摘要：從轉(zhuǎn)錄組層面解析草莓組培苗不定根響應(yīng)羧基化碳納米管處理的分子機(jī)制，以紅顏草莓脫毒組培苗不定根為材料，浸入羧基化碳納米管混懸液中超聲處理，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析差異表達(dá)基因（DEG）并進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，有1 531個(gè)基因受羧基化碳納米管處理影響上調(diào)，1 979個(gè)表達(dá)基因下調(diào)。GO功能分析發(fā)現(xiàn)，DEG主要富集于細(xì)胞壁重塑、硫酸鹽運(yùn)輸、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程及DNA合成、酶催化活性和跨膜蛋白活性等分子功能。KEGG途徑富集分析表明，差異表達(dá)基因分別主要參與類黃酮積累途徑、苯基丙酸合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MAPK信號通路及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成等。qRT-PCR顯示差異表達(dá)基因的表達(dá)譜與RNA-Seq分析結(jié)果一致。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步基于碳納米管的草莓良種繁育新技術(shù)研發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：紅顏草莓；碳納米管；轉(zhuǎn)錄組測序；植物組織培養(yǎng)

中圖分類號：S668.404""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0020-06

草莓是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物。栽培草莓不同于野生狀態(tài)的草莓，是八倍體鳳梨草莓^［1］。草莓是重要的漿果果樹，果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，形態(tài)顏色誘人，營養(yǎng)價(jià)值豐富^［2］。草莓種苗繁育方式單一，通常采用匍匐莖繁育，這也是制約江蘇省草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。草莓種苗脫毒技術(shù)一般是指利用植物組培技術(shù)培育可以保持草莓品種優(yōu)良性狀的種苗，并且克服草莓長期無性繁殖導(dǎo)致的病蟲害積累加重、品種退化、質(zhì)量品質(zhì)和產(chǎn)量降低等問題。因此，健全的草莓種苗良種繁育體系是促進(jìn)我省草莓產(chǎn)業(yè)不斷健康發(fā)展的重要保障^［3］。

碳納米管是一種在高分辨率透射電鏡下發(fā)現(xiàn)的碳納米材料，其長度與寬度的比例大于1 000。碳納米管的納米級結(jié)構(gòu)使其具有特殊的機(jī)械性能、導(dǎo)熱性能和電學(xué)性能，并且可以在試驗(yàn)中改變化學(xué)反應(yīng)或生物結(jié)構(gòu)^［4-6］。在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等生物技術(shù)應(yīng)用方面，碳納米管能夠作為分子材料的運(yùn)載體，滲透植物細(xì)胞、動物組織、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞等^［7］。羧基化碳納米管是一種在碳納米管表面引入親水基團(tuán)的功能化碳納米材料，該材料相較碳納米管不但增強(qiáng)了材料分散性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物相容性，而且對生物的免疫系統(tǒng)的影響有效降低^［8］。因此，羧基化碳納米管等碳納米材料在植物種苗繁育尤其是組培技術(shù)上有極大的應(yīng)用前景，充分了解植物對羧基化碳納米管響應(yīng)的分子機(jī)理具有重要意義。

本研究以紅顏草莓脫毒組培苗為研究材料，通過高通量轉(zhuǎn)錄測序篩選500 μg/mL羧基化碳納米管處理下組培苗不定根的差異表達(dá)基因并進(jìn)行 q-PCR驗(yàn)證，從轉(zhuǎn)錄組水平揭示草莓組培苗不定根響應(yīng)羧基化碳納米管處理的關(guān)鍵基因，為研發(fā)基于碳納米管的草莓良種繁育新技術(shù)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論參考。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

2023年2—5月，選取紅顏草莓材料于江蘇省南通市海門區(qū)春華家庭農(nóng)場，并在江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所科創(chuàng)中心組培實(shí)驗(yàn)室完成紅顏草莓組織培養(yǎng)試驗(yàn)。培養(yǎng)基配方：MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L 萘乙酸（NAA）+0.1 mg/L吲哚丁酸（IBA）。培養(yǎng)室條件為溫度25～30 ℃，光照12 h/d。選取生長良好、長勢相近的草莓組培苗備用。

1.2"試驗(yàn)處理

2023年7月，試驗(yàn)設(shè)置處理組（CNTs）和對照組（CK），選取上述的紅顏草莓組培苗不定根，處理組浸入含有500 μg/mL羧基化碳納米管的純水混懸液中，對照組直接浸入純水。處理組和對照組采用超聲細(xì)胞破碎儀（南京先歐儀器制造有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行振蕩，功率800 W，超聲10 s，間隙 10 s，處理20 min，使處理組羧基化碳納米管吸附于根系組織上。試驗(yàn)樣品處理后立即放置于液氮中待高通量轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3"轉(zhuǎn)錄組測序

樣品采用標(biāo)準(zhǔn)提取方法，從植物組織中提取RNA，隨后采用Agilent 2100 bioanalyzer對RNA樣品完整性和總量進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控。文庫構(gòu)建與質(zhì)檢后，進(jìn)行上機(jī)測序。上機(jī)測序采用Illumina NovaSeq 6000（Illumina，USA），獲得待測片段的序列信息。數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件采用Fastp（version 0.19.7），對測序原始數(shù)據(jù)過濾和數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總。

1.4"差異基因篩選及富集分析

根據(jù)紅顏草莓參考基因組及其模型的注釋文件^［9］，采用HISAT2 v2.0.5軟件進(jìn)行參考基因組的索引與比對，采用StringTie軟件（1.3.3b）進(jìn)行新基因預(yù)測，采用featureCounts軟件（1.5.0-p3）計(jì)算映射到各個(gè)基因的讀數(shù)，采用DESeq 2軟件（1.20.0）確定差異表達(dá)基因（調(diào)整后P值≤0.05）^［10］。通過clusterProfiler（3.8.1）軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路中差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)富集。

1.5"qRT-RCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，選取8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-RCR。以來源于草莓YABBY基因家族的FvActin基因?yàn)閮?nèi)參基因^［11］，根據(jù)各基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測差異基因表達(dá)水平。具體步驟如下：首先使用gDNA digester Mix去除基因組DNA，采用試劑盒（4× HifairⅢ SuperMix plus）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。之后使用HieffqPCR SYBR Green Master Mix制備qRT-PCR反應(yīng)體系，然后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸30 s，總共40個(gè)循環(huán)。采用2^-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對表達(dá)量^［11］。

1.6"數(shù)據(jù)處理

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 2018軟件制圖。

2"結(jié)果與分析

2.1"轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

利用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，羧基化碳納米管處理草莓組培苗不定根均得到多條高質(zhì)量堿基序列（堿基長度38 841 132～42 744 978 bp），Q20、Q30分別達(dá)到97%以上和92%以上，且G+C含量達(dá)到45%以上（表2），表明草莓組培苗不定根樣品的轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量符合進(jìn)一步研究的要求。

2.2"差異基因數(shù)量分析

以|log2（Fold Change）|≥1且Padj≤0.05作為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別對羧基化碳納米管處理草莓組培苗不定根的試驗(yàn)組與對照組進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)共有3 510個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了改變，有1 531個(gè)基因受羧基化碳納米管處理影響上調(diào)，1 979個(gè)表達(dá)基因下調(diào)。

2.3"差異表達(dá)基因GO富集分析

為了進(jìn)一步研究差異表達(dá)基因在羧基化碳納米管處理下的生物學(xué)功能，進(jìn)行了GO富集分析。

差異表達(dá)基因GO功能注釋了1 883個(gè)差異顯著表達(dá)基因，分布在109個(gè)基因富集GO條目。富集GO條目分為3類，分別為差異表達(dá)基因在羧基化碳納米管處理下的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能，各類選取富集程度最高的10個(gè)GO條目分析（圖1）。在生物過程類別，差異表達(dá)基因主要集中于細(xì)胞壁組成和修飾、蛋白質(zhì)修飾、硫酸鹽和硫化物運(yùn)輸、氧化應(yīng)激反應(yīng)等；在細(xì)胞成分分類信息中，細(xì)胞外成分和細(xì)胞合成等顯著富集；在分子功能分類中，富集程度最高的是DNA合成、酶催化活性和跨膜蛋白活性。

2.4"差異表達(dá)基因KEGG信號通路

KEEG富集分析發(fā)現(xiàn)，在羧基化碳納米管處理下試驗(yàn)組與對照組通路上共有736個(gè)差異表達(dá)基因。由圖2可知，共有512個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到了20個(gè)通路中。其中，富集顯著性較高的前5條代謝途徑分別為類黃酮合成、苯基丙酸合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MAPK信號通路及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成。苯基丙酸合成代謝途徑差異基因數(shù)量最多，共79個(gè)。

2.5"qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，挑選了8個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。上調(diào)的表達(dá)基因選擇snap-Fvb1_4_F-processed-gene-38.17、augustus-Fvb2_4_F-processed-gene-141.20、maker-Fvb5_1_F-augustus-gene-23.36、maker-Fvb3_4_F-snap-gene-43.30，下調(diào)的差異表達(dá)基因選擇maker-Fvb2_1_F-augustus-gene-121.34、maker-Fvb4_2_F-augustus-gene-161.43、augustus-Fvb6_4_F-processed-gene-226.12、maker-Fvb6_3_F-snap-gene-8.40，內(nèi)參基因選用FvActin。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果（圖3）與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果、定量分析結(jié)果一致，只是差異倍數(shù)上與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)有所區(qū)別，進(jìn)一步說明RNA-Seq的結(jié)果可靠。

3"討論

碳納米管能夠進(jìn)入植物體內(nèi)調(diào)控植物DNA和蛋白質(zhì)的相關(guān)代謝途徑，影響植物生長發(fā)育的許多重要過程^［12］。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)碳納米管不同的類型、粒徑、濃度和溶解度等，對不同種類植物造成的影響各不相同^［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的碳納米管有利于促進(jìn)種子萌發(fā)、根和莖生長以及植物總生物量增長^［16］，而高濃度的碳納米管不但能夠抑制植物生長，還會對植物生長環(huán)境造成破壞^［17］。

關(guān)于碳納米管對植物作用的機(jī)理研究，李佳慧在CNTs處理對文心蘭組培苗影響的研究中，發(fā)現(xiàn)添加了CNTs的培養(yǎng)基中文心蘭的內(nèi)部或表面產(chǎn)生了CNTs團(tuán)聚狀結(jié)構(gòu)，并且影響相關(guān)酶活性，表明CNTs進(jìn)入植物后會改變組織結(jié)構(gòu)，影響植物生理生化特性^［18］。在分子機(jī)理方面，CNTs處理植物后能夠影響水通道蛋白相關(guān)基因表達(dá)。Khodakovskaya等發(fā)現(xiàn)，使用多壁碳納米管處理番茄根系，能夠誘導(dǎo)水通道蛋白LeAqp2基因表達(dá)水平上調(diào)^［19］。在低濃度碳納米管處理煙草研究中，Khodakovskaya等發(fā)現(xiàn)，CNTs能夠提高煙草的水通道蛋白Nt-PIPI基因和煙草細(xì)胞分化相關(guān)基因NtLRX1表達(dá)水平^［20］。CNTs作用植物除了影響水通道蛋白相關(guān)基因表達(dá)之外，還能激活一些抗逆性相關(guān)基因，提高植物整體應(yīng)對逆境脅迫的能力^［21-23］。

但是，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用碳納米管會不可避免地使其釋放到環(huán)境中，改性的功能化碳納米管在進(jìn)入環(huán)境后會引發(fā)毒性效應(yīng)^［17］。目前，關(guān)于碳納米管負(fù)面效應(yīng)的研究主要在動物和微生物方面^［24-27］。此外，碳納米管具有一定的消毒殺菌作用，采用碳納米管微波輻射處理能夠抑制薄殼山核桃砧木內(nèi)的木質(zhì)部難養(yǎng)菌，從而減少細(xì)菌性葉枯病發(fā)生^［28-29］。對植物而言，CNTs雖然可以促進(jìn)種子萌發(fā)和植物生長發(fā)育，但是也會抑制植物生長、降低植物組織生

物量^［30-31］。關(guān)于碳納米管處理復(fù)合鎘（Cd）對蠶豆幼苗的毒性效應(yīng)研究，劉玲等發(fā)現(xiàn)羧基化多壁碳納米管高濃度處理會加劇Cd對蠶豆幼苗的氧化脅迫^［32］。但是，在多壁碳納米管對水稻幼苗緩解 1，2，4-三氯苯（TCB）毒性的研究中，發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管可以顯著緩解TCB對水稻幼苗的生理脅迫^［33］。因此，如何有效利用碳納米材料處理植株，使其產(chǎn)生正面效應(yīng)將是未來研究的重點(diǎn)方向。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組水平揭示草莓組培苗不定根響應(yīng)羧基化碳納米管處理的關(guān)鍵基因，對探索碳納米材料對植物影響的分子機(jī)理研究具有重要意義。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，草莓組培苗不定根響應(yīng)羧基化碳納米管的差異表達(dá)基因參與類黃酮積累途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成和細(xì)胞壁重塑過程等，有研究表明這些生物過程也在草莓抵御逆境脅迫中發(fā)揮重要作用^［34］。例如，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其廣泛存在于植物中，可將各種脂質(zhì)、植物激素、重金屬、羧酸鹽、葉綠素分解代謝物和異種生物偶聯(lián)物等底物進(jìn)行生物膜上的運(yùn)輸，被認(rèn)為參與許多植物生理過程，使植物適應(yīng)生物和非生物脅迫環(huán)境^［35］。筆者推測在樣品處理階段，為了使羧基化碳納米管更好地吸附進(jìn)入草莓根系，采用了超聲細(xì)胞破碎處理，也導(dǎo)致了草莓根部細(xì)胞受損，而羧基化碳納米管影響了一些抗逆性相關(guān)基因表達(dá)，該推論有待試驗(yàn)進(jìn)一步論證。

4"結(jié)論

本研究對紅顏草莓脫毒組培苗不定根進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了其響應(yīng)羧基化碳納米管的差異表達(dá)基因，并對基因進(jìn)行了功能注釋。羧基化碳納米管處理草莓根系后，引起了細(xì)胞壁重塑、蛋白質(zhì)修飾、硫酸鹽運(yùn)輸、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程及DNA合成、酶催化活性、跨膜蛋白活性等分子功能變化，代謝通路方面差異表達(dá)基因主要參與類黃酮合成、苯基丙酸合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MAPK信號通路及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成等。本研究從轉(zhuǎn)錄組水平揭示草莓組培苗不定根響應(yīng)羧基化碳納米管處理的關(guān)鍵基因，為研發(fā)基于碳納米管的草莓良種繁育新技術(shù)提供參考。

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