅迫下的幼苗中最穩(wěn)定內參基因，Dudziak等選擇了5個用于小麥表達試驗的常用內參基因，又利用Genevestigator的微陣列數(shù)據(jù)庫篩選了5個新的候選內參基因。隨后對候選內參基因的穩(wěn)定性進行 RT-qPCR 分析，試驗結果表明，新候選內參基因CJ705892被發(fā)現(xiàn)是短期干旱脅迫下小麥中最穩(wěn)定的內參基因，而同樣在Genevestigator微陣列數(shù)據(jù)庫中篩選的新候選內參基因CA728440在大多數(shù)穩(wěn)定性分析中都是最差的，因此利用數(shù)據(jù)庫對候選內參基因進行篩選后的驗證是必不可少的［12］。

2內參基因穩(wěn)定性的評價方法

隨著人們對內參基因研究的逐步重視，許多在線工具被開發(fā)出來，用于量化比較內參基因表達的變化和穩(wěn)定性，以期幫助研究者篩選出最合適的內參基因。目前常用的5個軟件分別是geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT和RefFinder。

geNorm程序可以用于篩選任何試驗的任意多個數(shù)目的候選內參基因，并最終挑選出2個或2個以上的內參基因組合用來計算目的基因的表達量，使相對定量的結果更為精確。每個候選內參基因的穩(wěn)定值（M）是基于所有測試基因之間的平均成對變異（V）而產(chǎn)生的，判定標準為M值越小，該內參基因的穩(wěn)定性越好。同時，geNorm可以根據(jù)Vn/Vn+1值來確定所需最適內參基因的數(shù)目。通常V值設定為0.15，如果Vn/Vn+1值lt;0.15，則最合適的內參基因的數(shù)量是n個［13］。

NormFinder程序通過方差分析來評估穩(wěn)定值，可以比較候選內參基因間的表達差異，還可以比較組間變異，穩(wěn)定性值最小的候選內參基因的表達最穩(wěn)定，即最適宜于作為內參基因來應用［14］。

BestKeeper程序通過計算標準差和變異系數(shù)來確定候選內參基因的表達穩(wěn)定性。變異系數(shù)值越小的內參基因，其穩(wěn)定性越高，選用最合適［15］。

ΔCT程序通過比較樣本中候選內參基因組成的“基因對”的相對表達來識別穩(wěn)定的內參基因，如果同一個樣本中2個基因之間的ΔCT值不變，則認為這2個基因的表達穩(wěn)定。因此ΔCT軟件的選擇原則為某一內參基因所有“基因對”的ΔCT平均標準偏差最小，則為最穩(wěn)定的內參基因，應該被選用［16］。

RefFinder是在geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCT分析的基礎上，根據(jù)穩(wěn)定性結果來計算幾何平均數(shù)從而獲取基因穩(wěn)定性的綜合指數(shù)排名，指數(shù)越小，則該基因表達越穩(wěn)定，相對而言，綜合考慮了幾種計算方法的優(yōu)缺點［17］。

3候選內參基因的后續(xù)RT-qPCR的驗證

在利用上述5種軟件對候選內參基因進行篩選并排名后，為了驗證所得的候選內參基因的穩(wěn)定性，往往要對這些候選內參基因的穩(wěn)定性進行RT-qPCR試驗驗證。研究者們通常依據(jù)geNorm中 Vn/Vn+1＜0.15時n的值來判斷最終選擇幾個候選內參基因最合適，并且在后續(xù)的驗證中，研究者們在軟件中選取穩(wěn)定性排名最靠前的n個候選內參基因，再選取1～2個在軟件中排名倒數(shù)（穩(wěn)定性最差）的候選內參基因作為對照。利用經(jīng)過歸一化處理的排名靠前的候選內參基因和排名倒數(shù)的候選內參基因來驗證目的基因表達結果的可靠性。

例如，為了驗證燕麥中選出的最佳內參基因的可靠性，研究者選擇出樣品組在程序中綜合排名最靠前的EP和EF1A，并進行歸一化處理，又選擇樣品組中綜合排名最低的內參基因GAPDH1；在檢測了AsPKP1和AsAGPL2在發(fā)育中的種子和胚乳中的表達水平后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EP+EF1A、EP和EF1A標準化的AsPKP1和AsAGPL2的表達模式基本相似，與GAPDH1的表達模式明顯不同，以此證明了EP、EF1A確實是這批候選內參基因中最穩(wěn)定的內參基因［18］。

再如，在對海南紅豆杉葉片對不同脅迫處理（脫落酸、乙烯、甘露醇、茉莉酸甲酯、氯化鈉和水楊酸）下以及由葉片制備的懸浮細胞的候選內參基因進行驗證時，選擇geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder這4個程序中排名最靠前的18S和UBQ，和排名最靠后的TUB，又挑選了在乙烯脅迫下懸浮細胞中穩(wěn)定性排名最靠前的18S和TUA，和在乙烯脅迫下懸浮細胞穩(wěn)定性排名最靠后的NAC，將樣品中目的基因ChNCS表達水平標準化以驗證所選擇的內參基因。實際比較RT-qPCR的計算結果發(fā)現(xiàn)，在葉中18S和UBQ及歸一化處理的變化模式差異較小，與TUB變化模式不同；在懸浮細胞中18S和TUA及歸一化處理的變化模式也一致，NAC變化模式差異很大。驗證結果和程序分析結果吻合，驗證了候選內參基因的穩(wěn)定性［19］。

4水稻內參基因的研究進展

4.1常用內參基因作為水稻內參基因

從傳統(tǒng)的內參基因家族中篩選相應的內參基因在水稻研究中應用十分廣泛，如Jain等對10個常用的內參基因（18S rRNA-1、25S rRNA、ACT11、eEF-1a-1、eIF-4α、GAPDH、UBC、UBQ5、UBQ10和β-TUB）在IR64中進行評估篩選。他們將樣品分成發(fā)育系列，包括3種光照條件下7日齡幼苗、7日齡幼苗的根、成熟的葉片、穗軸、幼花花序、授粉前后的花和成熟的種子，以及處理系列，包括鹽脅迫、冷脅迫、熱脅迫、干旱脅迫、9種激素脅迫和2個對照（均采用7日齡幼苗進行處理）。在將2個系列的所有組織一起分析時，UBQ5和eEF-1α-1的表達最穩(wěn)定，而UBQ10的穩(wěn)定性最差。然而在不同發(fā)育時期、不同器官中，所有內參基因穩(wěn)定性結果都非常相似，其中UBQ5和eEF-1α-1最穩(wěn)定；在不同脅迫處理中，18S rRNA-1和25S rRNA最穩(wěn)定［20］。

在另一研究中，對10個不同的常用內參基因（ACT11、cyclophilin、Eef-1、eIF-4-a、GAPDH、TIP41-like、UBC-E2、UBQ5、UBQ10和β-TUB）在2個不同鹽敏感水稻品種的葉片中進行穩(wěn)定性評估，結果顯示UBQ10是水稻在鹽脅迫條件下用于RT-qPCR定量的最佳內參基因［21］。

在秈稻2個品種的5葉苗期和生殖生長時期（開花前）對土壤供水匱缺的響應中，Auler等檢測了9個常用內參基因（ACT11、cyclophilin、eIF-4α、GAPDH、TIP41-Like、UBC-E2、UBQ5、UBQ10和 β-tubulin），其RT-qPCR的結果表明，在營養(yǎng)生長和生殖生長時期，UBC-E2和UBQ5是在缺水條件下水稻葉片最合適的內參基因；而UBQ10Z在營養(yǎng)生長階段被認為是最不穩(wěn)定的內參基因之一，但在生殖生長階段卻是最穩(wěn)定的基因之一［22］。

對處于重金屬（Zn、Cu、Cd和Pb）脅迫下水稻葉片的內參基因（Actin、EF-1α、eIF-4α、GAPDH、UBC、UBQ5、UBQ10和β-TUB）的表達穩(wěn)定性分析結果顯示，UBQ10和UBC是最合適的內參基因［23］。

而在3個品種KHO、RKB和IR-64缺氧不同時長條件下（24、48、96 h）胚芽中表達穩(wěn)定性檢測結果表明，所測試的常用內參基因有18S rRNA、25S rRNA、ACT11、eEF1α-2、eIF4α、GAPDH-2、UBC、UBQ5、UBQ10和β-TUB，其中GAPDH-2和 eEF1α-2 適宜于在水稻低氧萌發(fā)研究中作為最穩(wěn)定的內參基因應用［24］。

在對生物脅迫的響應中，F(xiàn)ang等通過對14個不同構成的常用內參基因（18S rRNA、Actin、Actin1-1、EF-1α、eIF-4α、EXP、GAPDH-1、OsAOC、TIP41-like、UBC、UBQ5、UBQ10、α-TUB和β-TUB）在感染水稻條紋葉枯病的水稻和感染水稻黑條矮縮病的水稻中進行定量分析的結果表明，UBQ10+GAPDH-1是水稻條紋葉枯病感染的水稻中最穩(wěn)定表達的內參基因；Actin1-1+UBC是在感染水稻黑條矮縮病情況下最穩(wěn)定的內參基因［25］。而Hu等對南方黑條矮縮病毒侵染后的水稻葉片進行內參基因驗證時發(fā)現(xiàn)，8個常用內參基因（18S-2、25S、ACTIN、EF1α、GAPDH、UBQ5、UBQ10和 β-TUB ）中，僅18S-2是南方水稻黑條矮縮病毒侵染后水稻葉片的最合適內參基因［26］。另外，Hashemipetroudi等則發(fā)現(xiàn)，感染不同病原菌的水稻中，7個常用內參基因（18S rRNA、ACT1-2、CYP28、eIF4a、GAPDH、RPS27和UBC5）里，ACT1-2是水稻單獨感染立枯絲核菌后葉片中最佳內參基因，而GAPDH、UBC5、eIF4a分別是立枯絲核菌感染加硅酸鉀處理下、立枯絲核菌感染加嗜皂苷假單胞菌和立枯絲核菌感染加假單胞菌蛋白等復合感染或有應對措施下植株材料的最佳內參基因。ACT1-2和RPS27對于硅酸鉀和嗜皂苷假單胞菌的組合最穩(wěn)定，而RPS27對于硅酸鉀和假單胞菌蛋白的組合最穩(wěn)定。這些發(fā)現(xiàn)表明，在不同病原菌侵染和應對后，所謂的“最穩(wěn)定的”內參基因其穩(wěn)定性發(fā)生變化，需要采用內參基因的組合來進行表達研究［27］。

4.2高通量測序數(shù)據(jù)應用于水稻候選內參基因的選擇

隨著高通量測序技術的發(fā)展，微陣列數(shù)據(jù)和轉錄組數(shù)據(jù)大量積累，為研究者在選擇內參基因時提供了更多的可能性。如Narsai等用了Affymetrix平臺上可獲得的水稻的136個轉錄組數(shù)據(jù)和373個來自微陣列的數(shù)據(jù)進行綜合分析，這些數(shù)據(jù)來自包括組織發(fā)育（胚、胚乳、干種子、發(fā)芽種子、胚芽鞘、葉、頂端分生組織、根、柱頭、子房和花序）、非生物脅迫（冷、熱、干旱、鹽、營養(yǎng)和物理）、生物脅迫（真菌、寄生蟲、病毒和細菌）和激素處理的試驗，篩選出12個水稻新的候選內參基因［28］。

Fabiane等在2個鐵敏感性不同的水稻品種中測試了先前研究中經(jīng)常使用的3個傳統(tǒng)內參基因（OsGAPDH、OsNABP和OsEF-1a）以及從Genevestigator數(shù)據(jù)庫中選擇的9個新型候選內參基因，找到了在鐵處理環(huán)境下的芽（P2、OsGAPDH和OsNABP）、根（OsEF-1a、P8和OsGAPDH）和根+芽（OsNABP、OsGAPDH和P8）的有效內參基因［29］。而Soni等從暴露于重金屬脅迫的公開轉錄組數(shù)據(jù)中篩選出OsOBP和OsCK1a.3，認為它們是類似條件下最可靠的內參基因［30］。Ji等利用開放的微陣列和轉錄組數(shù)據(jù)庫篩選出12個基因作為候選內參基因，并以5個傳統(tǒng)內參基因為對比，利用RT-qPCR對這些基因進行進一步分析和驗證，發(fā)現(xiàn)4個基因（UPF3、eIF4A-3、GAPDH和PPP6）在生殖組織中穩(wěn)定表達，可作為水稻花藥發(fā)育研究的內參基因［31］。Zhao等從IC4R轉錄組數(shù)據(jù)庫篩選出11個新的水稻候選內參基因（ARFB1B、DUF602、FhaB、Hypro、PP57、TFIIA-L1、TIF-SUI1、UFC1、YIP1、ZF-RFP和ZF-U1），并將其與5個傳統(tǒng)內參基因（ACT1、GAPDH、UBF、UBQ5和β-TUB4）作比較，發(fā)現(xiàn)新的內參基因UFC1、FhaB和傳統(tǒng)使用的UBQ5是水稻各器官（根、莖、葉、穗）中最穩(wěn)定的內參基因［32］。

為了獲得特定組織類型或生長條件中穩(wěn)定的內參基因，Liu等利用RNA-Seq數(shù)據(jù)庫篩選出12個候選內參基因（OsACT1、OsF-Box1、OsPP2C1、OsPP2C2、OsUBQ1、OsUBQ2、OsGDCP、OsHeFP、OsMED7、OsOS-9、OsReTP和OsZOS3-23），其中前6個屬于常用內參基因家族但未被廣泛應用，后6個是新發(fā)現(xiàn)的候選內參基因并對其進行驗證，發(fā)現(xiàn)了7日齡水稻葉（OsMED7、OsACT1和OsOS-9）、莖（OsACT1、OsZOS3-23和OsGDCP）和根（OsMED7、OsOS-9和OsGDCP）的穩(wěn)定內參基因［33］。

除了利用公共數(shù)據(jù)庫中轉錄組數(shù)據(jù)，也有研究人員對自己特定處理材料的轉錄組測序結果，篩選了更適合自己試驗要求的內參基因。例如，為了獲得在高溫下水稻胚乳發(fā)育過程中的合適內參基因，Xu等對不同處理的水稻胚乳進行了轉錄組測序，通過RT-qPCR從中篩選出6個候選內參基因（ARP、eIF-5a、EXP1、Fb15、SAP18和SKP-1b）。將它們和11個常用內參基因（17S rRNA、18S rRNA、25S rRNA、Actin、eEF-1a、eIF-4a、GAPDH、UBC、UBQ5、UBQ10和β-TUB）一起進行穩(wěn)定性分析后，發(fā)現(xiàn)Fb15和eIF-4a是水稻胚乳中2個最穩(wěn)定的基因，而高溫處理對Fb15和UBQ5的表達影響最小，F(xiàn)b15、UBQ5和17S rRNA在高溫下胚乳中的表達量最穩(wěn)定［34］。

目前在水稻各組織中篩選得到的最佳內參基因名單列于表1。

5總結與展望

盡管RT-qPCR是一種快速、可靠和靈敏的技術，可以量化我們感興趣的目的基因的轉錄水平，但它的結果在相當程度上取決于選擇合適的內參基因來標準化計算，以此來最大程度地降低由樣品制備和擴增反應所帶來的誤差。在理想情況下，內參基因應該在任何待檢組織中或者試驗情況下穩(wěn)定表達，轉錄水平變化微小。然而，大多數(shù)試驗結果顯示，常采用的內參基因在不同組織、不同生長階段和試驗條件下都會發(fā)生較為顯著的響應變化［35］。盡管可能并不存在理想的在任何條件下都穩(wěn)定表達的內參基因，由于RT-qPCR定量技術的應用局限，必須選擇相對較為穩(wěn)定的內參基因。

在水稻中，傳統(tǒng)的內參基因和其他常用的內參基因都有了較多的研究，但這些研究經(jīng)常表現(xiàn)出與生長條件、水稻品種和水稻器官有關的局限性。為了獲得相對準確的RT-qPCR結果，需要對不同的樣本和數(shù)據(jù)產(chǎn)生的具體條件進行分類，以篩選鑒定出最適宜的候選內參基因。隨著測序技術的飛速發(fā)展，積累下來越來越多的轉錄組數(shù)據(jù)可以為我們提供更為可靠的篩選機遇，對精準篩選出試驗特定條件下的最佳內參基因非常有幫助。針對不同試驗條件，可以從公共數(shù)據(jù)庫中對具有相似條件的數(shù)據(jù)進行下載，并根據(jù)一定標準嚴格或寬松地去篩選候選內參基因，同時對這些候選內參基因進行RT-qPCR驗證。然后再通過geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT和RefFinder等軟件做穩(wěn)定性分析，根據(jù)排名篩出合適的內參基因數(shù)量，對其進行歸一化。這樣，在評價目的基因表達水平時能夠有一個更為客觀真實的結果。

隨著生物信息學研究的不斷深入，相信在不久的未來會出現(xiàn)一個綜合的適用于水稻等各個物種的篩選內參基因的網(wǎng)站，它能夠按物種、亞種、栽培品種、組織類型、發(fā)育階段、生長條件和生物或非生物脅迫處理等提供更全面的特定最佳內參基因搜索。以上提到的篩選候選內參基因的所有工作將被大幅度地簡化，在做相關表達水平分析時可以節(jié)約大量時間，更專注地做更有意義的功能分析。

參考文獻：

［1］Huggett J，Dheda K，Bustin S，et al. Real-time RT-PCR normalisation；strategies and considerations［J］. Genes and Immunity，2005，6（4）：279-284.

［2］Bustin S A，Benes V，Nolan T，et al. Quantitative real-time RT-PCR：a perspective［J］. Journal of Molecular Endocrinology，2005，34（3）：597-601.

［3］李健. 芍藥實時定量PCR內參基因的篩選和驗證［J］. 分子植物育種，2017，15（7）：2544-2549.

［4］Udvardi M K，Czechowski T，Scheible W R. Eleven golden rules of quantitative RT-PCR［J］. The Plant Cell，2008，20（7）：1736-1737.

［5］張艷君，朱志峰，陸融，等. 基因表達轉錄分析中內參基因的選擇［J］. 生物化學與生物物理進展，2007，34（5）：546-550.

［6］陳鳳花，王琳，胡麗華. 實時熒光定量RT-PCR內參基因的選擇［J］. 臨床檢驗雜志，2005，23（5）：393-395.

［7］Dheda K，Huggett J F，Bustin S A，et al. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR［J］. BioTechniques，2004，37（1）：112-114，116， 118-119.

［8］Thellin O，Zorzi W，Lakaye B，et al. Housekeeping genes as internal standards：use and limits［J］. Journal of Biotechnology，1999，75（2/3）：291-295.

［9］李丹丹，胡博，王慶，等. 藥用植物內參基因研究進展［J］. 分子植物育種，2017，15（3）：903-910.

［10］de Andrade L M，dos Santos Brito M，Peixoto R F Jr，et al. Reference genes for normalization of qPCR assays in sugarcane plants under water deficit［J］. Plant Methods，2017，13：28.

［11］Song Y S，Hanner R H，Meng B Z. Genome-wide screening of novel RT-qPCR reference genes for study of GLRaV-3 infection in wine grapes and refinement of an RNA isolation protocol for grape berries［J］. Plant Methods，2021，17（1）：110.

［12］Dudziak K，Sozoniuk M，Szczerba H，et al. Identification of stable reference genes for qPCR studies in common wheat （Triticum aestivum L.） seedlings under short-term drought stress［J］. Plant Methods，2020，16：58.

［13］Vandesompele J，de Preter K，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］. Genome Biology，2002，3（7）：RESEARCH0034.

［14］Andersen C L，Jensen J L，rntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets［J］. Cancer Research，2004，64（15）：5245-5250.

［15］Pfaffl M W，Tichopad A，Prgomet C，et al. Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity：BestKeeper：excel-based tool using pair-wise correlations［J］. Biotechnology Letters，2004，26（6）：509-515.

［16］Silver N，Best S，Jiang J，et al. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR［J］. BMC Molecular Biology，2006，7：33.

［17］Xie F L，Xiao P，Chen D L，et al. miRDeepFinder：a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs［J］. Plant Molecular Biology，2012，80：75-84.

［18］Yang Z，Wang K，Aziz U，et al. Evaluation of duplicated reference genes for quantitative real-time PCR analysis in genome unknown hexaploid oat （Avena sativa L.）［J］. Plant Methods，2020，16：138.

［19］Sun H P，Jiang X F，Sun M L，et al. Evaluation of reference genes for normalizing RT-qPCR in leaves and suspension cells of Cephalotaxus hainanensis under various stimuli［J］. Plant Methods，2019，15：31.

［20］Jain M，Nijhawan A，Tyagi A K，et al. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，345（2）：646-651.

［21］Moraes G P，Benitez L C，do Amaral M N，et al. Evaluation of reference genes for RT-qPCR studies in the leaves of rice seedlings under salt stress［J］. Genetics and Molecular Research，2015，14（1）：2384-2398.

［22］Auler P A，Benitez L C，do Amaral M N，et al. Evaluation of stability and validation of reference genes for RT-qPCR expression studies in rice plants under water deficit［J］. Journal of Applied Genetics，2017，58（2）：163-177.

［23］Almas D E，Kamrodi A R. Validation of appropriate reference genes for real-time quantitative PCR gene expression analysis in rice plants exposed to metal stresses［J］. Russian Journal of Plant Physiology，2018，65（6）：890-897.

［24］Kumar D，Das P K，Sarmah B K. Reference gene validation for normalization of RT-qPCR assay associated with germination and survival of rice under hypoxic condition［J］. Journal of Applied Genetics，2018，59（4）：419-430.

［25］Fang P，Lu R F，Sun F，et al. Assessment of reference gene stability in rice stripe virus and rice black streaked dwarf virus infection rice by quantitative Real-time PCR［J］. Virology Journal，2015，12：175.

［26］Hu K，Qiu L，Ding W B，et al. Evaluation of reference genes and expression of key genes involved in the isoprenoid metabolic pathway of rice leaves after infection by the Southern rice black-streaked dwarf virus［J］. Molecular Biology Reports，2019，46（4）：3945-3953.

［27］Hashemipetroudi S H，Ghorbani H，Rostami M，et al. Selection of reference genes for RT-qPCR analysis of rice with Rhizoctonia solani infection and biocontrol PGPR/KSi application［J］. Molecular Biology Reports，2023，50（5）：4225-4237.

［28］Narsai R，Ivanova A，Ng S，et al. Defining reference genes in Oryza sativa using organ，development，biotic and abiotic transcriptome datasets［J］. BMC Plant Biology，2010，10：56.

［29］Santos F I C D，Marini N，Santos R S D，et al. Selection and testing of reference genes for accurate RT-qPCR in rice seedlings under iron toxicity［J］. PLoS One，2018，13（3）：e0193418.

［30］Soni P，Shivhare R，Kaur A，et al. Reference gene identification for gene expression analysis in rice under different metal stress［J］. Journal of Biotechnology，2021，332：83-93.

［31］Ji Y X，Tu P，Wang K，et al. Defining reference genes for [JP3]quantitative real-time PCR analysis of anther development in rice［J］. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2014，46（4）：305-312.

［32］[JP3]Zhao Z，Zhang Z X，Ding Z，et al. Public-transcriptome-database-assisted selection and validation of reliable reference genes for qRT-PCR in rice［J］. Science China（Life Sciences），2020，63（1）：92-101.

［33］Liu X，Gao Y B，Zhao X Y，et al. Validation of novel reference genes in different rice plant tissues through mining RNA-seq datasets［J］. Plants，2023，12（23）：3946.

［34］Xu H，Bao J D，Dai J S，et al. Genome-wide identification of new [JP3]reference genes for qRT-PCR normalization under high temperature stress in rice endosperm［J］. PLoS One，2015，10（11）：e0142015.

［35］Bustin S A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR （RT-PCR）：trends and problems［J］. Journal of Molecular Endocrinology，2002，29（1）：23-39.