摘 要： "為探究稀有物種山東銀蓮花在全光照的山頂灌叢和陰暗的針闊混交林下兩種不同生境中的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，并開發(fā)其EST-SSR分子標(biāo)記，該研究利用Illumina高通量測序技術(shù)對開花期的山東銀蓮花葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲取其功能注釋和差異表達(dá)基因（DEGs）。結(jié)果表明：（1）轉(zhuǎn)錄組測序共得到53 536條Unigenes序列，其中27 448條成功獲得注釋。（2）差異表達(dá)基因5 635個(gè)，1 600個(gè)在山頂灌叢的山東銀蓮花中上調(diào)表達(dá)，其余4 035個(gè)下調(diào)表達(dá)。有2 460個(gè)差異表達(dá)基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫2 533個(gè)三級條目中，1 051個(gè)差異表達(dá)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的113條代謝通路中。（3）山東銀蓮花適應(yīng)于異質(zhì)生境的代謝通路主要涉及光合作用-天線蛋白通路和類黃酮生物合成通路，光合作用-天線蛋白通路中l(wèi)hca5基因上調(diào)表達(dá)，lhcb1、lhcb2和lhcb3基因下調(diào)表達(dá)，類黃酮生物合成通路中chs、c4h、f3′h、f3h、fls、ans、chi、ccoaomt和hct基因均上調(diào)表達(dá)。（4）從山東銀蓮花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共獲得7 146個(gè)SSR位點(diǎn)分布于6 006條Unigenes序列中，共計(jì)106種重復(fù)基序，優(yōu)勢重復(fù)基序?yàn)閱魏塑账嶂貜?fù)。設(shè)計(jì)合成100對EST-SSR引物中共有68對引物具有有效性，其中11對具有多態(tài)性，共擴(kuò)增24個(gè)多態(tài)性片段。該研究首次開發(fā)了山東銀蓮花EST-SSR分子標(biāo)記，為山東銀蓮花的保護(hù)和利用提供了重要的分子標(biāo)記資源。

關(guān)鍵詞： 異質(zhì)生境， 山東銀蓮花， 轉(zhuǎn)錄組， EST-SSR， 生態(tài)適應(yīng)機(jī)制

中圖分類號： "Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2025）01-0095-13

基金項(xiàng)目： "國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31971546）。

第一作者： 單筱涵（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锷飳W(xué)，（E-mail）shanxiaohan0920@163.com。

*通信作者： "卞?；?，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锷飳W(xué)，（E-mail）fh_bian@163.com。

Transcriptome analysis and development of EST-SSR

molecular markers in Anemone shikokiana under

heterogeneous habitats

SHAN Xiaohan， AN Kang， ZHOU Chunxia， ZHANG Xin，

PANG Yujuan， LI Lixia， BIAN Fuhua

（ College of Life Sciences， Yantai University， Yantai 264005， Shandong， China ）

Abstract： "In order to explore， the ecological adaptation mechanisms of Anemone shikokiana in two distinct habitats， namely full-light hilltop scrub and shady mixed broadleaved-coniferous forest， and to develop its molecular markers， Illumina high-throughput sequencing technology for leaves of A. shikokiana collected during the flowering stage to obtain functional annotation and differentially expressed genes （DEGs）. The results were as follows： （1） A total of 53 536 Unigenes sequences were obtained， of which 27 448 were successfully annotated. （2） A total of 5 635 DEGs were obtained， 1 600 up-regulated and 4 035 down-regulated genes comparing A. shikokiana in full-light hilltop scrub and in shady mixed coniferous forest. A total of "2 460 DEGs were annotated to 2 533 tertiary entries in GO database. In addition， 1 051 DEGs were involved in 113 KEGG pathways. （3） The metabolic pathways adapted to heterogeneous habits in A. shikokiana mainly involved photosytheis-antenna protein pathway and flavonoid biosynthesis pathway. In the "photosynthesis-antenna protein pathway， the expression of lhca5 was up-regulated， while the

expressions of lhcb lhcb2 and lhcb3 were "down-regulated. Meanwhile， in the flavonoid biosynthesis pathway， the expressions of chs， c4h， f3′h， f3h， fls， ans， chi， ccoaomt and hct were all up-regulated. （4） A total of 6 006 Unigenes containing 7 146 SSRs were obtained from the transcriptome data of A.shikokiana. In the identified SSRs， the dominant repeat motifs were single nucleotide repeats in 106 repetitive motif types. Among the 100 pairs of EST-SSR primers， a total of 68 pairs were effective and 11 pairs with polymorphism， and 24 polymorphic fragments were amplified. Overall， in this paper， "for the first time EST-SSR molecular markers were developed， which would provide important molecular marker resource for the conservation and utilization of A. shikokiana.

Key words： heterogeneous habitat， Anemone shikokiana， transcriptome， EST-SSR， ecological adaptation mechanisms

山東銀蓮花（Anemone shikokiana）是毛茛科銀蓮花屬（Anemone）的多年生草本植物，間斷分布于中國膠東半島和日本四國島（王鷙等，2014）。在中國被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）易危（VU）等級，為典型的稀有物種（陳春利等，2018）。其根可入藥，有清熱解毒、止血除濕的功效（劉瓊，2014）；因其株型優(yōu)美、花大、花期長，在園藝上具有潛在的開發(fā)價(jià)值（侯元同和劉冰，2010）。

山東銀蓮花生長在海拔600 m以上的山頂灌叢和針闊混交林下兩種異質(zhì)生境中，山東灌叢常年全光照，土壤是以碎石、沙粒為主的砂質(zhì)性土壤；而針闊混交林下陰暗潮濕，土壤為營養(yǎng)豐富且疏松的腐殖土（Pang et al.， 2020）。岳喜元等（2023）研究表明，黃河三角洲的蘆葦通過調(diào)整個(gè)體大小與葉性狀適應(yīng)異質(zhì)生境下水分條件變化，王妍方等（2023）通過木棉表型可塑性探究其適應(yīng)干熱河谷和熱帶雨林兩種極端環(huán)境的機(jī)制。山東銀蓮花則通過改變?nèi)~片、根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理等策略適應(yīng)完全不同的生長環(huán)境（于文英等，2019；Pang er al.， 2020；逄玉娟等，2022）。然而，至今對該種適應(yīng)異質(zhì)生境的分子機(jī)制尚不清楚。植物適應(yīng)環(huán)境的本質(zhì)是基因特異性表達(dá)的結(jié)果，基因的特異性表達(dá)在一定程度上由轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控（張椿雨等，2007）。轉(zhuǎn)錄組作為特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下所有mRNA的集合，是研究基因功能與結(jié)構(gòu)的有效手段（魯艷輝等，2021）。運(yùn)用Illumina高通量測序技術(shù)對植物轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，可高效、精準(zhǔn)地獲得大量特定組織或細(xì)胞中表達(dá)的基因序列，實(shí)現(xiàn)在無參考基因組的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析（郭連安等，2021）。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)用于兩色金雞菊（孫浩男等，2024）、直立型扁蓿豆（烏日娜等，2022）等多種植物，并且已廣泛應(yīng)用于探究不同生境下植物的適應(yīng)性（周春苗等，2022；韋陳彬等，2022）。

分子標(biāo)記可用于植物的系統(tǒng)進(jìn)化分析、功能基因標(biāo)記和分子輔助育種等，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，由轉(zhuǎn)錄組測序得到的EST-SSR分子標(biāo)記被作為最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一。其操作簡單，具有共顯性遺傳、穩(wěn)定性好和準(zhǔn)確度高等優(yōu)于其他分子標(biāo)記的特點(diǎn)（岳遠(yuǎn)灝等，2022）。EST-SSR標(biāo)記開發(fā)成本低，適用于無參考基因組的物種，可有效地推動(dòng)分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源保護(hù)、品種鑒定等方面的應(yīng)用（楊雄等，2021），目前已在大麻（邊境等，2023）、辣椒（田懷志等，2023）、楓香（李輝等，2023）等植物中開發(fā)與應(yīng)用。然而，關(guān)于山東銀蓮花分子標(biāo)記的報(bào)道尚不多見，未見公開報(bào)道的可利用 SSR 標(biāo)記，使得山東銀蓮花在分子標(biāo)記方面的研究難以深入。

本研究以異質(zhì)生境下山東銀蓮花為研究對象，利用Illumina高通量測序技術(shù)獲取其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并進(jìn)行組裝和功能注釋，得到其差異表達(dá)基因和大量豐富的SSR位點(diǎn)，隨后進(jìn)行EST-SSR引物設(shè)計(jì)并加以驗(yàn)證，以期探討山東銀蓮花在異質(zhì)生境中的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，并開發(fā)適用的EST-SSR分子標(biāo)記，填補(bǔ)山東銀蓮花在以上兩方面的研究空白，為今后其遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價(jià)、功能基因標(biāo)記和分子輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)物種的保護(hù)與利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用實(shí)驗(yàn)材料均為開花期的山東銀蓮花葉片，其中轉(zhuǎn)錄組測序材料于2021年6月取自山東省煙臺市昆崳山國家級自然保護(hù)區(qū)的泰礴頂和寒風(fēng)嶺（表1），引物篩選材料于2021年9月取自青島嶗山和煙臺昆崳山（表2）。采集后用蒸餾水清洗干凈，立即放入液氮中冷凍。轉(zhuǎn)錄組測序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成，引物篩選材料帶回實(shí)驗(yàn)室后采用改良的CTAB法（閆苗苗等，2008）提取DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進(jìn)行檢測，將檢測合格的DNA統(tǒng)一稀釋至20 ng·μL^-1，放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組分析

De novo拼接：使用Trinity（Manfred et al.， 2011）軟件paired-end的拼接方法得到Transcript序列，根據(jù)序列相似性以及長度，挑選出最長的一條作為Unigene，之后再利用CD-HIT軟件聚類去冗余得到一套最終的Unigene，以此作為后續(xù)分析的參考序列。

功能注釋：利用DIAMOND（Buchfink et al.， 2014）軟件將Unigenes比對到NR、KOG、GO、Swiss-Prot、eggNOG、KEGG數(shù)據(jù)庫以及利用HMMER軟件比對Pfam數(shù)據(jù)庫來進(jìn)行Unigenes的功能分析。

差異表達(dá)基因篩選：利用DESeq（Anders amp; Huber， 2012）軟件對各個(gè)樣本基因的Counts數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用BaseMean值來估算表達(dá)量，計(jì)算差異倍數(shù)，并采用NB（負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式）對Reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以差異倍數(shù)|log2FoldChange|gt;1及差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Plt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。

1.3 引物設(shè)計(jì)與篩選

基于山東銀蓮花轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，使用軟件MISA（Beier et al.， 2017）進(jìn)行SSR預(yù)測，設(shè)置重復(fù)基序的長度為1、2、3、4、5和6，最小重復(fù)次數(shù)為10次、6次、5次、5次、5次和5次；兩個(gè)微衛(wèi)星之間的序列長度不超過100 bp即被認(rèn)定為復(fù)合微衛(wèi)星。SSR作為一種用途廣泛的分子標(biāo)記，其多態(tài)性水平越高則應(yīng)用價(jià)值越大（鄭燕等，2012）。當(dāng)SSR長度≥20 bp時(shí)可顯示出較高的多態(tài)性，長度在12～20 bp之間相對較低，在12 bp以下則很低（Temnykh et al.， 2001）。根據(jù)SSR長度≥20 bp、去除復(fù)合型SSR位點(diǎn)和容易與多腺苷化作用相混雜的A/T重復(fù)基序的原則，將所有SSR位點(diǎn)進(jìn)行初步篩選后隨機(jī)選擇100對SSR位點(diǎn)利用軟件Primer3（Rozen amp; Skaletsky， 2000）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，命名為ANS001-ANS100，送至北京六合華大基因科技有限公司合成。

利用青島嶗山滑溜口所采集樣品通過1%瓊脂糖凝膠電泳對100對引物進(jìn)行篩選，以檢測引物有效性。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：2×Master Mix 4 μL、上下游引物（10 μmol·L^-1）各2 μL、DNA模板2 μL和ddH2O10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。隨后將無法正確擴(kuò)增或擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期不符的引物篩除，可正確擴(kuò)增的引物利用樣品YD1（煙臺昆崳山泰礴頂）、YL1（煙臺昆崳山老鐵山）、QD1（青島嶗山嶗頂景區(qū)丹爐峰附近）、QL1（青島嶗山滑溜口）通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色的方法進(jìn)行目的條帶的分離和檢測，篩選出具有多態(tài)性的EST-SSR引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.1.1 總體特征 對山東銀蓮花進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得 42.34 G的Clean Data，各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在6.98～7.10 G，Q30堿基分布在93.68%～94.20%之間，證明本次測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性良好，可用于后續(xù)分析。利用De novo拼接出Unigenes 53 536條，總長度為57 909 453 bp，最長Unigene為15 502 bp，最短Unigene為301 bp，平均長度為1 081.69 bp。用皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示D和L樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性（低于0.8表示相關(guān)性較差），D組間生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性均大于0.868 9，L組間生物學(xué)重復(fù)之間相關(guān)性均大于0.831 8，表明樣品組間相關(guān)性較高，可以此作為后續(xù)分析的參考序列。

2.1.2 功能注釋 對拼接組裝的53 536條Unigenes進(jìn)行常見功能數(shù)據(jù)庫注釋，在7個(gè)數(shù)據(jù)庫中均注釋成功的Unigenes有3 505條，占總數(shù)的6.55%，至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫中注釋成功的Unigenes有27 448條，占總數(shù)的51.27%（圖1）。在NR數(shù)據(jù)庫中成功注釋的條數(shù)最多，共有27 044條，占總數(shù)的50.52%，其余分別為eggNOG 庫（23 934，44.71%）、Swiss-Prot 庫（19 637，36.68%）、Pfam 庫（17 859，33.36%）、GO 庫（17 540，32.76%）、KOG 庫（5 481，29.19%）和KEGG 庫（5 48 10.23%）。按照NR數(shù)據(jù)庫中山東銀蓮花的Unigenes與其他物種匹配可得，相似程度最高的物種為耬斗菜（Aquilegia coerulea，56.72%），其他按匹配度由高到低依次為博落回（Macleaya cordata，6.08%）、鴉片罌粟（Papaver somniferum，4.06%）、蓮（Nelumbo nucifera，3.29%）、葡萄（Vitis vinifera，1.92%）、歐洲栓皮櫟（Quercus suber，0.94%）、月季花（Rosa chinensis，0.9%）、Sphaerulina musiva SO2202（0.73%）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis，0.58%）、向日葵（Helianthus annuus，0.55%）和其他物種（24.24%）。

2.2 差異表達(dá)Unigene分析

2.2.1 差異表達(dá)Unigene篩選 對山東銀蓮花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，共挖掘差異表達(dá)Unigenes 5 635個(gè)，數(shù)量較多，其中與林下（L）的山東銀蓮花相比，山頂（D）的山東銀蓮花中有上調(diào)基因1 600個(gè)，下調(diào)基因4 035個(gè)（圖2），說明不同生長環(huán)境對山東銀蓮花基因表達(dá)影響較大。

2.2.2 差異表達(dá)Unigene富集分析 將山東銀蓮花的差異表達(dá)Unigenes進(jìn)行GO（圖3）和KEGG富集分析（圖4），結(jié)果顯示共有2 460個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到GO數(shù)據(jù)庫2 533個(gè)三級條目中，共有1 051個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的113條代謝通路中。

根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫一級條目生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能的不同，篩選3種分類中對應(yīng)差異基因數(shù)目大于2的GO二級條目，按照每個(gè)條目對應(yīng)的P值由小到大排序可得前10個(gè)富集分類，山東銀蓮花的差異表達(dá)基因主要顯著富集在脫落酸代謝過程、薄荷醇生物合成過程、硫脂生物合成過程等生物學(xué)過程中，胞質(zhì)大核糖體亞基、胞質(zhì)小核糖體亞基、核糖體等細(xì)胞成分中，芳醇脫氫酶（NADP+）活性、異戊烯醇脫氫酶活性、卡維醇脫氫酶活性等分子功能中。

將山東銀蓮花的差異表達(dá)基因比對到KEGG數(shù)據(jù)庫的參考代謝通路中，可劃分到6個(gè)類別中，其中與代謝相關(guān)通路的Unigenes數(shù)量最多，有480個(gè)，占比45.67%；其次遺傳信息加工相關(guān)通路的Unigenes有425個(gè)，占比40.44%；與環(huán)境信息處理相關(guān)通路的Unigenes有58個(gè)，占比5.52%；與生物系統(tǒng)相關(guān)通路的Unigenes有50個(gè)，占比4.76%；與細(xì)胞過程相關(guān)通路的Unigenes有37個(gè)，占比3.52%。共有10條KEGG通路達(dá)到極顯著水平（Plt;0.01），分別為核糖體、光合作用-天線蛋白、類黃酮生物合成、倍半萜和三萜生物合成、酮體的合成與降解、谷胱甘肽代謝、植物-病原互作、MAPK信號通路-植物、黃酮和黃酮醇的生物合成、二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜辣素的生物合成。

2.2.3 關(guān)鍵差異表達(dá)Unigene信息 從眾多通路中篩選出與山東銀蓮花適應(yīng)于異質(zhì)生境的主要通路（表3），其中15個(gè)差異表達(dá)Unigene屬于光合作用-天線蛋白通路，分別為1個(gè)上調(diào)基因lhca5（light-harvesting complex I chlorophyll a/b binding protein 5）、7個(gè)下調(diào)基因lhcb1（light-harvesting complex Ⅱ chlorophyll a/b binding protein 1）、6個(gè)下調(diào)基因lhcb2（light-harvesting complex Ⅱ chlorophyll a/b binding protein 2）、1個(gè)下調(diào)基因lhcb3（light-harvesting complex Ⅱ chlorophyll a/b binding protein 3）；11個(gè)差異表達(dá)Unigene屬于類黃酮生物合成通路，分別為1個(gè)chs（chalcone synthase）、1個(gè)c4h（trans-cinnamate 4-monooxygenase）、2個(gè)f3′h（flavonoid 3′-monooxygenase）、1個(gè)f3h（naringenin 3-dioxygenase）、1個(gè)fls（flavonol synthase）、1個(gè)ans（anthocyanidin synthase）、1個(gè)chi（chalcone isomerase）、1個(gè)ccoaomt（caffeoyl-CoA O-methyltransferase）、2個(gè)hct（shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase），以上基因皆為上調(diào)表達(dá)。

2.3 SSR位點(diǎn)分析與引物開發(fā)

2.3.1 SSR位點(diǎn)總體特點(diǎn) 對山東銀蓮花轉(zhuǎn)錄組的53 536條Unigenes序列進(jìn)行搜索，共檢出6 006條Unigenes序列中含有7 146個(gè)SSR位點(diǎn)，平均分布距離為8.1 kb，SSR長度在10～225 bp之間，SSR出現(xiàn)頻率（=SSR個(gè)數(shù)/總Unigene數(shù)）為13.35%，SSR發(fā)生頻率（=含SSR的Unigene數(shù)/總Unigene數(shù)）為11.22%。山東銀蓮花含有2個(gè)及以上的SSR位點(diǎn)的序列有907條，占全部序列的1.68％，含有復(fù)雜重復(fù)類型的SSR位點(diǎn)的序列有420條，占全部序列的0.78%。山東銀蓮花SSR類型較為豐富，共計(jì)106種重復(fù)基序（表4），優(yōu)勢重復(fù)基序?yàn)閱魏塑账嶂貜?fù)（3 248，45.59%），其次分別為三核苷酸重復(fù)（2 041，28.56%）、二核苷酸重復(fù)（1 645，23.02%）、六核苷酸重復(fù)（101，1.41%）、四核苷酸重復(fù)（81，1.13%）、五核苷酸重復(fù)（20，0.28%）（圖5）。

2.3.2 EST-SSR引物的開發(fā)與篩選 利用1%瓊脂糖凝膠電泳對從山東銀蓮花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挑選的100對EST-SSR引物進(jìn)行檢驗(yàn)，可得68對有效擴(kuò)增引物。為探究68對EST-SSR引物的多態(tài)性，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)來源于煙臺昆崳山泰礴頂（YD1）、煙臺昆崳山老鐵山（YL1）、青島嶗山嶗頂景區(qū)丹爐峰附近（QD1）、青島嶗山滑溜口（Q L1）的山東銀蓮花DNA擴(kuò)增結(jié)果，68對EST-SSR引物均能在上述材料中擴(kuò)增得到清晰條帶，其中有11對EST-SSR引物具有多態(tài)性（表5），共擴(kuò)增24個(gè)多態(tài)性片段。以上結(jié)果表明，基于山東銀蓮花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR引物是一種經(jīng)濟(jì)、可行的方法，可通過簡單的PCR擴(kuò)增效果驗(yàn)證得出EST-SSR引物的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和多態(tài)性。

3 討論與結(jié)論

3.1 異質(zhì)生境中山東銀蓮花的適應(yīng)機(jī)制分析

高通量測序技術(shù)能全面快速地獲得植物的轉(zhuǎn)錄本序列信息，為植物基因發(fā)掘和次生代謝物調(diào)控等研究提供了巨大便利（Lu et al.， 2010）。本研究利用高通量測序技術(shù)對異質(zhì)生境中的山東銀蓮花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過對其差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)山東銀蓮花適應(yīng)兩種異質(zhì)生境的機(jī)制主要表現(xiàn)在光合作用和類黃酮生物合成兩方面。光合作用作為植物生長和一切代謝活動(dòng)的生理基礎(chǔ)，受光照、水分、溫度等不同環(huán)境因子的影響（Fang et al.， 2022），在其調(diào)控過程中捕光復(fù)合物Ⅱ葉綠素a/b結(jié)合蛋白（light-harvesting complex Ⅱ chlorophyll a/b binding protein， LHC）發(fā)揮重要作用。LHC由核基因（lhc）編碼，具有迅速將光能傳到PSⅠ和PSⅡ反應(yīng)中心使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的作用，可以促進(jìn)光合作用進(jìn)行（Sapeta et al.， 2023）。lhc基因家族主要包含lhca和lhcb兩個(gè)進(jìn)化類群，前者編碼植物光系統(tǒng)I中的LHCⅠ膜蛋白，捕光截面較大且可同時(shí)捕獲光譜中不同波長的光（Mozzo et al.， 2010），后者編碼植物光系統(tǒng)Ⅱ中的LHCⅡ膜蛋白，可結(jié)合類囊體膜上50%的色素形成葉綠體類囊體中含量最豐富的捕光天線蛋白（王云鶴，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，相比針闊混交林下生長的山東銀蓮花，山頂灌叢中的山東銀蓮花中l(wèi)hca5顯著上調(diào)，與Ganeteg等（2004）研究表明lhca5在強(qiáng)光條件下表達(dá)水平顯著提高的研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)山頂?shù)纳綎|銀蓮花中l(wèi)hcb1、lhcb2和lhcb3顯著下調(diào)，蔣倩（2019）研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下水芹的lhcb基因表達(dá)下調(diào)可阻止葉綠體接收過多光能，使光合作用減弱，Rahele等（2022）的研究也表明lhcb基因表達(dá)量的減少導(dǎo)致番茄葉綠素含量降低以響應(yīng)干旱脅迫。因此，可推測lhcb1、lhcb2和lhcb3的下調(diào)可減少捕光天線蛋白的合成，減弱光合作用，減少水分的消耗，從而降低干旱對山東銀蓮花自身產(chǎn)生的影響。山頂灌叢與針闊混交林下比較，光照強(qiáng)、土壤濕度小是最明顯的不利于山東銀蓮花生存的逆境因素。本研究表明，lhca和lhcb兩類基因的上調(diào)和下調(diào)很巧妙地解決了這一難題，適應(yīng)了山頂灌叢不利的環(huán)境，實(shí)現(xiàn)非生物脅迫響應(yīng)。

類黃酮是植物體內(nèi)廣泛存在的次生代謝物質(zhì)，可吸收280～315 nm波長的紫外光，保護(hù)植物體器官，尤其是光合組織免受或少受輻射傷害（鄒鳳蓮等，2004），在植物生長發(fā)育和熱脅迫等非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮多種生理功能（Chen et al.， 2023；Guo et al.， 2023；Zhuang et al.， 2023）。類黃酮生物合成的前體物質(zhì)來自于苯丙烷代謝，并受一系列關(guān)鍵酶的調(diào)控，如查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃酮醇合成酶（FLS）、黃酮3-羥基化酶（F3H）、黃酮3′-羥化酶（F3′H）、花色素合成酶 （ANS）等（Xiong et al.， 2016；Shen et al.， 2022；戴明潔，2022）。本研究發(fā)現(xiàn)山頂灌叢的山東銀蓮花中編碼相關(guān)酶的基因均較林下顯著上調(diào)，肖韻錚等（2020）研究表明chs和chi基因表達(dá)水平與類黃酮含量呈顯著正相關(guān)，表明山頂灌叢中的山東銀蓮花在生長過程中可以合成較多的類黃酮。山頂灌叢中的強(qiáng)光照，除了可見光，還包括紫外光，同時(shí)伴隨著午間的高溫，長時(shí)間的紫外光照射會(huì)造成植物DNA及其他結(jié)構(gòu)的破壞（Batschauer， 1993），加上高溫的影響，對植物將造成重大傷害甚至死亡。本研究中，山頂灌叢山東銀蓮花大量類黃酮的合成，可吸收多余的紫外光，減少紫外光對植株的破壞，同時(shí)緩解短時(shí)間的高溫，以適應(yīng)不良的生活環(huán)境。

3.2 山東銀蓮花的SSR位點(diǎn)分析與引物開發(fā)

山東銀蓮花的SSR類型相對豐富，從單核苷酸重復(fù)序列到六核苷酸重復(fù)序列不等。研究表明三核苷酸基序中AAG/CTT是主要的基序（Xiang et al.， 2023）， 與本研究中山東銀蓮花SSR位點(diǎn)分析結(jié)果一致，說明EST-SSR在其發(fā)生和進(jìn)化過程中具有高度保守性。EST-SSR分子標(biāo)記源于功能基因表達(dá)序列，具有保守程度高、種間及屬間通用性好等優(yōu)點(diǎn)（婁永峰等，2022）。本研究基于拼接質(zhì)量較高的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成100對引物，其中有68對引物可以實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，有11對引物在不同地域的山東銀蓮花材料中表現(xiàn)出多態(tài)性，具有多態(tài)性的EST-SSR分子標(biāo)記可用于遺傳多樣性分析與分子標(biāo)記輔助育種。因?yàn)閲鴥?nèi)山東銀蓮花材料稀缺，獲取日本四國島的山東銀蓮花材料受限，所以在本研究中未進(jìn)行相關(guān)聚類分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，后續(xù)將通過銀蓮花屬植物對本研究所得的山東銀蓮花EST-SSR多態(tài)性引物的通用性進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)利用挖掘的差異表達(dá)基因設(shè)計(jì)EST-SSR引物用于區(qū)分不同生境的山東銀蓮花居群，為其進(jìn)化研究和種質(zhì)資源保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究對山頂灌叢和針闊混交林下山東銀蓮花的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，表明其通過調(diào)控光合作用途徑和類黃酮生物合成途徑涉及的基因以適應(yīng)異質(zhì)生境， 并首次開發(fā)多態(tài)性較好的EST-SSR分子標(biāo)記，填補(bǔ)山東銀蓮花在此方面的空白，對其保護(hù)與利用具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）