摘要：根據(jù)GenBank已登錄的經(jīng)典兔黏液瘤病毒（MYXV）和重組兔黏液瘤病毒（ha-MYXV）基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立能同時(shí)檢出ha-MYXV和MYXV病原的快速、簡(jiǎn)單且敏感性較高的TaqMan探針熒光定量PCR臨床檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，稀釋度為1×10⁷～1×10³"拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1.00；該方法對(duì)MYXV和ha-MYXV具有高度特異性，與綠膿桿菌、兔多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型等其他病原間無交叉反應(yīng)；檢測(cè)靈敏度可達(dá)1×10²"拷貝/μL；組內(nèi)和組間變異系數(shù)在0.05%～1.19%間。該方法的建立為引進(jìn)種兔及家兔相關(guān)產(chǎn)品兔黏液瘤病毒的檢疫提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：兔黏液瘤??；經(jīng)典兔黏液瘤病毒；重組兔黏液瘤病毒；TaqMan qPCR

中圖分類號(hào)：S852.65""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）01-0226-05

兔黏液瘤?。╩yxomatosis）是由兔黏液瘤病毒（rabbit myxoma virus，MYXV）引起的一種高度接觸性、致死性傳染病。該病的主要表現(xiàn)為兔雙側(cè)眼瞼結(jié)膜炎、鼻出血、多器官強(qiáng)烈充血和水腫，以及一些內(nèi)部出血^［1］。該病最早發(fā)現(xiàn)于1896年烏拉圭蒙得維的亞的實(shí)驗(yàn)室的兔子^［2］。1898年烏拉圭科學(xué)家首次從試驗(yàn)兔分離到該病毒^［3］。1927年，該病毒被確定為痘病毒，后被澳大利亞引入用作控制野兔數(shù)量^［3-4］，并迅速在南美、英國、法國等地蔓延^{［1，5–7］}。

目前，MYXV在美國、南歐、新西蘭和澳大利亞的兔種群中呈持續(xù)性感染，引起慢性地方性動(dòng)物傳染病^［8］。2018年，一種新型重組黏液瘤病毒（ha-MYXV）在伊比利亞半島的伊比利亞兔（Lepus granatensis）中造成了高死亡率，確認(rèn)了該病毒出現(xiàn)跨物種傳播。該病毒于2018年7月至2020年4月期間，在伊比利亞兔種群中共確認(rèn)發(fā)生372起由 ha-MYXV 引起的疫情^{［1，9-12］}。我國目前未有報(bào)道出現(xiàn)此病，因此需要對(duì)引進(jìn)的家兔進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。

兔黏液瘤病毒是痘病毒屬的一員，屬于痘病毒科（Poxviridae）脊索動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）野兔痘病毒屬（Leporipoxvirus）。MYXV具有一個(gè)大型的、線性的雙鏈DNA基因組，具有末端反向重復(fù)序列（TIRs）和兩端共價(jià)閉合的發(fā)夾環(huán)^［13］。經(jīng)典MYXV以洛桑株作為參考株，編碼了158個(gè)獨(dú)特的開放閱讀框架（ORF）^{［2，14］}。MYXV的完整復(fù)制周期只發(fā)生在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)宿主相互作用的免疫調(diào)節(jié)蛋白。該病毒僅在自然環(huán)境下感染家兔和歐洲褐兔（偶爾出現(xiàn)臨床癥狀），對(duì)除兔形目外的任何受試宿主均無致病性，但MYXV可以在許多物種的培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制^［3，15］。

感染兔黏液瘤病毒的家兔與感染兔纖維瘤病毒（Shoope fibroma virus，SFV）的家兔表現(xiàn)的癥狀相似，均會(huì)表現(xiàn)為皮下腫瘤病灶。但感染黏液瘤病毒會(huì)產(chǎn)生全身性病變并死亡，而纖維瘤病毒僅會(huì)引起自限性皮膚損傷，腫塊經(jīng)數(shù)月后會(huì)自動(dòng)消退。二者僅靠臨床癥狀無法區(qū)分或靠病程后期區(qū)分等待周期過長^［16］，需要建立檢測(cè)危害嚴(yán)重的黏液瘤病毒病的診斷方法。本研究采用基于TaqMan探針法熒光定量PCR技術(shù)建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)出經(jīng)典兔黏液瘤毒株和重組兔黏液瘤的方法，以便于海關(guān)檢測(cè)中兔黏液瘤病毒的快速判斷和防控。

1"材料與方法

1.1"材料

1.1.1"毒株與樣品

兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型的cDNA及兔多殺性巴氏桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌DNA由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2"主要試劑

AceQ qPCR Probe Master Mix（TaqMan熒光定量試劑盒）、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）（反轉(zhuǎn)錄試劑）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TsingZol Total RNA Extraction Reagent （病毒RNA提取試劑），購自北京擎科生物科技股份有限公司；HiPure Tissue DNA Mini Kit，購自上海邁跟生物科技有限公司。

1.1.3"主要儀器

普通RCR擴(kuò)增儀，由Eppendorf公司購入；QuantStudio1熒光定量PCR儀從美國Applied Biosystems公司購入。

1.1.4"引物和探針及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

由表1可知，選擇在MYXV和ha-MYXV中均保守的基因序列m000.5 L/R基因^［17］，利用軟件Primer Express 3.0.1對(duì)基因序列設(shè)計(jì)1組特異性引物、TaqMan探針和包含m000.5 L/R完整片段的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒MYXV-pUC18。引物和探針均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。使用時(shí)用DEPC水將引物和探針稀釋至10 μmol/L，短期可-20 ℃保存，長期需在-80 ℃保存。

1.2"方法

1.2.1"標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

20.0 μL反應(yīng)體系：采用AceQ qPCR Probe Master Mix（TaqMan熒光定量試劑盒），2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX 0.4 μL，熒光探針0.2 μL，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒2.0 μL，DEPC水6.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。將“1.1.4”節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，選擇1×10⁷～1×10³"拷貝/μL 5個(gè)梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照的模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光定量PCR儀自帶軟件QuantStudio^TM"Design amp; Analysis Software自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2"特異性試驗(yàn)

以兔多殺巴氏桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌基因組DNA及兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以無菌水為陰性對(duì)照，以合成的MYXV陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為對(duì)照模板，進(jìn)行熒光定量PCR特異性檢測(cè)。

1.2.3"敏感性試驗(yàn)

以1×10⁸"拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的起始濃度，進(jìn)行10倍倍比稀釋，使用 1×10⁸～1×10¹"拷貝/μL的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板，以無菌水作為陰性對(duì)照。在熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4"重復(fù)性試驗(yàn)

以稀釋后濃度為1×10⁶～1×10³"拷貝/μL 4個(gè)梯度的質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)梯度重復(fù)3次，分別計(jì)算組內(nèi)及組間平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，作為評(píng)估其重復(fù)性的依據(jù)。

1.2.5"臨床樣本的檢測(cè)

使用本研究建立的TaqMan熒光定量的方法對(duì)2023年7月之后收到的來自全國各地疑似MYXV感染的家兔眼鼻拭子、生殖器拭子、脾臟樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2"結(jié)果與分析

2.1"TaqMan qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用AceQ qPCR Probe Master Mix 20 μL反應(yīng)體系對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，如圖1-A所示，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒含量在1×10³～1×10⁷"拷貝/μL時(shí)，獲取其擴(kuò)增動(dòng)力曲線。由圖1-B可知，可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝-3.474lgx+44.828，其相關(guān)系數(shù)為1.00，擴(kuò)增效率為94.12%。圖 1-A、圖1-B均由儀器自帶軟件QuantStudio^TM"Design amp; Analysis Software生成。

2.2"TaqMan qPCR的特異性試驗(yàn)

以1×10⁷"拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板設(shè)陽性對(duì)照，以無菌水為陰性對(duì)照，以保存的兔多殺巴氏桿菌、綠膿桿菌、 沙門氏菌基因組DNA及兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，檢測(cè)所建立的TaqMan熒光定量PCR方法的特異性。由圖2可知，僅標(biāo)準(zhǔn)品MYXV陽性質(zhì)粒組出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而其他細(xì)菌DNA或病毒cDNA檢測(cè)結(jié)果均未見擴(kuò)增。

2.3"TaqMan qPCR的敏感性試驗(yàn)

由圖3可知，以1×10⁸"拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的起始濃度，進(jìn)行10倍倍比稀釋，使用 1×10⁸～1×10¹"拷貝/μL的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板，以無菌水作為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，該方法最低檢出量為1×10²"拷貝/μL的模板，對(duì)應(yīng)CT值約為38.1。

2.4"TaqMan qPCR的重復(fù)性試驗(yàn)

選取含量為1×10⁶～1×10³"拷貝/μL 4個(gè)梯度的質(zhì)粒為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。由表2可知，組內(nèi)變異系數(shù)在0.05%～0.34%之間， 組間變異系數(shù)在0.57%～1.19%之間， 說明該熒光定量PCR方法重復(fù)性良好。

2.5"臨床樣本的檢測(cè)

利用已經(jīng)建立的TaqMan qPCR方法對(duì)來自2023年7月至12月間四川成都、河南鄭州和河南濟(jì)源不同兔廠疑似MYXV感染的32份眼鼻拭子、32份生殖器拭子、32份脾臟樣本進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)出MYXV感染（表3）。

3"討論

MYXV不僅能夠通過環(huán)喙庫蚊種群作為機(jī)械載體傳播，幾乎所有的嚙齒或吸血節(jié)肢動(dòng)物均可作為病毒的載體，在密集封閉區(qū)域內(nèi)，兔子之間也曾報(bào)道過直接接觸傳播，這使的MYXV能夠大面積的傳播^{［16，18-20］}。在澳大利亞引進(jìn)MYXV后的7年內(nèi)，共同進(jìn)化選擇壓力將MYXV在野兔中的總體死亡率降低到30%以下。在英國和法國引入MYXV后，MYXV與其兔宿主之間也出現(xiàn)了類似的共同進(jìn)化過程^［5-7］。

迄今為止，已知MYXV在歐洲兔中表現(xiàn)出至少2種臨床表現(xiàn)型：結(jié)節(jié)型（“經(jīng)典”或“典型”黏液瘤?。┖秃粑停ā胺丘ひ毫觥被颉胺堑湫汀别ひ毫霾。?。經(jīng)典黏液瘤病以明顯的皮膚假性腫瘤為特征，稱為“黏液瘤”，主要位于頭部和肛門區(qū)域。非典型形式顯示出主要的呼吸道癥狀，沒有或僅有少量小的皮膚病變。這2種臨床表現(xiàn)型均可伴隨眼瞼炎、眼瞼結(jié)膜炎、頭部和肛門水腫，以及發(fā)熱、呼吸困難、倦怠、鼻分泌物或俯臥等臨床癥狀，導(dǎo)致死亡率高達(dá)100%^{［18–22］}。然而，僅在美洲棉尾兔中，MYXV感染引起的是一種輕微的疾病，其特征是無害的皮膚纖維瘤^［19］。我國目前未有報(bào)道出現(xiàn)此病，但該病毒一旦在國內(nèi)流行起來，則會(huì)對(duì)國內(nèi)家兔養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，需要對(duì)引進(jìn)的種兔進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。因此，需建立一種能夠同時(shí)檢出MYXV和 ha-MYXV 且快速、高效和敏感高的檢測(cè)方法來防范和控制MYXV的發(fā)生。

對(duì)于癥狀較為明顯的病例，可以對(duì)臨床癥狀、病理變化以及病程做出初步診斷。如需確診還需用其他方法進(jìn)行檢測(cè)。目前，已有針對(duì)兔黏液瘤病毒多種診斷方法的深入研究。其中包括雞胚絨毛尿囊膜、兔腎等原代細(xì)胞分離病毒，觀察其病變，但該方法不易區(qū)分MYXV與SFV引起的病變且耗時(shí)較長^［23-24］。此外還有瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光抗體試驗(yàn)及血清中和試驗(yàn)等。其中，瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)檢測(cè)樣品僅能是血液樣品，較為局限；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對(duì)補(bǔ)體滴度要求高且標(biāo)準(zhǔn)不好統(tǒng)一；免疫熒光抗體試驗(yàn)敏感性高但需要熒光顯微鏡，操作過程復(fù)雜，檢測(cè)周期長；血清中和試驗(yàn)，試驗(yàn)周期較長。目前已有的qPCR檢測(cè)方法并未包括2018年被報(bào)道的會(huì)造成較高死亡率的重組黏液瘤毒株^［25］。

綜上所述，本研究建立了基于MYXV與ha-MYXV基因片段m000.5L的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。此方法具有強(qiáng)特異性和高敏感度等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床疾病診斷，也可為海關(guān)提供一種快速、簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)MYXV的方法。

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