摘要 ［目的］建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定焙炒咖啡中丙烯酰胺的分析方法。［方法］以¹³C 3-丙烯酰胺為內(nèi)標物，樣品經(jīng)超純水超聲浸提，分別經(jīng)正己烷萃取提取物脂肪、K 4Fe（CN） 6·3H 2O和Zn（CH 3COO） 2沉淀蛋白質(zhì)、硅藻土和GCB凈化等流程獲取目標分析物，目標分析物最后經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮，LC-MS/MS在ESI電離模式下測定丙烯酰胺含量。［結(jié)果］丙烯酰胺在10～500 ng/mL具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），在50、100、400 μg/kg加標水平下回收率為71.2%～97.3%，RSD為1.9%～8.4%，方法檢出限和定量限分別為13和40 μg/kg。采用該方法對FAPAS質(zhì)控樣進行測定，檢測結(jié)果均在質(zhì)控值范圍內(nèi)。［結(jié)論］該方法具有良好的線性關(guān)系，準確度和精密度均滿足定量分析的要求，適用于焙炒咖啡中丙烯酰胺殘留的定量分析。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；焙炒咖啡；丙烯酰胺；殘留

中圖分類號 TS 207" 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2025）04-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.037

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Determination of Acrylamide Residues in Roasted Coffee by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

MAO Jing chun，ZHOU Qin，LI Zong shi et al

（Pu’er Institute of Inspection and Testing，Pu’er，Yunnan 665099）

Abstract ［Objective］ To establish an analytical method for the determination of acrylamide in roasted coffee by liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC MS/MS）.［Method］Taking ¹³C 3 acrylamide as the internal standard，the coffee samples were extracted with ultra pure water under ultrasonic，a cleanup by n hexane extraction，K 4Fe（CN） 6·3H 2O and Zn（CH 3COO） 2 precipitation，diatomite and GCB purification were employed to remove fat，protein and some interfering matrix compounds，respectively. The target analyte was finally extracted and concentrated with ethyl acetate，and the acrylamide content was determined by LC MS/MS in ESI ionization mode.［Result］Acrylamide had a good linear relationship between 10-500 ng/mL （r=0.999 9），with recovery rates of 71.2% -97.3% and RSD of 1.9% -8.4% at spiked levels of 50，100 and 400 μg/kg. The detection limit and quantification limit of the method were 13 and 40 μg/kg，respectively.The method was used to determine the quality control samples of FAPAS，and the test results were all within the range of quality control values.［Conclusion］This method has a good linear relationship，and both accuracy and precision meet the requirements of quantitative analysis. It is suitable for the quantitative analysis of acrylamide residues in roasted coffee.

Key words Liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC MS/MS）;Roasted coffee;Acrylamide;Residues

基金項目 云南省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（2022YSJK14）。

作者簡介 毛靜春（1990—），女，云南普洱人，工程師，碩士，從事食品質(zhì)量與安全研究。

收稿日期 2024-05-23；修回日期 2024-07-24

丙烯酰胺（Acrylamide），白色結(jié)晶性粉末，一種重要的高分子材料單體，主要用于醫(yī)藥、環(huán)境和涂料等領(lǐng)域^［1］。 2002年瑞典科學家首次報道在油炸薯條中檢測出丙烯酰胺^［2］，隨后科研工作者相繼在高淀粉、高碳水化合物中檢測出一定濃度的丙烯酰胺^［3-4］，食品中丙烯酰胺污染問題受到世界各國政府的關(guān)注，關(guān)于丙烯酰胺的毒理性研究和膳食暴露風險工作紛紛啟動。目前丙烯酰胺在動物試驗中顯示了潛在的致癌性，但尚未發(fā)現(xiàn)對人體致癌的證據(jù)^［5-6］。2018年，美國洛杉磯法院下達了一份判決：加州的咖啡銷售者必須在咖啡產(chǎn)品上貼癌癥警告標簽，明確標示咖啡中含有致癌物質(zhì)丙烯酰胺，自此丙烯酰胺成為咖啡產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的重要指標之一。因此，建立焙炒咖啡中丙烯酰胺快速準確的測定方法，科學有效監(jiān)控咖啡質(zhì)量，對保障消費者的食品安全和咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

目前對焙炒咖啡中丙烯酰胺殘留量的測定主要有分光光度法^［7］、氣相色譜法（GC）^［8］、液相色譜法（LC）^［9-10］、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）^［11-12］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）^［13-14］等。其中分光光度法通過咖啡中的丙烯酰胺與還原型谷胱甘肽發(fā)生加成反應(yīng)，進而抑制還原型谷胱甘肽將Fe³⁺還原為Fe²⁺，測定Fe²⁺與鄰菲啰啉的顯色產(chǎn)物，間接計算咖啡中丙烯酰胺的含量，該方法操作簡單，但共萃物對化學反應(yīng)干擾較大，結(jié)果準確性和重現(xiàn)性有待提高。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在一定程度上提高了定量和定性的準確性，分析中為提高分析靈敏度多采用衍生試劑與丙烯酰胺發(fā)生衍生化反應(yīng)，采集衍生化產(chǎn)物進而對丙烯酰胺進行定量分析，溴試劑^［15-16］、丹磺酸^［17］ 和硫代水楊酸^［18］為丙烯酰胺測定時常用的衍生試劑，通過衍生化反應(yīng)有效提高了丙烯酰胺在設(shè)備上的靈敏度，有利于低含量丙烯酰胺咖啡樣品的分析，但是衍生化反應(yīng)過程對檢驗人員的技術(shù)能力有較高的要求，衍生化反應(yīng)的高低和樣品與標準曲線衍生條件過程的一致性都會影響檢驗結(jié)果的準確性，因此非衍生化法成為測定咖啡中丙烯酰胺的主流方法。焙炒咖啡作為一種復雜的植物源性產(chǎn)品，較其他食品相比富含脂肪、蛋白質(zhì)和焙炒過程中產(chǎn)生的色素，凈化處理較為煩瑣，而丙烯酰胺強極性致使其在處理過程中極易損失，回收率難以保證在國家標準對質(zhì)量控制要求的回收率范圍內(nèi)，需采用同位素內(nèi)標校正其處理過程中的回收率以確保測定的準確性。處理過程中丙烯酰胺的損失對設(shè)備靈敏度提出了新的要求，因此優(yōu)化前處理條件、降低基質(zhì)干擾、提高設(shè)備靈敏度、增加分析準確性成為焙炒咖啡中丙烯酰胺測定的兩大難點。基于此，該研究擬采用水提取咖啡中的丙烯酰胺，正己烷萃取部分脂溶性雜質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀蛋白質(zhì)、硅藻土-GCB復合凈化提取液雜質(zhì)，通過氯化鈉鹽析乙酸乙酯萃取凈化液中的丙烯酰胺實現(xiàn)丙烯酰胺的富集，建立一種適用、高效的LC-MS/MS測定咖啡中丙烯酰胺的方法，以期為咖啡產(chǎn)品丙烯酰胺的監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材?？Х仍囼灅悠窞?023年阿拉比卡生豆經(jīng)烘焙后用粉碎機研磨，研磨后待分析用。焙炒咖啡中丙酰胺質(zhì)控樣購自英國FAPAS國際能力驗證，證書編號T30135QC，質(zhì)控值169 μg/kg，允許范圍98～240 μg/kg。市售不同廠家的焙炒咖啡豆和焙炒咖啡粉末15份。

1.1.2 試劑。乙酸乙酯、正己烷、甲醇（色譜純，美國J.T.Baker公司）; 亞鐵氰化鉀（分析純，天津風船化學試劑科技有限公司）; 乙酸鋅 （分析純，天津福晨化學試劑有限公司）; 甲酸銨（色譜純，阿拉丁公司）；氯化鈉（分析純，西隴化工股份有限公司）；甲酸（色譜純，阿拉丁公司）；石墨化碳黑（GCB）吸附劑（120～400目，天津博納艾杰爾科技有限公司）；硅藻土（Celite 545，美國Sigma公司）； 丙烯酰胺標準溶液（1ST001221-1000A，1 000 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；¹³C 3-丙烯酰胺 （1ST001221D3-1000M，1 000 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）。

1.1.3 儀器與設(shè)備。API 3500 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國，AB Sciex公司）;N-EVAP-24氮吹儀（美國Organomation公司）; AS-3120B超聲波清洗儀（天津興特賽恩斯儀器有限公司）; GL-12B 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）;PV-1 旋渦混合器（德國艾卡公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備。

1.2.1.1 樣品提取。

準確稱取 2 g（精確至 0.01 g）焙炒咖啡粉末樣品于 50 mL 具塞塑料離心管中，加入濃度為10 μg/mL丙烯酰胺內(nèi)標溶液100 μL，再加入2 mL正己烷輕輕搖勻，準確移取20 mL超純水加入離心管中，于混勻器上混勻1 min 后置于超聲清洗儀中超聲提取30 min。提取液于離心機上4 000 r/min離心5 min，將上層正己烷層從提取體系中移出，準確移取10 mL下層提取水相至潔凈的50 mL離心管中待凈化。

1.2.1.2 凈化。

上述10 mL待凈化液中加入1 mL濃度為1 mol/L 的亞鐵氰化鉀溶液混勻，再加入1 mL濃度為1 mol/L 的乙酸鋅溶液，在混勻器上充分混勻1 min，于離心機上4 000 r/min離心5 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至潔凈50 mL離心管中，沉淀物中加入3 mL水混勻后再次離心，合并2次離心上清液。往離心上清液中加入2 g硅藻土、250 mg GCB于混勻器上混勻1 min，加入10 mL乙酸乙酯和7 g無水氯化鈉，手動劇烈振搖1 min，于4 000 r/min離心5 min，移取上清液至玻璃試管中，在50 ℃水浴條件下氮吹至凈干，加入1 mL水定容過0.45 μm醋酸纖維素濾膜于自動進樣瓶中，待液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.2 標準溶液的配制。

1.2.2.1 標準儲備液。分別移取1 mL濃度為1 000 μg/mL丙烯酰胺和¹³C 3-丙烯酰胺溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度線，配制濃度為100 μg/mL丙烯酰胺和¹³C 3-丙烯酰胺單標儲備液，于5 ℃下避光保存，有效期30 d。

1.2.2.2 標準使用液。分別移取1 mL濃度為100 μg/mL丙烯酰胺和¹³C 3-丙烯酰胺標準儲備液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度線，配制濃度為10 μg/mL丙烯酰胺和¹³C 3-丙烯酰胺單標使用液，于5 ℃下避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2.3 標準序列工作溶液。分別吸取1、2、5、10、20和50 μL 濃度為10 μg/mL的丙烯酰胺標準使用溶液至6個1.0 mL 容量瓶中，各加入500 μL ¹³C 3-丙烯酰胺標準使用液，超純水定容至刻度線，配制濃度為10、20、50、100、200和500 ng/mL 標準序列工作溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件。色譜柱SHIMADZU Shim-pack GISS-HP C 18（2.1 mm×100 mm，3 μm），柱溫 40 ℃，進樣體積10 μL。流速為 0.40 mL/min，流動相 A為0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液，B為甲醇，洗脫程序為等度洗脫（90%A相，10%B相），分析時間5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件。質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子掃描，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測，霧化氣壓力413.7 kPa，加熱器壓力482.6 kPa，氣簾氣壓力172.4 kPa，離子源溫度600 ℃，噴霧電壓5 500 V。 定量方式為內(nèi)標法。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析參數(shù)的優(yōu)化

將濃度為 1 μg/mL 的丙烯酰胺和¹³C 3-丙烯酰胺分別通過質(zhì)譜所配的外置進樣泵以7 μL/min 流速往質(zhì)譜儀中進樣。分別在 Q1 正離子模式和product ion（MS2）模式下掃描，確定丙烯酰胺和 ¹³C 3-丙烯酰胺的分子離子對，在 MRM 模式下已確定的分析離子對進而優(yōu)化碰撞電壓（CE）和裂解電壓（DP）。表1為丙烯酰胺和 ¹³C 3-丙烯酰胺LC-MS/MS 分析參數(shù)，丙烯酰胺和¹³C 3-丙烯酰胺在50 ng/mL的色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的選擇

目前已報道的焙炒咖啡中丙烯酰胺的提取溶劑主要有水、甲醇、亞鐵氰化鉀水溶液和乙腈等，在檢測方法建立中提取溶劑的選擇主要考慮2個方面，一方面為提取溶劑對目標提取物的溶解性，以確保提取完全；另一方面，在保證丙烯酰胺提取率的前提下降低對干擾組分的提取。焙炒咖啡作為一種特殊的植物源性基質(zhì)，與其他植物源性基質(zhì)相比，脂肪、蛋白和色素等組分含量較高^［19］，采用有機溶劑進行提取將萃取更多的脂溶性組分，增加后期的凈化步驟進而降低回收率。而水對丙烯酰胺具有較好的溶解性，其溶解度高達50%，水作為提取溶劑對丙烯酰胺具有較高的提取率，同時有效降低了對脂溶性物質(zhì)的提取，因此該研究采用水作為焙炒咖啡中丙烯酰胺的提取溶劑。

2.3 凈化方法的選擇

該研究的方法采用內(nèi)標法定量，在排除基質(zhì)干擾后回收率能通過內(nèi)標物實現(xiàn)有效的校正，因此在設(shè)備靈敏度較高的情況下主要保證有效的凈化以降低基質(zhì)效應(yīng)。采用水提取焙炒咖啡中的丙烯酰胺，大量脂肪、蛋白和色素等干擾物也會進入提取液，給丙烯酰胺的定量分析造成干擾。目前焙炒咖啡中丙烯酰胺測定常用的凈化手段主要是固相萃取小柱凈化法、QuEChERS凈化法和基質(zhì)固相分散萃取方法等^［20-21］，由于共萃成分的復雜多樣，采用單一的凈化手段很難實現(xiàn)提取液雜質(zhì)的有效凈化，增加對設(shè)備的污染，進而增加實驗室設(shè)備維護成本。因此該研究所建立的方法采用復合凈化法對共萃組分中的各類物質(zhì)進行有效凈化，凈化步驟依次為正己烷除脂、乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質(zhì)、硅藻土-GCB基質(zhì)固相分散凈化雜質(zhì)、氯化鈉鹽析乙酸乙酯萃取丙烯酰胺、內(nèi)標物濃縮定容待測定。通過一系列的凈化，提取液呈清澈透明狀，通過鹽析乙酸乙酯萃取實現(xiàn)丙烯酰胺的富集，增加其在設(shè)備上的響應(yīng)濃度，進而降低對設(shè)備靈敏度的要求，增強方法的適用性。

2.4 方法學考察

2.4.1 方法線性范圍、檢出限和定量限的確定。

按“1.2.2”方法制得丙烯酰胺標準曲線溶液 10、20、50、100、200、500 ng/mL，內(nèi)標¹³C 3-丙烯酰胺濃度為500 ng/mL。 以 LC-MS/MS 測定各濃度點的外標和內(nèi)標峰面積比值A(chǔ)。以各濃度為橫坐標（C），各濃度對應(yīng)的峰面積比值A(chǔ)為縱坐標擬合標準曲線，曲線方程為 A=0.002 14C-0.002 79，線性相關(guān)系數(shù)（r）為 0.999 9。以3倍信噪比確定方法的檢出限，10倍信噪比確定方法的定量限，該方法丙烯酰胺的檢出限和定量限分別為13和40 μg/kg。

2.4.2 方法準確度和精密度。

采用建立的方法對樣品進行6次平行試驗，在精密度lt;10%的條件下取6次測定平均值為加標基質(zhì)樣品中丙烯酰胺的含量，加標基質(zhì)丙烯酰胺含量為126 μg/kg。于加標基質(zhì)樣品中分別加入50、100和400 μg/kg 丙烯酰胺溶液，按“1.2.1”方法對加標樣進行處理并測定丙烯酰胺含量，各加標水平分別進行6次平行試驗，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD），丙烯酰胺加標回收率和精密度見表2。

由表2可知，在50、100和400 μg/kg的加標水平下，丙烯酰胺的平均回收率為71.2%～97.3%，RSD 為 1.9%～8.4%，回收率滿足GB 5009.295—2023 《食品安全國家標準 化學分析方法驗證通則》正確度和精密度要求：當加標量為10～100 μg/kg 時，回收率為 70%～120%，實驗室內(nèi)RSD≤15%；當加標量為100～1 000 μg/kg 時，回收率為80%～110%，實驗室內(nèi)RSD≤10%；該試驗數(shù)據(jù)滿足要求，表明該方法適用于焙炒咖啡中丙烯酰胺的準確分析。

2.4.3 方法推廣可行性評價。

2.4.3.1 方法的有效性和可比性。

采用該方法對證書編號為T30135QC FAPAS焙炒咖啡中的丙烯酰胺質(zhì)控樣進行6次平行試驗，質(zhì)控樣檢測平均值為156 μg/kg，檢測結(jié)果在證書指定值范圍內(nèi)（98～240 μg/kg），證明了檢測方法的有效性和可比性。

2.4.3.2 方法的普遍適用性。該方法采用正己烷除脂、乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質(zhì)、硅藻土-GCB基質(zhì)固相分散復合凈化提取物中的雜質(zhì)，與文獻報道的單一凈化方式^［21］相比凈化液呈清涼透明狀，經(jīng)有機溶劑置換氮吹濃縮后濃縮物底部無脂肪殘留，表明該方法對提取物凈化效果較好，采用該方法進行處理能有效降低對設(shè)備的污染，同時采用氯化鈉鹽析乙酸乙酯萃取實現(xiàn)丙烯酰胺高含量的富集，有效提高分析方法的靈敏度。基于優(yōu)異的凈化效果和準確的定量性能，該方法在常規(guī)實驗室具有普遍的適用性。

2.5 方法用于實際樣品的測定

應(yīng)用該方法對普洱市售的15批次焙炒咖啡進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15份樣品中均有丙烯酰胺檢出，含量在63～267 μg/kg，15個市售樣品中丙烯酰胺的殘留量均低于歐盟對焙炒咖啡殘留限量值（400 μg/kg）。

3 結(jié)論

該研究基于 LC-MS/MS 建立了焙炒咖啡中丙烯酰胺殘留量的測定方法。 以 ¹³C 3-丙烯酰胺為內(nèi)標物，樣品經(jīng)超純水超聲浸提，依次經(jīng)正己烷萃取部分提取物K 4Fe（CN） 6·3H 2O和Zn（CH 3COO） 2沉淀蛋白質(zhì)、硅藻土和GCB凈化等流程凈化目標分析物，最后經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮實現(xiàn)高含量的富集，LC-MS/MS在ESI電離模式下測定丙烯酰胺含量。所建立的方法簡單易操作、凈化效果理想、準確性和靈敏度高，可實現(xiàn)焙炒咖啡中丙烯酰胺準確測定，滿足咖啡中丙烯酰胺安全性監(jiān)控要求。

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