摘 要：為了聯(lián)合評(píng)價(jià)浸漬法、熱回流法、超聲輔助乙醇和超聲輔助低共溶試劑法（UADEE）對(duì)番石榴葉的提取效果，通過(guò)掃描電鏡觀察番石榴葉樣品的顯微結(jié)構(gòu)，以香草醛-冰醋酸比色法、NaNO2-Al（NO3）3 比色法、福林酚法分別測(cè)定番石榴葉提取液的總皂苷、總黃酮、總酚含量，采用HPLC 法測(cè)定番石榴葉中黃酮單體的含量，LC-MS 法分析其代謝物，并評(píng)估其抗氧化與α-糖苷酶抑制活性。結(jié)果表明：UADEE 對(duì)番石榴葉細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞性最強(qiáng)，樣品總皂苷、總黃酮與總酚含量分別為79.28、80.51、120.52 mg/g，黃酮成分番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷含量分別為7.96、7.74、3.99 mg/g，顯著高于其他3 組（Plt;0.05）；UADEE 處理組中黃酮類、三萜類、酚類成分在番石榴葉總代謝物中分別占9.830%、27.267%、1.013%。UADEE 組樣品清除DPPH 自由基的IC50 值和抑制α-葡萄糖苷酶的IC50 值分別為45.18、904.67 μg/mL，活性顯著強(qiáng)于其他3 組（Plt;0.05）。本研究結(jié)果為番石榴葉有效成分的高效提取及其加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番石榴葉；超聲輔助低共熔溶劑法；有效成分；DPPH 自由基清除率；α-糖苷酶抑制活性

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

番石榴（Psidium guajava Linn.）為桃金娘科番石榴屬植物，番石榴葉片可入藥，具清熱解毒、生津止渴、澀腸止瀉等功效。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)了其顯著的抗氧化和降血糖等活性[1]，在天然抗氧化劑和降糖劑等開(kāi)發(fā)中具有廣闊前景。有效成分是中草藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，番石榴葉中主要有效成分包括三萜、黃酮、鞣質(zhì)、多糖等，其中三萜類物質(zhì)主要有齊墩果酸、烏蘇酸和積雪草酸等[2]，黃酮類成分主要有槲皮素、番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷等[3]。

提取工藝是影響有效成分提取率的關(guān)鍵因素，目前番石榴葉有效成分的提取多采用浸提法[4]、回流提取法[5]、超聲輔助法[6]等方法。提取溶劑的極性極大地影響了其對(duì)有效成分的提取率，而低共熔溶劑（deep eutectic solvents， DES）具有極性可調(diào)諧性，對(duì)各種極性的化合物均具有增溶作用。DES 作為綠色溶劑提取和分離天然產(chǎn)物中多酚類[7]、黃酮類、皂苷類[8]、三萜酸[9]等不同極性的化合物，在中藥提取分離領(lǐng)域具有很大潛力，目前已應(yīng)用于番石榴葉總黃酮（total flavonoids）的提取[10]，但未見(jiàn)用于總酚（total phenols）和總皂苷（total saponins）的提取。此前通過(guò)提取分離純化的方式，從番石榴葉醇提取物及乙酸乙酯萃取物中，主要鑒定出混源萜類化合物[11]，以及黃酮類成分如山奈酚、槲皮素等[12-13]。但這一分離純化過(guò)程耗時(shí)耗力，且難以發(fā)現(xiàn)其中痕量成分。近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatograph-massspectrometer，LC-MS）已成為探究化學(xué)成分的有效手段，但目前未見(jiàn)采用LC-MS 技術(shù)進(jìn)行番石榴葉成分的研究。

為了對(duì)番石榴葉的有效成分進(jìn)行高效提取，本研究以總黃酮、總皂苷、總酚及黃酮成分槲皮素、番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷與主要代謝物的含量為定量評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合功能活性DPPH 自由基清除能力與α-糖苷酶抑制率，探究不同提取方法對(duì)番石榴葉主要有效成分含量的影響，為番石榴葉食療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，從而促進(jìn)番石榴副產(chǎn)物的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試植物材料番石榴葉片采集于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，經(jīng)水果研究中心陳豪軍正高級(jí)農(nóng)藝師鑒定，葉片長(zhǎng)8～10 cm，寬3～5 cm。

1.1.2 儀器與試劑

試驗(yàn)所用儀器： ThermoVanquish 高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）、SU8100掃描電子顯微鏡、MC1000 離子濺射儀（Hitachi，Japan）、UV-1800PC 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、DHG-9070A 恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、L3.5TB1 熱泵干燥機(jī)（威爾信）、H1850-R 型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）、CP214 電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）、XL-30C 型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）、RE-5210A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、GTSONIC-T20 超聲波清洗儀（廣東固特超聲股份有限公司）、FlexiVap氮吹儀（維根技術(shù)（北京）有限公司）、恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

試驗(yàn)所用試劑：蘆?。ㄅ?hào)：Y2411Y17051）、熊果酸（批號(hào)：L03A6Y1）、番石榴苷（批號(hào)：P09J7F8764）、萹蓄苷（批號(hào)：P21S10S98394）、瑞諾苷（批號(hào)：P25J10S91433）、槲皮素（批號(hào)：C01J10Y91727）、沒(méi)食子酸（批號(hào)：J01IB218870）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（批號(hào)：JS239376）、α-葡萄糖苷酶（批號(hào)：S07HS193826）、阿卡波糖（批號(hào)：S25M11X109783，上海源葉生物科技有限公司）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）[西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（上海）]、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）（上海麥克林生化科技有限公司）、乙腈（Thermo FisherScientific）、甲酸（TCL，色譜純）、甲酸銨（ Sigma-Aldrich ， 純度≥ 99.0% ） ； 氯化膽堿[HOC2H4N（CH3）3Cl，ChCl]、乙二醇[（CH2OH）2，EG]、香草醛、冰醋酸、高氯酸、福林酚溶液、硝酸鋁、亞硝酸鈉、磷酸、甲醇、乙醇均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 番石榴葉提取

（1）浸漬法（maceratedextraction，ME）。將番石榴葉洗凈、去除枝梗泥沙等雜質(zhì)后經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，過(guò)40 目篩，得粉末備用。精密稱取2.00 g 番石榴葉粉末，以50 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取溶劑，置于錐形瓶中旋渦攪拌均勻，靜置15 h，提取3 次。

（2）熱回流法（heat reflux extraction，HRE）。精密稱取2.00 g 番石榴葉粉末，以50 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取溶劑，置于圓底燒瓶中旋渦攪拌均勻，90 ℃水浴下加熱回流1.5 h，提取3 次。

（ 3 ） 超聲輔助乙醇法（ ultrasound-assistedalcohol extraction，UAAE）。稱取2.00 g 番石榴葉粉末放入錐形瓶中，以50 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取溶劑，旋渦攪拌后，50 ℃下以465 W超聲功率提取1.5 h，提取3 次。

（4）超聲輔助低共熔溶劑法（ultrasound-assisteddeep eutectic solvents extraction，UADEE）。

參考王慧[14]的試驗(yàn)方法，氯化膽堿（ChCl）經(jīng)80 ℃恒溫干燥24 h 后，按物質(zhì)的量濃度比例1∶1 與乙二醇（EG）于圓底燒瓶中混合，90 ℃恒溫水浴攪拌，直至DES 體系變得透明、均一、穩(wěn)定。將所配DES 溫度降至室溫，密封干燥14 d以上后，溶解于去離子水中，充分搖勻、靜置，配制得含水率為40%（按體積分?jǐn)?shù)計(jì)）的均一透明DES 水溶液（ChCl：EG）。

稱取2.00 g 番石榴葉粉末放入錐形瓶中，以50 mL 配制的DES 水溶液為提取溶劑，旋渦攪拌，50 ℃下以465 W 超聲功率提取1.5 h，提取3 次。

1.2.2 掃描電子顯微鏡觀察

參照陳紅惠等[15]的方法，利用掃描電子顯微鏡（scanning electronmicroscope，SEM）觀察提取前后的番石榴葉樣品。稱取適量干燥番石榴葉粉末進(jìn)行ME、HRE、UAAE 和UADEE 處理，過(guò)濾后收集濾渣，60 ℃熱風(fēng)干燥箱中烘干至粉末狀。將處理后樣品用導(dǎo)電膠粘于樣品臺(tái)噴金30 s，在3.0 kV 電壓，高真空條件下，進(jìn)行SEM 觀察。

1.2.3 總黃酮、總皂苷、總酚含量測(cè)定

番石榴葉總黃酮含量通過(guò)NaNO2-Al（NO3）3 比色法[16]測(cè)定，以蘆丁為對(duì)照品，在505 nm 處測(cè)定其吸光度。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.9184X+0.0043（R2=0.9983）；總皂苷含量通過(guò)香草醛-冰醋酸比色法[17]測(cè)定，以熊果酸為對(duì)照品，在548 nm 處測(cè)定吸光度，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0098X+0.0517（R2=0.9905）；總酚含量采用福林酚法[18]測(cè)定，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，在765 nm 處測(cè)定吸光度，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0107X+0.003（R2=0.9975）。

1.2.4 高效液相色譜法（HPLC）分析番石榴葉黃酮成分

（1）色譜條件。參照方皓等[3]的方法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱：Agilent eclipse plus C18 柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）?0.2%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：起始為11% A，89% B；15 min 時(shí)A 為13.5%，B 為86.5%；30 min 時(shí)A 為18%，B 為82%，保持至40 min；65 min 時(shí)A 為49%，B 為51%；70 min 時(shí)A 為11%，B 為89%；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

（2）對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱定各對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為1 mg/mL 的番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷、槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，依次精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液200、150、100、50、25、10 μL 于6 個(gè)10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（Y）與進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程，番石榴苷：Y=7.345X+0.052（R2=0.999，線性范圍為0.330～10.530 mg/L）；萹蓄苷：Y=3.396X62.936（R2=0.999，線性范圍為0.324～10.940 mg/L）；瑞諾苷Y=7.613X+0.075（R2=0.999，線性范圍為0.334～10.190 mg/L）；槲皮素：Y=11.599X～0.344（R2=0.999，線性范圍為0.366～10.480 mg/L）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計(jì)算樣品中4 種黃酮成分的含量。

1.2.5 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）分析番石榴葉代謝物

（1）色譜條件。Thermo Vanquish 超高效液相系統(tǒng)，使用ACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱（2.1×150 mm，1.8 μm，Waters，Milford，MA，USA），流速為0.25 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。正離子模式，流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A2）和0.1%甲酸乙腈（B2）；負(fù)離子模式，流動(dòng)相為5 mol/L 甲酸銨水（A3）和乙腈（B3），梯度洗脫程序?yàn)椋赫x子模式起始為98% A2，2%B2，負(fù)離子模式起始為98% A3，2% B3，保持至1 min；9 min 時(shí)A2 為50%，B2 為50%，A3 為50%，B3 為50%；12 min 時(shí)A2 為2%，B2 為98%，A3 為2%，B3 為98%，保持至13.5 min；14 min時(shí)A2 為98%，B2 為2%，A3 為98%，B3 為2%；保持至20 min。

（2）質(zhì)譜條件。Thermo Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧離子源（ESI）。正負(fù)離子噴霧電壓分別為3.50 kV、?2.50 kV，毛細(xì)管溫度為325 ℃，一級(jí)全掃描分辨率為60000，離子掃描范圍為m/z 100～1000，二級(jí)裂解分辨率為15000。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

取不同處理組的番石榴葉提取液各1 mL，用氮?dú)獯蹈?，分別復(fù)溶于一定體積的80%乙醇溶液中，制成待測(cè)樣品溶液。參照J(rèn)IANG 等[19]的方法測(cè)定：于酶標(biāo)板中分別加入100 μL 樣品溶液與100 μL0.15 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm 處測(cè)定吸光度（As1）。以100 μL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液分別代替DPPH-乙醇溶液作為樣品對(duì)照（Ab1）、代替樣品溶液作為空白對(duì)照（Ac1），以BHT 和Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品DPPH 自由基清除率計(jì)算方式見(jiàn)公式（1），繪制清除率與樣品溶液的質(zhì)量濃度關(guān)系曲線，根據(jù)曲線計(jì)算樣品的IC50 值。以IC50 值表示樣品的DPPH 自由基清除能力。計(jì)算公式：

式中，As1 為樣品組吸光度；Ab1 為樣品對(duì)照組吸光度；Ac1 為空白對(duì)照組吸光度。

1.2.7 α-葡萄糖苷酶抑制能力的測(cè)定

取不同處理組的番石榴葉提取液各1 mL，用氮?dú)獯蹈珊?，分別復(fù)溶于一定體積的蒸餾水中，制成待測(cè)樣品溶液。參照李云嵌等[18]的方法測(cè)定：取樣品溶液50 μL 與α-葡萄糖苷酶溶液25 μL 混合，于37 ℃水浴反應(yīng)10 min 后加入5 mmol/L PNPG 溶液50 μL，37 ℃下恒溫水浴15 min，加入0.2 mol/LNa2CO3 溶液100 μL 終止反應(yīng)，于405 nm 下測(cè)定吸光值（As2）。以25 μL 蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶溶液作為樣品對(duì)照（Ab2），以50 μL 蒸餾水代替樣品溶液作為空白對(duì)照（Ac2），阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率通過(guò)公式（2）計(jì)算，繪制抑制率與樣品溶液的質(zhì)量濃度關(guān)系曲線，根據(jù)曲線計(jì)算樣品的IC50 值。以IC50值表示樣品的α-葡萄糖苷酶抑制能力。計(jì)算公式：

式中，As2 為樣品組吸光度；Ab2 為樣品對(duì)照組吸光度；Ac2 為空白對(duì)照組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示， 采用GraphPad Prism 9.0 軟件作圖，應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)番石榴葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

樣品結(jié)構(gòu)的破壞程度與不同提取方式有直接關(guān)系。由圖1 可知，對(duì)照組樣品（干燥番石榴葉粉末）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，均勻致密；ME 組樣品表面呈現(xiàn)疏松結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)大部分完整；HRE 組樣品表面有少數(shù)部位穿孔，形成小的空穴，說(shuō)明HRE 對(duì)物料結(jié)構(gòu)破壞力較小，有效成分從物料中溶出有限；UAAE 和UADEE 組樣品表面出現(xiàn)更大的空穴結(jié)構(gòu)。

2.2 提取方法對(duì)番石榴葉總黃酮、總皂苷、總酚提取效果的影響

本研究中不同組別番石榴葉有效成分如表1所示。UADEE 組番石榴葉總皂苷、總黃酮、總酚含量顯著高于ME、HRE、UAAE 組（Plt;0.05）。在總皂苷和總黃酮的提取中，UAAE 與HRE 組的提取效果差異不顯著，均顯著優(yōu)于ME 組（Plt;0.05）；但在總酚提取中，UAAE 與ME 組差異不顯著，提取效果顯著優(yōu)于HRE 組（Plt;0.05）。

2.3 提取方法對(duì)番石榴葉黃酮成分提取效果的影響

本研究中各組樣品的HPLC 色譜圖如圖2 所示，4 種黃酮成分含量如圖3 所示。UADEE 組4種黃酮成分總含量（21.57 mg/L）顯著高于其他3組（Plt;0.05）。ME 組的番石榴苷、萹蓄苷、瑞諾苷含量分別為1.88、1.82、0.87 mg/L，UAAE和UADEE 組中這3 種黃酮成分含量均顯著高于ME 組（Plt;0.05）。其中番石榴苷含量在UAAE、UADEE 組中分別為4.03、7.96 mg/L，萹蓄苷含量分別為3.94、7.74 mg/L，瑞諾苷含量分別為1.92、3.99 mg/L。ME、UADEE 組中槲皮素含量最高，分別為2.05、1.86 mg/L，顯著高于HRE組（1.49 mg/L）和UAAE 組（0.51 mg/L）（Plt;0.05）。

2.4 番石榴葉代謝物檢測(cè)分析

為探討提取方式對(duì)番石榴葉主要有效成分黃酮、皂苷和酚類物質(zhì)的影響，基于LC-MS 對(duì)番石榴葉提取液進(jìn)行非靶向檢測(cè)，得到提取液的正負(fù)離子采集譜圖（圖4）。代謝物的鑒定首先根據(jù)精確分子量進(jìn)行確認(rèn)，后續(xù)將MS/MS 碎片模式與Human Metabolome Database （HMDB） （http：//www.hmdb.ca）、LipidMaps （http：//www.lipidmaps.org）、mzClound （https：//www.mzcloud.org）以及帕諾米克自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)注釋獲得代謝物。從番石榴葉提取液中鑒定出黃酮類代謝物44 種，三萜類代謝物10 種，酚類代謝物13 種。采用峰面積歸一法計(jì)算黃酮類成分、三萜類成分和酚類成分相對(duì)含量，如圖5 所示，ME、HRE、UAAE和UADEE 處理組中黃酮類成分在番石榴葉總代謝物中分別為9.830% 、9.714% 、11.493% 和12.208%；三萜類成分分別為15.815%、21.706%、26.286%和27.267%；酚類成分分別為0.731%、0.930%、0.773%和1.013%。番石榴葉中相對(duì)含量最高的10 種黃酮類成分為槲皮素、木犀草素、楊梅苷、染料木素、異牡荊素、水飛薊素、表兒茶素、黃芩素、去甲基陳皮素和蘆丁，最主要的三萜類物質(zhì)為熊果酸、山楂酸、黃柏酮、雷公藤紅素和Fasciculic acid B，主要的酚類物質(zhì)為鞣花酸、香蘭素、羥基酪醇、高原兒茶酸和姜酮酚。不同提取方法對(duì)番石榴葉不同代謝物的提取效果具有明顯差異，UADEE 處理的提取液中槲皮素、染料木素、蘆丁、熊果酸的含量高于其他3 種處理方法，而楊梅苷、異牡荊素和山楂酸的含量則較低。

2.5 不同提取方法對(duì)番石榴葉生物活性的影響

番石榴葉提取物DPPH 清除率和α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50 值如圖6 所示，各組樣品DPPH清除率和α-葡萄糖苷酶抑制率差異顯著。4 個(gè)提取處理中，UADDE 組DPPH 自由基的清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性均最強(qiáng)（Plt;0.05），IC50值分別為45.18 μg/mL 和904.67 μg/mL，DPPH 清除能力與陽(yáng)性對(duì)照組Vc 水平相當(dāng)，但弱于抗氧化劑BHT，α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著弱于陽(yáng)性降糖藥物阿卡波糖。

3 討論

本研究結(jié)合內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)、功能成分及其生物活性，聯(lián)合評(píng)價(jià)ME、HRE、UAAE 與UADEE四種提取方法對(duì)番石榴葉的提取效果。結(jié)果表明UAAE 與UADEE 兩種處理極大地破壞了細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，這是由于植物細(xì)胞壁在超聲的機(jī)械效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)下發(fā)生破裂，使物料結(jié)構(gòu)疏松，從而加速植物中有效成分的擴(kuò)散和溶出[20]。超聲波的空化效應(yīng)，促使溶劑更大程度地滲入細(xì)胞中，不斷刺激胞內(nèi)腺體，增加傳質(zhì)速率[21]。皂苷、黃酮和酚類物質(zhì)是番石榴葉的主要有效成分，提取溶劑對(duì)目標(biāo)成分的溶解度是影響提取率的關(guān)鍵因素之一。黃酮和酚類的提取通常采用回流法或超聲輔助有機(jī)試劑法，皂苷的提取通常采用超聲波輔助表面活性劑增溶技術(shù)[15， 22-23]，如薯蕷皂苷、三七花總皂苷和苦瓜皂苷等。本研究中UADEE 組的總黃酮提取率為8.05%，高于目前研究中回流或超聲提取等方法的番石榴葉總黃酮提取率（0.497%～5.12%[5， 24-25]），但低于蔣利榮等[10]研究中UADEE 法的總黃酮提取率（ 15.97%～22.06%）。馬連榮等[26]、鄢文等[27]測(cè)定番石榴葉中總皂苷含量為7.08 mg/mL 和15.14 mg/mL，本研究中各組總皂苷含量為46.61～79.28 mg/g，其中UADEE 組提取率比ME 組提高70.09%，比UAAE組提高21.58%，而陳冉等[8]利用UADEE 提取雞骨草總皂苷，提取率比傳統(tǒng)有機(jī)試劑提取法提高96.4%，這些差異可能與DES 氫鍵配體受體的組成及DES 溶劑含水率等因素有關(guān)。

番石榴葉中的代表性黃酮類成分為槲皮素、番石榴苷、萹蓄苷（廣寄生苷）和瑞諾苷等，其含量是衡量番石榴葉藥材品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。方皓等[3]以60%乙醇超聲提取30 min 后測(cè)到這4 種黃酮成分的總含量約為58.3 mg/g，本研究UADEE 組4 種黃酮成分總含量為21.57 mg/L，顯著高于其他3 組（Plt;0.05），與總黃酮測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致； 其中番石榴苷和萹蓄苷總含量為15.70 mg/g，高于朱曉艾等[28]采用64.6%乙醇提取81 min 的含量，測(cè)出的番石榴苷和萹蓄苷最高總含量為6.74 mg/g。ME 組提取體系缺乏濃度差，HRE 組較高的提取溫度則會(huì)導(dǎo)致皂苷發(fā)生脫羧、脫糖、脫水反應(yīng)而轉(zhuǎn)化；某些穩(wěn)定性差的酚類、黃酮類物質(zhì)也易受溫度的影響，發(fā)生氧化、聚合或分解等反應(yīng)，從而影響提取率[29-30]；而組成DES的組分間協(xié)同效應(yīng)使其對(duì)番石榴葉有效成分具有增溶作用，因而造成提取效果的差異。此前研究者們從番石榴葉分離得到一系列黃酮及其各類糖苷與苷元，包括槲皮素、芹菜素、楊梅素、兒茶素、膠藤素、去甲氧基莢果蕨素、山奈酸、萹蓄苷、金絲桃苷、異槲皮苷等[13， 31-32]。本研究基于LC-MS 非靶向測(cè)定出黃酮類成分44 種，三萜類成分10 種、酚類成分13 種。槲皮素是多種黃酮苷的苷元，據(jù)報(bào)道，蘆丁、槲皮素等代謝物在DES中的溶解度是在水中的十倍至數(shù)十萬(wàn)倍[33]，本實(shí)驗(yàn)中UADEE 組提取到的蘆丁和槲皮素含量顯著高于UAAE 組。熊果酸是番石榴葉中主要的三萜類成分，被證實(shí)是番石榴葉主要的降血糖活性成分，本研究中UADEE 對(duì)熊果酸的效果最優(yōu)；多酚成分鞣花酸具有與槲皮素相當(dāng)或更高的抗氧化活性[34]，其可能也是番石榴葉發(fā)揮抗氧化活性的有效成分。以上研究進(jìn)一步豐富了番石榴葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，本研究結(jié)果表明提取方法對(duì)番石榴葉不同代謝物的溶出具有重要影響，為番石榴葉特定成分的提取與利用提供參考。

DPPH 目前被廣泛用于抗氧化劑清除自由基能力的快速評(píng)價(jià)，α-葡萄糖苷酶被認(rèn)為是Ⅱ型糖尿病的重要靶標(biāo)[35]。此前趙玉靜等[12]發(fā)現(xiàn)番石榴葉醇提液中的6 個(gè)黃酮類化合物，均具有顯著抗氧化活性。張婷婷[2]研究中表明三萜皂苷類物質(zhì)為番石榴葉降血糖活性物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)各組番石榴葉提取物DPPH 清除率和α-葡萄糖苷酶抑制率差異顯著，HRE 組DPPH 的清除能力最弱，ME 組的α-葡萄糖苷酶抑制率最低，UADDE 組DPPH 自由基的清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性均最強(qiáng)（Plt;0.05）。這與番石榴葉有效成分總皂苷、總黃酮和總酚含量測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致，表明這3 種成分可能是番石榴葉抗氧化和降糖功能的發(fā)揮的活性成分。綜上，不同提取方式下（ME、HRE、UAAE、UADEE）番石榴葉有效成分含量與生物活性差異顯著，綜合而言，UADEE 法對(duì)番石榴葉的有效成分提取效果最佳，研究結(jié)果可為提高番石榴副產(chǎn)物的綜合利用率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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