摘 要：作為一種非生物脅迫，干旱導致經(jīng)濟作物產(chǎn)量和質量下降，從而嚴重影響其經(jīng)濟效益，因此，一些能夠替代化學抗旱制劑且對植物具有促生作用的功能微生物亟待發(fā)掘。本研究以武夷山茶園土壤細菌為研究對象，篩選獲得高分泌吲哚乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）能力的強抗旱菌株，并對其進行最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化和全基因組測序分析。結果表明：獲得1 株具有高分泌IAA 能力的強抗旱菌株SZF7，其抗旱能力強于其他同批次篩選的菌株，經(jīng)鑒定SZF7 為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）；SZF7 分泌IAA 的最佳培養(yǎng)條件為pH 5.0、溫度37 ℃和培養(yǎng)時間24 h，且pH 和溫度對其IAA 分泌量具有顯著影響；SZF7 基因組的COG 和KEGG 代謝途徑中，參與生物代謝大類的基因數(shù)量分別占總功能基因的47.96%和68.52%，且其基因組包含IAA、鐵載體、非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase， NRPS）、脂肽類化合物和嗜鐵素等植物促生相關基因；SZF7 的IAA 合成途徑分別為由吲哚-3-丙酮酸脫羧酶催化的吲哚-3-丙酮酸途徑和吲哚-3-甘油磷酸合成酶催化的色胺酸途徑。本研究結果為抗旱促生菌劑在茶葉等經(jīng)濟作物生產(chǎn)上的應用提供科學依據(jù)。

關鍵詞：促生菌；吲哚乙酸；抗旱；培養(yǎng)條件優(yōu)化；全基因組分析

中圖分類號：S154.39 文獻標志碼：A

茶樹[Camellia sinensis （L.）]廣泛分布于中國熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重要的多年生特色經(jīng)濟作物之一[1-2]。隨著全球氣溫的不斷上升，高溫、干旱等極端天氣持續(xù)時間長，使我國大部分茶園深受極端天氣的危害，尤其是作為世界烏龍茶發(fā)源地的武夷山[3-4]。干旱致使茶樹生長受到抑制，對茶葉產(chǎn)量和質量都造成了不可逆轉的傷害，從而嚴重制約了武夷山及我國茶產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展和經(jīng)濟效益的提高[3]。因此，除了關注茶樹自身對干旱脅迫的應對策略外，根際微生物對提高茶樹抗旱能力的研究已成為當前的研究熱點[3， 5]。

根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類生存于植物根際土壤中通過產(chǎn)生植物必需激素或轉化產(chǎn)生可溶性礦物質等直接或間接促進植物生長的有益微生物[5]。其中，PGPR 分泌的吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是一種天然生長素，具有促生和抗旱等有益功能[6-8]。植物根際的大部分PGPR，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、變形桿菌屬（Proteus）等均可分泌IAA[9]。PGPR的IAA 合成途徑中包括吲哚-3-丙酮酸和色氨酸等多種途徑，并且一種PGPR 中可能同時存在多條合成途徑[10]。研究表明，由吲哚-3-丙酮酸脫羧酶（indole-3-pyruvate decarboxylase）介導的吲哚-3-丙酮酸途徑是大部分PGPR 中最基本和最主要的IAA 合成途徑，其次是由吲哚-3-甘油-磷酸合酶（indole-3-glycerol phosphate synthase）介導的色氨酸途徑[11]。IAA 通常作用于根際細胞壁，促進植物根系生長，從而提高植物水分吸收和土壤養(yǎng)分獲取能力以應對干旱環(huán)境[12]。如蘇云金芽孢桿菌分泌的IAA 有利于植物中鉀和脯氨酸的積累，從而促進其生長并緩解干旱脅迫[7]；黃精根際土壤中芽孢桿菌和葡萄球菌分泌的IAA 均具有促進黃精種子萌發(fā)的效果[13]。

鑒于高IAA 分泌型PGPR 對植物抗旱和生長的重要性，開展抗旱促生菌的篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化和功能基因挖掘，對其在農業(yè)生產(chǎn)上的生物抗旱應用具有重要意義。本研究從武夷山茶園土壤中分離獲得的微生物中篩選出高分泌IAA 的強抗旱菌株，探究其最佳培養(yǎng)條件，利用全基因組測序分析其相關功能基因和抗旱機理，研究結果為促生菌劑在干旱農業(yè)生產(chǎn)上的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

由課題組篩選到的武夷山茶園根際土壤細菌130 株[14]。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

聚 乙 二 醇（PEG6000，上海易恩化學技術有限公司）；Salkowski試劑（7.9 mol/L H2SO4 含12 g/L FeCl3）。培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基：每升含胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 6.0，固體培養(yǎng)基再加瓊脂20 g；模擬干旱培養(yǎng)基：于LB 液體培養(yǎng)基中添加PEG 6000 使其濃度達25%[15]。

1.2 方法

1.2.1 菌株分泌的IAA 含量測定

菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，取菌液經(jīng)10 000 r/min 離心10 min，取上清液測定IAA 含量。IAA 含量測定參考GUSMIATY 等[16]的方法略加改進，即在上清液中加入Salkowski 比色液于室溫下暗培養(yǎng)24 h 后呈粉紅色，使用分光光度計在520 nm 波長下測量吸收值，將獲得的吸收值代入標準曲線計算IAA 含量。

1.2.2 抗旱菌株的篩選選取

1.2.1 中高分泌IAA 能力的菌株進行培養(yǎng)，取對數(shù)期的菌液為種子液，以1%體積分數(shù)接種至添加25%PEG 6000（滲透壓為–0.735 MPa）的LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，使用分光光度計在600 nm 波長下測量菌液濃度，同時使用無菌培養(yǎng)液作為空白對照，以此條件模擬極端干旱脅迫環(huán)境下菌株的生長情況[15]。即用25%PEG 6000 模擬培養(yǎng)基培養(yǎng)后，根據(jù)菌液的光密度（OD600）值可以將菌株的抗旱能力分為高度敏感型（OD600lt;0.30）、敏感型（0.30≤OD600lt;0.40）、耐受型（0.40≤OD600≤0.50）和完全耐受型（OD600gt;0.50）[15]。

1.2.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化以

1.2.1 與1.2.2 為基礎，篩選出具有高抗旱能力的促生菌株SZF7，對該菌株進行促分泌IAA 能力的培養(yǎng)條件優(yōu)化。

選取pH、培養(yǎng)時間和溫度3 個因素不同水平分別對SZF7 分泌IAA 能力的影響進行研究。其中，pH 設置4.5、5.0、5.5、6.0 共4 個水平，培養(yǎng)溫度設置28、31、34、37、40 ℃共5 個水平，培養(yǎng)時間設置6、9、13、24、27、30 h 共6 個水平。根據(jù)單因素試驗結果，進行3 因子3 水平L9（34）正交試驗，即pH（4.5、5.0、5.5）、溫度（34、37、40 ℃）和培養(yǎng)時間（24、27、30 h），以確定最佳培養(yǎng)條件組合。

1.2.4 菌株形態(tài)學和生物信息學分析

首先取菌株SZF7 的純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色后觀察其形態(tài)。再將純培養(yǎng)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，構建400 bp 的插入片段，利用二代測序平臺Illumina 進行PE150（pair-end）測序，并將其組裝得到多條基因組scaffold。通過MEGA 10.1.7軟件選擇NJ（neighbor-joining）法構建系統(tǒng)進化樹[17]，利用Gene Mark S 軟件對基因組中存在的蛋白編碼序列（CDS）進行預測，采用Diamond軟件對多類數(shù)據(jù)庫注釋進行分析比對，以提供NR、Swiss-Prot、P-fam、COG[18]、GO 及KEGG[19]的預測結果，使用antismash 網(wǎng)站[20]進行次級代謝物合成基因簇的注釋、分析和預測，分析菌株潛在的合成次生代謝產(chǎn)物的能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過 Frequnce 函數(shù)對不同菌株的IAA 分泌能力進行分組分析，使用IBM SPSS Statistics 24 軟件進行方差分析，利用Duncan’s 檢驗法進行單因素的差異性分析，利用Origin 2024 軟件進行數(shù)據(jù)整理和可視化。

2 結果與分析

2.1 菌株的IAA 含量

根據(jù) 130 株菌株的IAA 分泌能力可將其分為3 組，IAA 分泌能力較低的共6 株，占4.615%，IAA 含量在2.69～4.97 mg/L 之間；IAA 分泌能力一般的共82 株，占63.077%，IAA 含量在5.09～8.81 mg/L 之間；IAA 分泌能力強的共42 株，占32.308%，IAA 含量在9.02～21.91 mg/L 之間。

2.2 強抗旱菌株的篩選

從 IAA 分泌能力強的42 株菌株中篩選到7株強抗旱能力菌株：SX-MWS5、HHG-GS4、TM1200m5、HCQT1、NLK11、WQH3、SZF7，在25%PEG 6000 模擬干旱條件下菌液的OD600 值分別為0.75、0.90、1.00、1.02、1.14、1.16、1.20，均大于0.50，表明這些菌株的抗旱能力均為完全耐受型。其中菌株SZF7 的OD600 值最高，后續(xù)試驗以該菌株作為研究對象作進一步研究。

2.3 SZF7 菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗 SZF7 的IAA 分泌量隨著pH的升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢，pH 為5.0 時，IAA分泌量最高，而pH 為6.0 時則最低（圖1A）。在溫度為28～37 ℃時，SZF7 的IAA 分泌量呈線性增加，37 ℃時的IAA 分泌量顯著高于其他溫度，而40 ℃時IAA 分泌量驟減（圖1B）。SZF7 的IAA分泌量隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在24 h 時達到最高值，而后進入平臺期（圖1C）。

2.3.2 正交試驗

由表 1 可知，3 個因素對SZF7IAA 分泌量的影響順序為溫度（B）gt;pH（A）gt;時間（C）。正交試驗表明，SZF7 分泌IAA 的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C1，即pH 為5.0、溫度為37 ℃、培養(yǎng)時間為24 h。多因素方差分析結果如表2 所示，pH（A）和溫度（B）均顯著影響SZF7 菌株的IAA 分泌量（Plt;0.05）。

2.4 SZF7 菌株的形態(tài)學觀察和進化樹分析

革蘭氏染色結果顯示，SZF7 菌體呈桿狀，紫色，判斷為革蘭氏陽性菌（圖2）。通過與數(shù)據(jù)庫比對，選擇在種屬水平上最接近的19 株菌與SZF7構建系統(tǒng)進化樹，由圖3 得知，SZF7 與Bacilluscereus AQ 的相似度為99.70%。

2.5 SZF7 菌株的全基因組測序分析

基于全基因組測序，分析得到SZF7 菌株的基因組大小為6 136 427 bp，共有64 個scaffold，其中，最大的scaffold 長度為896 672 bp，N50 為246 917 bp，基因GC 含量為34.75%。這些參數(shù)表明樣品測序質量較高，結果可靠。

2.5.1 COG 代謝途徑

SZF7 菌株基因組在COG數(shù)據(jù)庫中注釋到的功能基因數(shù)量為5132 個，劃分為23 個功能組（圖4）。其中數(shù)量前5 位的功能基因類型依次為一般功能預測（general functionprediction only， R）、轉錄（transcription， K）、氨基酸運輸和代謝（amino acid transport and metabolism，E）、細胞壁/膜/被膜的生物合成（cell wall/ membrane/envelope biogenesis， M）、碳水化合物運輸和代謝（carbohydrate transport and metabolism， G）

SZF7 的COG 代謝通路中參與生物代謝大類的基因類型（占比）有：氨基酸運輸和代謝（aminoacid transport and metabolism， E， 8.89%）、碳水化合物運輸和代謝（carbohydrate transport and metabolism，G， 6.33%）、輔酶運輸和代謝（coenzymetransport and metabolism， H， 5.75%）、信號傳導與代謝（signal transduction mechanisms， T， 5.67%）、無機離子轉運和代謝（inorganic ion transport andmetabolism， P， 5.07%）、能量產(chǎn)生與轉化（energyproduction and conversion， C， 4.33%）、脂質運輸和代謝（lipid transport and metabolism， I， 3.78%）、防御代謝（defense mechanisms， V， 3.45%）、核苷酸轉運和代謝（nucleotide transport and metabolism，F(xiàn)， 2.90%）、次級代謝物合成轉運分解和代謝（secondary metabolites biosynthesis， transport andcatabolism， Q， 1.79%），這些生物代謝相關功能基因在總功能基因中的占比達47.96%。表明SZF7菌株中存在豐富的生物代謝相關基因和蛋白，具有強大的生物代謝潛能。

2.5.2 KEGG 代謝途徑

SZF7 菌株的基因組在KEGG 數(shù)據(jù)庫中注釋到4523 個功能基因，劃分為6 個功能組：細胞過程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、人類疾?。╤uman diseases）、代謝（metabolism）、有機系統(tǒng)（organismal systems）（圖5）。

其中，參與生物代謝相關的基因類型（占比）有全局和概述圖譜（global and overview maps，27.57%）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism，8.69%）、氨基酸代謝（amino acid metabolism，7.30% ）、輔助因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins， 5.68%）、能量代謝（energy metabolism， 3.89%）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism， 2.90%）、其他氨基酸代謝（metabolism of other amino acids， 2.81%）、脂質代謝（lipid metabolism， 2.72%）、聚糖生物合成和代謝（glycan biosynthesis and metabolism，2.43%）、其他次生代謝物生物合成（biosynthesisof other secondary metabolites， 1.86%）、異性生物質降解和代謝（ xenobiotics biodegradation andmetabolism， 1.72% ）、萜類和聚酮類代謝（ metabolism of terpenoids and polyketides，0.95%）。這些功能基因數(shù)量明顯高于其他類型功能基因，占總功能基因數(shù)量的68.52%。表明SZF7具有較強的代謝產(chǎn)物合成能力。

2.5.3 次級代謝合成基因簇分析

由表 3 可知，預測到17 個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，其中，Cluster9、Cluster12 和Cluster14 基因簇與已知的基因簇序列相似度高達100%，表明SZF7 具備產(chǎn)生鐵載體和非核糖體肽合成酶（ nonribosomalpeptide synthetase， NRPS）的潛在能力。此外，還有6 個基因簇與已知基因簇的相似度介于17%～46%之間，這些基因簇涉及脂肽類化合物、嗜鐵素、鉬輔因子以及羊毛硫細菌素等相關基因的合成。

2.5.4 IAA 合成途徑相關基因分析

如表 4 所示，通過對菌株相關基因進行注釋分析發(fā)現(xiàn)，SZF7 中包含由ipdC 基因編碼的吲哚-3-丙酮酸脫羧酶，該酶通過吲哚-3-丙酮酸途徑催化IAA 合成；以及由trpC 基因編碼的吲哚-3-甘油磷酸合成酶，該酶通過色胺酸途徑催化IAA 合成。說明SZF7 存在高效的IAA 合成途徑，具有高分泌IAA的潛在能力。

3 討論

抗旱微生物制劑是利用具有植物促生和抗旱功能的微生物協(xié)助植物應對干旱脅迫的一類生物制品[21]?？购倒δ芪⑸镆环矫嫱ㄟ^分泌IAA 等生長素以促進植物生長發(fā)育，另一方面通過誘導植物生理和生化等方面的變化來增強其抵御干旱的能力或提高其干旱脅迫后的恢復能力，從多方面協(xié)助植物抵御干旱脅迫[22]，具有生產(chǎn)成本低、可持續(xù)發(fā)展和對環(huán)境友好等優(yōu)勢，可作為化學抗旱制劑的理想替代品[21]。

本研究從武夷山茶園土壤中篩選出1 株高IAA 分泌的抗旱細菌SZF7，經(jīng)分子生物學鑒定表明其為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。IAA 分泌型菌株通過調節(jié)植物根系分布、促進側根的發(fā)育和加強細胞中水分運輸?shù)确绞絹砭S持根系充足的水分[23-25]，SZF7 的高IAA 分泌活性可能是促進其抗旱能力的重要因素。SZF7 在25%PEG 6000 模擬干旱條件下的OD600 值高達1.20，抗旱能力為完全耐受型，該菌株的抗旱能力與孫亞欽等[26]從玉米根際土壤中篩選獲得的抗旱菌株相當。然而，由于不同菌株的生理特性等方面具有差異，其分泌IAA 的最佳培養(yǎng)條件往往不同，如特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）分泌IAA 的最適培養(yǎng)條件是pH 8.0、30 ℃條件下經(jīng)20 h 搖床培養(yǎng)[27]，彎曲芽孢桿菌（B. flexus）分泌IAA 的最適培養(yǎng)條件是30 ℃下經(jīng)44 h 搖床培養(yǎng)[28]。而本研究獲得的芽孢桿菌SZF7 分泌IAA 的最佳培養(yǎng)條件是pH 為5.0、溫度為37 ℃、培養(yǎng)時間為24 h，且各因素對分泌IAA 影響順序依次為溫度、pH 和時間，其中pH 和溫度對SZF7 菌株的IAA 分泌能力具有顯著影響。

IAA 分泌型菌株的抗旱機理主要是誘導脅迫相關基因的轉錄和產(chǎn)生特異蛋白來調控細胞內穩(wěn)態(tài)，從而促進植株對干旱環(huán)境的耐受性[24-25， 29]。全基因組分析表明，SZF7 與代謝相關的功能基因數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢，表明其具有較強的代謝能力。此外，SZF7具有鐵載體、NRPS、脂肽類化合物、嗜鐵素、鉬輔因子和羊毛硫細菌素等次級代謝產(chǎn)物合成基因簇。NRPS 介導了多種有益代謝產(chǎn)物的合成，對促生菌的生防功能至關重要[30]。鐵載體能夠促進大豆、玉米和連香樹等植物根系的水分吸收和生長發(fā)育[31-33]。脂肽類化合物和嗜鐵素也是促進植物生長的相關因子[30]。SZF7 存在2 條合成IAA的代謝途徑，分別為吲哚-3-丙酮酸脫羧酶介導的吲哚-3-丙酮酸途徑和吲哚-3-甘油磷酸合成酶介導的色胺酸途徑。這2 條高效合成途徑合成的大量IAA 有利于植物招募有益菌群和提高抗旱能力[29-30]。研究結果表明，SZF7 是一株抗旱功能明顯的高IAA 分泌芽孢桿菌，該菌株具有豐富的生物代謝功能基因，且存在高效的IAA 合成途徑，在植物抗旱促生方面具有良好的應用前景。

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基金項目 福建省科技廳引導性項目（No. 2020N0032， No. 2022N0026）；國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2023YFD1701703）。