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        經(jīng)典和重組兔黏液瘤病毒TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

        2025-03-27 00:00:00周雅楠陳萌萌仇汝龍魏后軍范志宇胡波宋艷華葛雷李一鳴徐為中王芳
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2025年1期

        摘要:根據(jù)GenBank已登錄的經(jīng)典兔黏液瘤病毒(MYXV)和重組兔黏液瘤病毒(ha-MYXV)基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針,建立能同時(shí)檢出ha-MYXV和MYXV病原的快速、簡(jiǎn)單且敏感性較高的TaqMan探針熒光定量PCR臨床檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,稀釋度為1×107~1×103"拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為1.00;該方法對(duì)MYXV和ha-MYXV具有高度特異性,與綠膿桿菌、兔多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型等其他病原間無交叉反應(yīng);檢測(cè)靈敏度可達(dá)1×102"拷貝/μL;組內(nèi)和組間變異系數(shù)在0.05%~1.19%間。該方法的建立為引進(jìn)種兔及家兔相關(guān)產(chǎn)品兔黏液瘤病毒的檢疫提供了技術(shù)支撐。

        關(guān)鍵詞:兔黏液瘤??;經(jīng)典兔黏液瘤病毒;重組兔黏液瘤病毒;TaqMan qPCR

        中圖分類號(hào):S852.65""文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號(hào):1002-1302(2025)01-0226-05

        兔黏液瘤?。╩yxomatosis)是由兔黏液瘤病毒(rabbit myxoma virus,MYXV)引起的一種高度接觸性、致死性傳染病。該病的主要表現(xiàn)為兔雙側(cè)眼瞼結(jié)膜炎、鼻出血、多器官強(qiáng)烈充血和水腫,以及一些內(nèi)部出血[1]。該病最早發(fā)現(xiàn)于1896年烏拉圭蒙得維的亞的實(shí)驗(yàn)室的兔子[2]。1898年烏拉圭科學(xué)家首次從試驗(yàn)兔分離到該病毒[3]。1927年,該病毒被確定為痘病毒,后被澳大利亞引入用作控制野兔數(shù)量[3-4],并迅速在南美、英國、法國等地蔓延[1,5–7]。

        目前,MYXV在美國、南歐、新西蘭和澳大利亞的兔種群中呈持續(xù)性感染,引起慢性地方性動(dòng)物傳染病[8]。2018年,一種新型重組黏液瘤病毒(ha-MYXV)在伊比利亞半島的伊比利亞兔(Lepus granatensis)中造成了高死亡率,確認(rèn)了該病毒出現(xiàn)跨物種傳播。該病毒于2018年7月至2020年4月期間,在伊比利亞兔種群中共確認(rèn)發(fā)生372起由 ha-MYXV 引起的疫情[1,9-12]。我國目前未有報(bào)道出現(xiàn)此病,因此需要對(duì)引進(jìn)的家兔進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。

        兔黏液瘤病毒是痘病毒屬的一員,屬于痘病毒科(Poxviridae)脊索動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)野兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)。MYXV具有一個(gè)大型的、線性的雙鏈DNA基因組,具有末端反向重復(fù)序列(TIRs)和兩端共價(jià)閉合的發(fā)夾環(huán)[13]。經(jīng)典MYXV以洛桑株作為參考株,編碼了158個(gè)獨(dú)特的開放閱讀框架(ORF)[2,14]。MYXV的完整復(fù)制周期只發(fā)生在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,并在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)宿主相互作用的免疫調(diào)節(jié)蛋白。該病毒僅在自然環(huán)境下感染家兔和歐洲褐兔(偶爾出現(xiàn)臨床癥狀),對(duì)除兔形目外的任何受試宿主均無致病性,但MYXV可以在許多物種的培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制[3,15]。

        感染兔黏液瘤病毒的家兔與感染兔纖維瘤病毒(Shoope fibroma virus,SFV)的家兔表現(xiàn)的癥狀相似,均會(huì)表現(xiàn)為皮下腫瘤病灶。但感染黏液瘤病毒會(huì)產(chǎn)生全身性病變并死亡,而纖維瘤病毒僅會(huì)引起自限性皮膚損傷,腫塊經(jīng)數(shù)月后會(huì)自動(dòng)消退。二者僅靠臨床癥狀無法區(qū)分或靠病程后期區(qū)分等待周期過長[16],需要建立檢測(cè)危害嚴(yán)重的黏液瘤病毒病的診斷方法。本研究采用基于TaqMan探針法熒光定量PCR技術(shù)建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)出經(jīng)典兔黏液瘤毒株和重組兔黏液瘤的方法,以便于海關(guān)檢測(cè)中兔黏液瘤病毒的快速判斷和防控。

        1"材料與方法

        1.1"材料

        1.1.1"毒株與樣品

        兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型的cDNA及兔多殺性巴氏桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌DNA由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.2"主要試劑

        AceQ qPCR Probe Master Mix(TaqMan熒光定量試劑盒)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(反轉(zhuǎn)錄試劑)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;TsingZol Total RNA Extraction Reagent (病毒RNA提取試劑),購自北京擎科生物科技股份有限公司;HiPure Tissue DNA Mini Kit,購自上海邁跟生物科技有限公司。

        1.1.3"主要儀器

        普通RCR擴(kuò)增儀,由Eppendorf公司購入;QuantStudio1熒光定量PCR儀從美國Applied Biosystems公司購入。

        1.1.4"引物和探針及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

        由表1可知,選擇在MYXV和ha-MYXV中均保守的基因序列m000.5 L/R基因[17],利用軟件Primer Express 3.0.1對(duì)基因序列設(shè)計(jì)1組特異性引物、TaqMan探針和包含m000.5 L/R完整片段的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒MYXV-pUC18。引物和探針均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。使用時(shí)用DEPC水將引物和探針稀釋至10 μmol/L,短期可-20 ℃保存,長期需在-80 ℃保存。

        1.2"方法

        1.2.1"標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

        20.0 μL反應(yīng)體系:采用AceQ qPCR Probe Master Mix(TaqMan熒光定量試劑盒),2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX 0.4 μL,熒光探針0.2 μL,標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒2.0 μL,DEPC水6.6 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s,40個(gè)循環(huán)。將“1.1.4”節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋,選擇1×107~1×103"拷貝/μL 5個(gè)梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照的模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光定量PCR儀自帶軟件QuantStudioTM"Design amp; Analysis Software自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.2.2"特異性試驗(yàn)

        以兔多殺巴氏桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌基因組DNA及兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,以無菌水為陰性對(duì)照,以合成的MYXV陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為對(duì)照模板,進(jìn)行熒光定量PCR特異性檢測(cè)。

        1.2.3"敏感性試驗(yàn)

        以1×108"拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的起始濃度,進(jìn)行10倍倍比稀釋,使用 1×108~1×101"拷貝/μL的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板,以無菌水作為陰性對(duì)照。在熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

        1.2.4"重復(fù)性試驗(yàn)

        以稀釋后濃度為1×106~1×103"拷貝/μL 4個(gè)梯度的質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,每個(gè)梯度重復(fù)3次,分別計(jì)算組內(nèi)及組間平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),作為評(píng)估其重復(fù)性的依據(jù)。

        1.2.5"臨床樣本的檢測(cè)

        使用本研究建立的TaqMan熒光定量的方法對(duì)2023年7月之后收到的來自全國各地疑似MYXV感染的家兔眼鼻拭子、生殖器拭子、脾臟樣本進(jìn)行檢測(cè)。

        2"結(jié)果與分析

        2.1"TaqMan qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        采用AceQ qPCR Probe Master Mix 20 μL反應(yīng)體系對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增,如圖1-A所示,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒含量在1×103~1×107"拷貝/μL時(shí),獲取其擴(kuò)增動(dòng)力曲線。由圖1-B可知,可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.474lgx+44.828,其相關(guān)系數(shù)為1.00,擴(kuò)增效率為94.12%。圖 1-A、圖1-B均由儀器自帶軟件QuantStudioTM"Design amp; Analysis Software生成。

        2.2"TaqMan qPCR的特異性試驗(yàn)

        以1×107"拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板設(shè)陽性對(duì)照,以無菌水為陰性對(duì)照,以保存的兔多殺巴氏桿菌、綠膿桿菌、 沙門氏菌基因組DNA及兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,檢測(cè)所建立的TaqMan熒光定量PCR方法的特異性。由圖2可知,僅標(biāo)準(zhǔn)品MYXV陽性質(zhì)粒組出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線,而其他細(xì)菌DNA或病毒cDNA檢測(cè)結(jié)果均未見擴(kuò)增。

        2.3"TaqMan qPCR的敏感性試驗(yàn)

        由圖3可知,以1×108"拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的起始濃度,進(jìn)行10倍倍比稀釋,使用 1×108~1×101"拷貝/μL的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板,以無菌水作為陰性對(duì)照,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,該方法最低檢出量為1×102"拷貝/μL的模板,對(duì)應(yīng)CT值約為38.1。

        2.4"TaqMan qPCR的重復(fù)性試驗(yàn)

        選取含量為1×106~1×103"拷貝/μL 4個(gè)梯度的質(zhì)粒為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。由表2可知,組內(nèi)變異系數(shù)在0.05%~0.34%之間, 組間變異系數(shù)在0.57%~1.19%之間, 說明該熒光定量PCR方法重復(fù)性良好。

        2.5"臨床樣本的檢測(cè)

        利用已經(jīng)建立的TaqMan qPCR方法對(duì)來自2023年7月至12月間四川成都、河南鄭州和河南濟(jì)源不同兔廠疑似MYXV感染的32份眼鼻拭子、32份生殖器拭子、32份脾臟樣本進(jìn)行檢測(cè),均未檢測(cè)出MYXV感染(表3)。

        3"討論

        MYXV不僅能夠通過環(huán)喙庫蚊種群作為機(jī)械載體傳播,幾乎所有的嚙齒或吸血節(jié)肢動(dòng)物均可作為病毒的載體,在密集封閉區(qū)域內(nèi),兔子之間也曾報(bào)道過直接接觸傳播,這使的MYXV能夠大面積的傳播[16,18-20]。在澳大利亞引進(jìn)MYXV后的7年內(nèi),共同進(jìn)化選擇壓力將MYXV在野兔中的總體死亡率降低到30%以下。在英國和法國引入MYXV后,MYXV與其兔宿主之間也出現(xiàn)了類似的共同進(jìn)化過程[5-7]。

        迄今為止,已知MYXV在歐洲兔中表現(xiàn)出至少2種臨床表現(xiàn)型:結(jié)節(jié)型(“經(jīng)典”或“典型”黏液瘤?。┖秃粑停ā胺丘ひ毫觥被颉胺堑湫汀别ひ毫霾。?。經(jīng)典黏液瘤病以明顯的皮膚假性腫瘤為特征,稱為“黏液瘤”,主要位于頭部和肛門區(qū)域。非典型形式顯示出主要的呼吸道癥狀,沒有或僅有少量小的皮膚病變。這2種臨床表現(xiàn)型均可伴隨眼瞼炎、眼瞼結(jié)膜炎、頭部和肛門水腫,以及發(fā)熱、呼吸困難、倦怠、鼻分泌物或俯臥等臨床癥狀,導(dǎo)致死亡率高達(dá)100%[18–22]。然而,僅在美洲棉尾兔中,MYXV感染引起的是一種輕微的疾病,其特征是無害的皮膚纖維瘤[19]。我國目前未有報(bào)道出現(xiàn)此病,但該病毒一旦在國內(nèi)流行起來,則會(huì)對(duì)國內(nèi)家兔養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,需要對(duì)引進(jìn)的種兔進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。因此,需建立一種能夠同時(shí)檢出MYXV和 ha-MYXV 且快速、高效和敏感高的檢測(cè)方法來防范和控制MYXV的發(fā)生。

        對(duì)于癥狀較為明顯的病例,可以對(duì)臨床癥狀、病理變化以及病程做出初步診斷。如需確診還需用其他方法進(jìn)行檢測(cè)。目前,已有針對(duì)兔黏液瘤病毒多種診斷方法的深入研究。其中包括雞胚絨毛尿囊膜、兔腎等原代細(xì)胞分離病毒,觀察其病變,但該方法不易區(qū)分MYXV與SFV引起的病變且耗時(shí)較長[23-24]。此外還有瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光抗體試驗(yàn)及血清中和試驗(yàn)等。其中,瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)檢測(cè)樣品僅能是血液樣品,較為局限;補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對(duì)補(bǔ)體滴度要求高且標(biāo)準(zhǔn)不好統(tǒng)一;免疫熒光抗體試驗(yàn)敏感性高但需要熒光顯微鏡,操作過程復(fù)雜,檢測(cè)周期長;血清中和試驗(yàn),試驗(yàn)周期較長。目前已有的qPCR檢測(cè)方法并未包括2018年被報(bào)道的會(huì)造成較高死亡率的重組黏液瘤毒株[25]。

        綜上所述,本研究建立了基于MYXV與ha-MYXV基因片段m000.5L的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。此方法具有強(qiáng)特異性和高敏感度等優(yōu)點(diǎn),可用于臨床疾病診斷,也可為海關(guān)提供一種快速、簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)MYXV的方法。

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