摘要" 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接探討鄧氏溫膽湯治療動脈粥樣硬化（AS）的潛在分子機(jī)制及靶點(diǎn)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。方法：從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）中獲取鄧氏溫膽湯的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)。下載GSE28829和GSE4329，鑒定早期和晚期AS斑塊之間的差異表達(dá)基因，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。通過多種生物信息學(xué)算法確定AS的最佳候選基因，并與鄧氏溫膽湯相關(guān)靶點(diǎn)相交，從而確定關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。最后，通過分子對接和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：共收集鄧氏溫膽湯中190個化合物和261個對應(yīng)的治療靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)集中鑒定出81個差異表達(dá)基因，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）被篩選為鄧氏溫膽湯治療AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此外，MMP9在動脈粥樣硬化模型中表達(dá)水平顯著升高，具有良好的診斷價值，且5種關(guān)鍵活性化合物與MMP9穩(wěn)定結(jié)合。在體內(nèi)，鄧氏溫膽湯可通過抑制斑塊形成，減少載脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠泡沫細(xì)胞沉積和膠原纖維含量，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的組織病理學(xué)損傷。免疫組化顯示鄧氏溫膽湯能顯著抑制MMP9的表達(dá)。結(jié)論：鄧氏溫膽湯能通過多種有效成分、治療靶點(diǎn)及信號通路協(xié)同互作從而治療AS，MMP9可能是一個關(guān)鍵的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞" 動脈粥樣硬化；鄧氏溫膽湯；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；基質(zhì)金屬蛋白酶9

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.03.003

Revealing the Mechanism and Therapeutic Target of Dengshi Wendan Decoction on Atherosclerosis Based on Network Pharmacology

FANG Junfeng， LIU Shiyi， WU Wei

The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， Guangdong， China

Corresponding Author" WU Wei， E-mail： zywuwei@163.com

Abstract Objective：To examine the potential molecular mechanism and therapeutic target of Dengshi Wendan Decoction（DSWD） for the treatment of atherosclerosis（AS） based on network pharmacology，molecular docking，and experimental verification.Methods：Active ingredients and corresponding targets in DSWD were obtained from Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）.GSE28829 and GSE43292 were downloaded to identify the differential expressed genes（DEGs） of early and advanced atherosclerotic plaques，then enrichment analyses were performed on DEGs. The optimal candidate genes of AS were identified by several bioinformatics algorithms，which intersected with DSWD-related targets to determine the essential treatment targets.Ultimately，the hub targets were validated by molecular docking and vivo experiments.Results：A total of 190 compounds and 261 corresponding targets were screened out，and 81 DEGs were identified，then the matrix metalloproteinase 9（MMP9） was intersected as the hub target for DSWD against AS.Additionally，MMP9 showed a significantly higher expression level in the AS group with promising diagnostic value，and five key active compounds reliably and firmly binded with MMP9.In vivo，DSWD could alleviate high fat diet-induced histopathological lesions by inhibiting plaque formation，reducing foam cell deposition and collagen fiber content in apolipoprotein E knockout（ApoE^-/-） mice.Immunohistochemistry indicated that Dengshi Wendan decoction significantly suppressed the expression of MMP9.Conclusion：DSWD could treat AS through the synergistic interplay of various active components，therapeutic targets，and signaling pathways，and MMP9 may serve as a valuable biomarker and therapeutic target.

Keywords" atherosclerosis; Dengshi Wendan Decoction; network pharmacology; molecular docking; matrix metalloproteinase-9

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性、進(jìn)行性炎癥性動脈壁疾病，其特征是脂質(zhì)和纖維成分在大動脈中蓄積，是心血管疾病最常見的病理基礎(chǔ)^［1］。AS早期斑塊在脂質(zhì)沉積和炎癥之間的協(xié)同驅(qū)動下不斷進(jìn)展，最終晚期易損斑塊破裂引起的急性血管栓塞事件是心血管疾病最常見的死亡原因^［2］。盡管過去以降脂和抗血栓治療為主要治療手段取得了一定成就，但引發(fā)的不良反應(yīng)仍令人擔(dān)憂^［3］。更重要的是，他汀類藥物減輕炎癥的作用有限，而且接受常規(guī)他汀類藥物治療的病人發(fā)生主要心血管事件的殘余風(fēng)險仍然較高^［4］?？寡ㄋ幬锸褂脛t與出血風(fēng)險相關(guān)，應(yīng)根據(jù)病人具體情況謹(jǐn)慎使用^［5］。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化水平不斷提高，國內(nèi)外越來越多的證據(jù)已表明，中醫(yī)藥以其全面的理論框架、多途徑、多靶點(diǎn)、良好的安全性在AS防治中發(fā)揮著重要作用^［6-7］。

根據(jù)中醫(yī)理論，氣虛、痰濁、血瘀是AS的核心致病因素^［8］。氣可化血行血，氣亦可化津布津，氣虛則痰濁血瘀內(nèi)生，此為歷代醫(yī)家不斷傳承發(fā)展的痰瘀相關(guān)學(xué)說，也是國醫(yī)大師鄧鐵濤教授提出氣血痰瘀理論的重要依據(jù)^［9］。針對氣虛痰濁血瘀的關(guān)鍵病機(jī)，鄧鐵濤教授在著名傳統(tǒng)方溫膽湯的基礎(chǔ)上加減化裁而制定具有益氣、化痰、活血等功效的鄧氏溫膽湯，由半夏、化橘紅、枳殼、竹茹、茯苓、黨參、丹參、豨薟草、甘草九味中藥組成，已被廣泛應(yīng)用于AS及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療^［10-13］。然而，鄧氏溫膽湯治療AS的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方的機(jī)制研究中具有重要作用，其研究方法的整體性和系統(tǒng)性符合中醫(yī)整體觀和辨證論治原則，可用于活性化合物的發(fā)現(xiàn)、治療靶點(diǎn)的鑒定以及調(diào)控信號通路的篩選。此外，通過高通量技術(shù)獲得的大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)可通過生物信息學(xué)手段重復(fù)利用，對微陣列數(shù)據(jù)的分析可輔助識別疾病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)^［14］。本研究整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)初步揭示了鄧氏溫膽湯治療AS的潛在機(jī)制和關(guān)鍵靶點(diǎn)，并通過分子對接和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，為將來全面闡明鄧氏溫膽湯藥理機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 AS差異表達(dá)基因鑒定

在GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載芯片數(shù)據(jù)集GSE28829和GSE43292的基因表達(dá)譜。GSE28829包括16個晚期AS斑塊樣本和13個早期AS斑塊樣本，GSE43292包括32個AS樣本和32個正常對照樣本。對這兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化和合并后，使用R中的Limma包根據(jù)adjusted-P＜0.05和|log2FC|＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)識別差異表達(dá)基因。

1.2 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

利用R中的cluster profiler包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，P＜0.05被認(rèn)為顯著富集。GO分析包括生物過程（biological processes，BP）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）。KEGG通路富集結(jié)果和GO富集條目排名分別以P值排序的柱狀圖表示。

1.3 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將差異表達(dá)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），以生物限定為“Homo sapiens”構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并將交互評分設(shè)置為0.4。將PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)送到Cytoscape 3.9.0軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。應(yīng)用CytoNCA插件計算拓?fù)鋮?shù)并檢測PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，參數(shù)包含介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）、局部平均連通性（LAC）。

1.4 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）和支持向量機(jī)-遞歸特征消除（SVM-RFE）分析

利用WGCNA R包，分析鄰接矩陣描述關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，構(gòu)建層次聚類識別模塊，每個模塊必須至少包含30個基因。隨后對模塊進(jìn)行層次聚類，并對相似模塊進(jìn)行合并。通過計算基因顯著性和模塊成員數(shù)分別評估每個基因的表達(dá)譜，獲得候選基因。SVM-RFE是一種基于小樣本的改進(jìn)學(xué)習(xí)方法，在基因預(yù)測樣本中得到了廣泛的應(yīng)用。使用SVM-RFE算法評估交叉驗(yàn)證誤差最小的點(diǎn)，并選擇這些點(diǎn)作為最優(yōu)基因。

1.5 鄧氏溫膽湯活性成分及調(diào)控靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中獲得口服生物利用度（OB）≥30%且藥物相似度（DL）≥0.18的化合物，并收集每種化合物相應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。隨后，利用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化。

1.6 篩選鄧氏溫膽湯抗AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)

應(yīng)用R軟件與Microsoft Excel取交集，在PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因、AS相關(guān)候選基因和鄧氏溫膽湯潛在調(diào)控基因中重疊的靶點(diǎn)被認(rèn)為是治療AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過GSE43292中的箱線圖對關(guān)鍵基因在正常和AS組織中的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析評估核心基因的可靠性，通過計算GSE43292中的曲線下面積（AUC）及95%置信區(qū)間（CI）來可視化該基因的診斷價值。

1.7 分子對接

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB，http：//www.rcsb.org）下載對接靶點(diǎn)的二維結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)脫水、原配體刪除、氫化，并以PDBQT格式保存為對接受體。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載小分子化合物mol2格式文件，加載AutoDockTools添加原子電荷并保存為對接配體PDBQT格式文件。采用AutoDock Vina進(jìn)行半柔性分子對接。當(dāng)結(jié)合能小于－20.93 kJ/mol時^［15］，認(rèn)為對接結(jié)果穩(wěn)定可靠，并用PyMOL顯示出最優(yōu)對接構(gòu)象。

1.8 AS動物模型構(gòu)建及處理

無特定病原體（SPF）級雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠20只，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自廣東集萃藥康生物科技有限公司［編號：SCXK（YUE）2020-0054］。所有小鼠均在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級環(huán)境下進(jìn)行光暗循環(huán)、自由取食飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將20只ApoE^-/-小鼠隨機(jī)分為模型組、鄧氏溫膽湯組，每組10只，模型組給予高脂飲食喂養(yǎng)；鄧氏溫膽湯組給予高脂飲食喂養(yǎng)，30 g/（kg·d）鄧氏溫膽湯凍干粉懸液灌胃。各組均連續(xù)喂養(yǎng)16周，鄧氏溫膽湯組從第9周開始灌胃，持續(xù)至第16周末。干預(yù)8周后，所有小鼠均以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后安樂死，收集主動脈組織于4%多聚甲醛中進(jìn)一步分析。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：GZTCMF1-20230011）。鄧氏溫膽湯凍干粉制備：半夏10 g，化橘紅6 g，枳殼6 g，竹茹10 g，茯苓12 g，黨參15 g，丹參12 g，豨薟草10 g，甘草5 g，將所有藥材放入800 mL純凈水中浸泡30 min，再煮沸1 h，過濾。重復(fù)上述步驟2次后，將所得濾液混合，4 ℃，5 000 r/min離心15 min，收集上清液并濃縮后，放入真空冷凍干燥機(jī)中作為凍干粉。最后將凍干粉溶解于超純水中，制成100 mg/mL溶液，用0.22 μm微孔膜過濾。

1.9 組織病理學(xué)檢測及關(guān)鍵靶點(diǎn)驗(yàn)證

主動脈標(biāo)本被固定在4%多聚甲醛中，并包埋在石蠟中。使用顯微切片機(jī)（德國徠卡）制備4 μm的橫向冰凍切片，并按順序安裝在載玻片上。切片采用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。Masson染色觀察主動脈標(biāo)本膠原變化，將主動脈組織固定并包埋，然后用于制備4 μm的切片。所有切片均按照Masson染色試劑盒說明書依次用蘇木精、酸性胭脂紅溶液、苯胺藍(lán)溶液染色。最后用中性樹脂封閉染色切片。以抗基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9 （1∶100，Abcam）為一抗，采用免疫組化法（IHC）檢測關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)水平。將切片脫蠟并復(fù)水，然后在檸檬酸緩沖液中煮沸15 min，維持在92～98 ℃以修復(fù)抗原。一抗與樣品在4 ℃孵育過夜，二抗加入室溫孵育30 min，然后加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，顯微鏡下觀察染色情況。

2 結(jié)果

2.1 早期與晚期AS中差異表達(dá)基因

GSE28829和GSE43292中對照組和AS組之間共鑒定出81個差異表達(dá)基因，其中57個上調(diào)基因，24個下調(diào)基因。分別采用熱圖和火山圖對差異表達(dá)基因進(jìn)行可視化，詳見圖1、圖2。

2.2 GO和KEGG富集分析結(jié)果

BP富集分析主要涉及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織和多細(xì)胞生物穩(wěn)態(tài)。CC富集分析主要涉及含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和細(xì)胞頂端部分。MF富集分析主要包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、糖胺聚糖結(jié)合、肽酶調(diào)節(jié)活性、氧化還原酶活性等。詳見圖3。KEGG通路富集分析中，根據(jù)P值排序，發(fā)現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路和晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路顯著富集。詳見圖4。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因

隱藏游離節(jié)點(diǎn)后，得到PPI網(wǎng)絡(luò)中的57個節(jié)點(diǎn)和278條邊，代表基因之間的交互作用模式。通過CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)計算：BC（中位數(shù)＝9.285 989 999）、CC（中位數(shù)＝0.164 222 874）、DC（中位數(shù)＝7）、EC（中位數(shù)＝0.063 921 571）、NC（中位數(shù)＝4.571 428 571）和LAC（中位數(shù)＝5.333 333 3）。將上述6個拓?fù)鋮?shù)值均大于中位數(shù)的基因作為核心基因。因此，共有20個節(jié)點(diǎn)被確定為核心基因。詳見圖5。

（A為差異基因靶點(diǎn)間相互作用；B為網(wǎng)絡(luò)中核心基因。藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表基因，連線代表互作聯(lián)系）

2.4 WGCNA和SVM-RFE分析

如圖6所示，最優(yōu)軟閾值為17。將關(guān)聯(lián)模塊合并后，聚類樹顯示出3個共表達(dá)模塊（見圖7），并計算出模塊與臨床性狀的相關(guān)性（見圖8、圖9）。藍(lán)綠色模塊與AS的正相關(guān)最強(qiáng)（r＝0.62）。因此，收集了包含220個與AS相關(guān)的候選基因的藍(lán)綠模塊進(jìn)行進(jìn)一步分析（cor＝0.7， P＝1.9e-36），詳見圖10。SVM-RFE算法在特征基因個數(shù)為40時誤差最?。ㄒ妶D11）。

2.5 鄧氏溫膽湯成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP共篩選出活性化合物190個，包括半夏11個、丹參58個、茯苓6個、黨參17個、甘草88個、化橘紅8個、豨薟草9個、枳殼5個，其中β-谷甾醇、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、常春藤皂甙元、柚皮素、3-β-羥甲基丹參酮、川陳皮素來自兩種或兩種以上的中草藥，藥物-成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖12，該網(wǎng)絡(luò)由460個節(jié)點(diǎn)（包含9種藥物的190個化合物和261個靶點(diǎn)）和3 229條邊組成。

2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選及診斷價值驗(yàn)證

通過交集發(fā)現(xiàn)MMP9可能作為鄧氏溫膽湯抗AS的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)（見圖13）。隨后，選擇MMP9進(jìn)一步評價。如圖14所示，晚期AS中MMP9表達(dá)水平明顯高于早期AS，ROC曲線下面積（AUC）為0.815，95% CI（0.727，0.897），表明MMP9具有很好的診斷價值。

2.7 分子對接

藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示，槲皮素、黃芩素、木犀草素、丹參酮ⅡA和川陳皮素是候選靶向藥物分子，分子對接結(jié)果顯示5種化合物可與MMP9成功對接，且結(jié)合能均低于－20.93 kJ/mol，表明MMP9極可能是鄧氏溫膽湯發(fā)揮抗AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此外，結(jié)合能最低的三維對接構(gòu)象如圖15所示，小分子周圍的氫鍵與目標(biāo)蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物。槲皮素與氨基酸殘基ALA 189、LEU 188、GLU 402和MET 422穩(wěn)定結(jié)合。木犀草素在PRO 415形成氫鍵增強(qiáng)了結(jié)合穩(wěn)定性。詳見圖15、表1。

2.8 鄧氏溫膽湯改善AS組織病理損傷

如圖16A所示，模型組AS斑塊面積明顯增加，主動脈內(nèi)膜嚴(yán)重增厚，纖維帽結(jié)構(gòu)變薄，內(nèi)皮細(xì)胞下可見泡沫細(xì)胞沉積。增厚的斑塊周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，并伴有相對較多的炎癥浸潤。與模型組比較，鄧氏溫膽湯組主動脈標(biāo)本病理情況明顯改善。Masson染色也顯示類似結(jié)果，鄧氏溫膽湯組主動脈組織中斑塊形成和膠原沉積明顯減少（見圖16B）。這些結(jié)果表明，鄧氏溫膽湯可通過減輕高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE^-/-小鼠組織病理學(xué)損傷，抑制斑塊形成，從而發(fā)揮抗AS作用。

2.9 免疫組化驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)

基于以上生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，MMP9可能作為潛在生物標(biāo)志物和關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。通過免疫組化檢測MMP9的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與模型組相比，經(jīng)鄧氏溫膽湯治療的小鼠AS斑塊中MMP9水平明顯下降（見圖17）。

3 討論

心血管疾病死亡是全球總死亡的主要原因，尤其是心肌梗死，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)，給國家和個人造成沉重負(fù)擔(dān)^［16］。在心血管疾病的眾多病因中，AS是最重要的病因。雖然許多中藥制劑已用于AS的臨床治療，但由于其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，難以在分子水平進(jìn)行研究。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)使系統(tǒng)研究中藥配方成為可能，結(jié)合多種分析方法可以提高預(yù)測性能，從而提供高精度的治療模型。AS是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病名，可以根據(jù)其病變累及部位及相應(yīng)臨床癥候特點(diǎn)，將其歸屬于“胸痹心痛”“心悸”“眩暈”“脈痹”等范疇辨證施治，其主要病機(jī)為氣虛痰濁血瘀。鄧氏溫膽湯方中用黨參益氣健脾扶正，丹參活血通脈，枳殼、化橘紅理氣化痰，竹茹清熱滌痰，半夏燥濕除痰，茯苓利水滲濕、健脾寧心，豨薟草除濕解毒，甘草調(diào)和諸藥并和胃。鄧氏溫膽湯全方可達(dá)益氣除痰、活血化瘀之功效。

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，在模型組和正常組之間發(fā)現(xiàn)81個差異表達(dá)基因，然后對其進(jìn)行富集分析以探索其生物學(xué)功能和潛在的分子機(jī)制。GO富集結(jié)果提示AS的病因可能與調(diào)節(jié)肽酶活性、氧化還原反應(yīng)、血小板結(jié)合有關(guān)，涉及細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔等結(jié)構(gòu)成分。根據(jù)既往研究，細(xì)胞外基質(zhì)分解可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，加速早期AS的發(fā)展^［17］。肽酶活性具有重要的生理意義，如泛素特異性肽酶9X（USP9X）參與了許多細(xì)胞過程的控制，包括免疫反應(yīng)和物質(zhì)運(yùn)輸，而USP9X缺乏可加劇炎癥和促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成^［18］。氧化還原反應(yīng)失衡引起劇烈的氧化應(yīng)激，可影響心臟能量代謝^［19］，過度氧化會直接增加低密度脂蛋白膽固醇氧化和全身炎癥水平^［20］。研究表明，血小板活化和黏附于血管內(nèi)皮引起中性粒細(xì)胞募集和遷移^［21］，主動脈病變的嚴(yán)重程度被證實(shí)與血小板活化增加的程度呈正相關(guān)^［22］。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)癥中的PI3K-AKT信號通路和AGE-RAGE信號通路可能是AS的關(guān)鍵通路，這與既往研究結(jié)果一致。研究表明，PI3K及其下游分子AKT組成的PI3K-AKT信號通路對多種細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等信號分子的產(chǎn)生至關(guān)重要^［23］。阻斷PI3K-AKT信號通路可以減輕氧化低密度脂蛋白膽固醇引起的炎癥反應(yīng)，減少AS內(nèi)皮損傷^［24］。而當(dāng)PI3K-AKT信號通路被激活時，可阻礙自噬對膽固醇代謝的控制，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成^［25］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PI3K/AKT信號通路在AS小鼠模型中被激活，引起血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這對AS斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著不利影響^［26］。AGE-RAGE信號通路的過度激活可破壞內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝，促進(jìn)氧化應(yīng)激，在AS的發(fā)病機(jī)制中也起重要作用^［27］。此外，AGE-RAGE信號通路激活下游核因子κB（NF-κB）信號通路引起細(xì)胞凋亡，促進(jìn)糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥，并與炎癥和胰島素抵抗顯著相關(guān)^［28-29］。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出槲皮素、黃芩素、木犀草素、丹參酮ⅡA和川陳皮素具有同時調(diào)節(jié)包括MMP9在內(nèi)的多個靶點(diǎn)并與MMP9建立穩(wěn)定對接的能力，因此，這些成分可能是鄧氏溫膽湯發(fā)揮抗AS的有效活性物質(zhì)。具有強(qiáng)大抗炎能力的槲皮素可以通過調(diào)控自噬來延緩AS的發(fā)生^［30］。此外，槲皮素還能增加細(xì)胞抗氧化能力，減少活性氧生成，逆轉(zhuǎn)脂多糖引起的巨噬細(xì)胞M1型極化^［31］。黃芩素是一種具有多種藥理特性的黃酮類化合物，具有抗AS的應(yīng)用前景，因?yàn)辄S芩素可以顯著減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膽固醇外流^［32］。木犀草素是常見的類黃酮物質(zhì)，具有抗心血管疾病的作用，包括防止AS、抗心肌缺血再灌注損傷、保護(hù)心臟功能^［33］。基礎(chǔ)研究表明，木犀草素可以阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的激活，從而減輕炎癥反應(yīng)，延緩AS的病程^［34］。丹參酮ⅡA也常被用于治療AS，可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和焦亡，同時增強(qiáng)線粒體功能^［35］。川陳皮素的抗AS活性也得到了前期研究的有力支持，特別是在控制糖脂代謝異常方面的益處^［36］。因此，鄧氏溫膽湯可能通過多種有效成分協(xié)同作用從而發(fā)揮治療AS作用。

MMP9可能是鄧氏溫膽湯治療AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族的一員，能夠分解不同的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分，維持細(xì)胞的動態(tài)穩(wěn)態(tài)。幾乎所有的炎癥性疾病都有MMPs表達(dá)增加，MMPs可觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放，這一病理生理過程加劇了炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了AS的發(fā)生和進(jìn)展^［37］。研究發(fā)現(xiàn)，MMP9水平升高與斑塊不穩(wěn)定和AS血栓形成相關(guān)^［38-39］。此外，MMP9在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，在斑塊破裂或糜爛的晚期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，這可能與細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原降解有關(guān)^［40］。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子可以被MMP9裂解，裂解產(chǎn)物同樣對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用^［41］。相反，MMP9缺乏可顯著抑制膠原沉積、巨噬細(xì)胞浸潤和主動脈AS負(fù)荷^［42］。這與前期在數(shù)據(jù)集驗(yàn)證和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)一致，通過免疫組化觀察到鄧氏溫膽湯組AS斑塊面積明顯減少，膠原沉積較小，并顯著下調(diào)MMP9表達(dá)水平。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)方法對鄧氏溫膽湯治療AS的潛在作用機(jī)制進(jìn)行較為全面的分析，確認(rèn)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，并在分子對接及體外實(shí)驗(yàn)中得以進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果在一定程度上得到現(xiàn)有文獻(xiàn)研究的支持，這為進(jìn)一步研究鄧氏溫膽湯的藥理機(jī)制提供了重要理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ JEBARI-BENSLAIMAN S，GALICIA-GARCIA U，LARREA-SEBAL A，et al.Pathophysiology of Atherosclerosis［J］.Int J Mol Sci，2022，23（6）：3346.

［2］ FALK E.Pathogenesis of atherosclerosis［J］.Journal of the American College of Cardiology，2006，47（8）：C7-C12.

［3］ SHEN L，SHAH B R，REYES E M，et al.Role of diuretics，beta blockers，and statins in increasing the risk of diabetes in" patients with impaired glucose tolerance：reanalysis of data from the NAVIGATOR" study［J］.BMJ，2013，347：f6745.

［4］ BOHULA E A，GIUGLIANO R P，CANNON C P，et al.Achievement of dual low-density lipoprotein cholesterol and high-sensitivity C-reactive protein targets more frequent with the addition of ezetimibe to simvastatin and associated with better outcomes in IMPROVE-IT［J］.Circulation，2015，132（13）：1224-1233.

［5］ VERHEUGT F W A，TEN BERG J M，STOREY R F，et al.Antithrombotics：from aspirin to DOACs in coronary artery disease and atrial fibrillation （part 3/5）［J］.Journal of the American College of Cardiology，2019，74（5）：699-711.

［6］ ZHI W B，LIU Y，WANG X M，et al.Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis［J］.Journal of Ethnopharmacology，2023，301：115749.

［7］ LI T T，WANG Z B，LI Y，et al.The mechanisms of traditional Chinese medicine underlying the prevention and treatment of atherosclerosis［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2019，17（6）：401-412.

［8］ LI J，DU Y Y，CAI C，et al.Effectiveness and safety of treating carotid atherosclerotic plaques with the method of nourishing Qi，promoting blood circulation and expelling phlegm：a systematic review and meta-analysis［J］.Frontiers in Pharmacology，2022，13：1059737.

［9］ 李輝，邱仕君.鄧鐵濤教授對“痰瘀相關(guān)”理論的闡釋和發(fā)揮［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，22（1）：45-47.

［10］"""""" 王嵩，劉嘉芬，何小蓮，等.鄧鐵濤教授益氣除痰活血法治療冠心病經(jīng)驗(yàn)［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2019，37（3）：699-702.

［11］"""""" 劉小斌，黃子天.鄧氏溫膽湯治療氣虛痰濁證的學(xué)術(shù)傳承及臨床應(yīng)用［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，32（4）：755-758.

［12］"""""" 蘇子昂，董倩影，劉澤銀，等.國醫(yī)大師鄧鐵濤治療冠心病經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后焦慮抑郁癥經(jīng)驗(yàn)［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2021，28（12）：103-106.

［13］"""""" XU D P，WANG X，LUO W J，et al.The clinical cohort study on prospective efficacy of CHD Therapeutic Regimen of ＂the regulation of Pi（Spleen） and protection of Xin（Heart）＂ method treating CHD patients［C］.2014 IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine （BIBM），2014：1-5.

［14］"""""" STURN A，QUACKENBUSH J，TRAJANOSKI Z.Genesis：cluster analysis of microarray data［J］.Bioinformatics，2002，18（1）：207-208.

［15］"""""" GAILLARD T.Evaluation of AutoDock and AutoDock vina on the CASF-2013 benchmark［J］.Journal of Chemical Information and Modeling，2018，58（8）：1697-1706.

［16］"""""" MOZAFFARIAN D，BENJAMIN E J，GO A S，et al.Heart disease and stroke statistics-2016 update：a report from the American Heart" Association［J］.Circulation，2016，133（4）：e38-e360.

［17］"""""" BENNETT M R，SINHA S，OWENS G K.Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis［J］.Circulation Research，2016，118（4）：692-702.

［18］"""""" WANG B，TANG X，YAO L，et al.Disruption of USP9X in macrophages promotes foam cell formation and" atherosclerosis［J］.J Clin Invest，2022，132（10）：e154217.

［19］"""""" BAR-OR D，BAR-OR R，RAEL L T，et al.Oxidative stress in severe acute illness［J］.Redox Biology，2015，4：340-345.

［20］"""""" ANSELL B J，F(xiàn)ONAROW G C，NAVAB M，et al.Modifying the anti-inflammatory effects of high-density lipoprotein［J］.Current Atherosclerosis Reports，2007，9（1）：57-63.

［21］"""""" BADRNYA S，BUTLER L M，SODERBERG-NAUCLER C，et al.Platelets directly enhance neutrophil transmigration in response to oxidised low-density lipoprotein［J］.Thromb Haemost，2012，108（4）：719-729.

［22］"""""" Musselman D L，Marzec U，Davidoff M，et al.Platelet activation and secretion in patients with major depression，thoracic aortic atherosclerosis，or renal dialysis treatment［J］.Depress Anxiety，2002，15（3）：91-101.

［23］"""""" MARTELLI A M，NY?KERN M，TABELLINI G，et al.Phosphoinositide 3-kinase/Akt signaling pathway and its therapeutical implications for human acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2006，20（6）：911-928.

［24］"""""" ZHANG X X，LI Z Q，LIU X D，et al.ZPI prevents ox-LDL-mediated endothelial injury leading to inhibition of EndMT，inflammation，apoptosis，and oxidative stress through activating PI3K/Akt signal pathway［J］.Drug Development Research，2022，83（5）：1212-1225.

［25］"""""" PI S L，MAO L，CHEN J F，et al.The P2RY12 receptor promotes VSMC-derived foam cell formation by inhibiting autophagy in advanced atherosclerosis［J］.Autophagy，2021，17（4）：980-1000.

［26］"""""" SUN G Q，LI Y B，JI Z Y.Up-regulation of MIAT aggravates the atherosclerotic damage in atherosclerosis mice through the activation of PI3K/Akt signaling pathway［J］.Drug Delivery，2019，26（1）：641-649.

［27］"""""" LEE T W，KAO Y H，CHEN Y J，et al.Therapeutic potential of vitamin D in AGE/RAGE-related cardiovascular diseases［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2019，76（20）：4103-4115.

［28］"""""" LEE S M，LEE J，KANG E，et al.Lipidomic analysis reveals therapeutic effects of Yijin-Tang on high-fat/high-cholesterol diet-induced obese mice［J］.Phytomedicine，2020，74：152936.

［29］"""""" MALTAIS J S，SIMARD E，F(xiàn)ROEHLICH U，et al.iRAGE as a novel carboxymethylated peptide that prevents advanced glycation end product-induced apoptosis and endoplasmic reticulum stress in vascular smooth muscle cells［J］.Pharmacological Research，2016，104：176-185.

［30］"""""" GARELNABI M，MAHINI H，WILSON T.Quercetin intake with exercise modulates lipoprotein metabolism and reduces atherosclerosis plaque formation［J］.Journal of the International Society of Sports Nutrition，2014，11（1）：22.

［31］"""""" TSAI C F，CHEN G W，CHEN Y C，et al.Regulatory effects of quercetin on M1/M2 macrophage polarization and oxidative/antioxidative balance［J］.Nutrients，2022，14（1）：67.

［32］"""""" ZHANG Z Z，YU X H，TAN W H.Baicalein inhibits macrophage lipid accumulation and inflammatory response by activating the PPARgamma/LXRalpha pathway［J］.Clin Exp Immunol，2022，209（3）：316-325.

［33］"""""" LUO Y Y，SHANG P P，LI D Y.Luteolin：a flavonoid that has multiple cardio-protective effects and its molecular mechanisms［J］.Frontiers in Pharmacology，2017，8：692.

［34］"""""" DING X J，ZHENG L L，YANG B，et al.Luteolin attenuates atherosclerosis via modulating signal transducer and activator of transcription 3-mediated inflammatory response［J］.Drug Design，Development and Therapy，2019，13：3899-3911.

［35］"""""" ZHU J，CHEN H，GUO J N，et al.Sodium tanshinone ⅡA sulfonate inhibits vascular endothelial cell pyroptosis via the AMPK signaling pathway in atherosclerosis［J］.Journal of Inflammation Research，2022，15：6293-6306.

［36］"""""" MULVIHILL E E，ASSINI J M，LEE J K，et al.Nobiletin attenuates VLDL overproduction，dyslipidemia，and atherosclerosis in mice with diet-induced insulin resistance［J］.Diabetes，2011，60（5）：1446-1457.

［37］"""""" PARKS W C，WILSON C L，LOPEZ-BOADO Y S.Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity［J］.Nat Rev Immunol，2004，4（8）：617-629.

［38］"""""" W?GS?TER D，ZHU C，BJ?RKEGREN J，et al.MMP-2 and MMP-9 are prominent matrix metalloproteinases during atherosclerosis" development in the Ldlr（-/-）ApoB（100/100） mouse［J］.Int J Mol Med，2011，28（2）：247-253.

［39］"""""" SHI Y，PATEL S，NICULESCU R，et al.Role of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in the regulation of coronary cell migration［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，1999，19（5）：1150-1155.

［40］"""""" RUDDY J M，IKONOMIDIS J S，JONES J A.Multidimensional contribution of matrix metalloproteinases to atherosclerotic plaque vulnerability：multiple mechanisms of inhibition to promote stability［J］.Journal of Vascular Research，2016，53（1/2）：1-16.

［41］"""""" NEWBY A C，JOHNSON J L.Genetic strategies to elucidate the roles of matrix metalloproteinases in atherosclerotic plaque growth and stability［J］.Circulation Research，2005，97（10）：958-960.

［42］"""""" LUTTUN A，LUTGENS E，MANDERVELD A，et al.Loss of matrix metalloproteinase-9 or matrix metalloproteinase-12 protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth［J］.Circulation，2004，109（11）：1408-1414.

（本文編輯 郭懷印）

基金項(xiàng)目 廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（No.2021KQNCX013）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新中心科研專項(xiàng)青年項(xiàng)目（No.2023QN01）

通訊作者 吳偉，E-mail：zywuwei@163.com

引用信息 方俊鋒，劉詩怡，吳偉.鄧氏溫膽湯抗動脈粥樣硬化作用靶點(diǎn)及機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2025，23（3）：337-348.