【摘要】 背景 動脈粥樣硬化是世界范圍內(nèi)引起心腦血管疾病最主要的原因，炎癥是目前研究熱點(diǎn)，其中NOD樣受體3（NLRP3）是研究最為深入的炎癥小體。胰高糖素樣肽1（GLP-1）受體激動劑有抗動脈粥樣硬化作用，具體機(jī)制尚不明確。目的 研究利拉魯肽通過拮抗氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。方法 2022-03-25—05-19培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），取HUVEC加空白血清作為對照組，100 μg/mL的ox-LDL干預(yù)HUVEC 48 h作為模型組，100 μg/mL的ox-LDL干預(yù)HUVEC 24 h后分別加入100、200、400 nmol/L利拉魯肽處理24 h作為利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組。CCK-8法計算細(xì)胞增殖率。通過掃描電鏡觀察焦亡細(xì)胞形態(tài)。檢測乳酸脫氫酶（LDH）活力。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測白介素（IL）-1β、IL-18表達(dá)水平。蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、焦亡執(zhí)行蛋白（GSDMD）、N端結(jié)構(gòu)域的焦亡執(zhí)行蛋白（N-GSDMD）表達(dá)水平。結(jié)果 模型組、利拉魯肽低濃度組和利拉魯肽中濃度組細(xì)胞增殖率低于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組細(xì)胞增殖率高于模型組（Plt;0.05）。細(xì)胞掃描電鏡結(jié)果示模型組細(xì)胞焦亡明顯，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組細(xì)胞焦亡情況明顯改善。模型組、利拉魯肽低濃度組LDH活力高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組低于模型組（Plt;0.05）。模型組、利拉魯肽低濃度組IL-1β表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-1β表達(dá)水平低于模型組（Plt;0.05）；模型組IL-18表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-18表達(dá)水平低于模型組（Plt;0.05）。模型組NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組ASC、Caspase-1表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組NLRP3、ASC表達(dá)水平低于模型組，利拉魯肽高濃度組NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)水平低于模型組（Plt;0.05）。結(jié)論 利拉魯肽顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體活化，并且能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡，具有抗動脈粥樣硬化作用。

【關(guān)鍵詞】 動脈粥樣硬化；利拉魯肽；內(nèi)皮細(xì)胞；氧化低密度脂蛋白；NOD樣受體3

【中圖分類號】 R 543.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0531

Mechanism of Liraglutide in Oxidized Low-density Lipoprotein Induced Endothelial Cell Injury Based on NOD-like Receptor 3 Inflammasome Pathway

【Abstract】 Background Atherosclerosis is the primary cause of cardiovascular and cerebrovascular diseases worldwide，and inflammation is a current research focus，with NOD-like receptor 3（NLRP3）being the most intensively studied inflammasome. GLP-1 receptor agonists have shown anti-atherosclerotic effects，but the underlying mechanisms remain unclear. Objective To investigates the mechanism of liraglutide in antagonizing oxidized low-density lipoprotein（ox-LDL） induced endothelial cell injury. Methods From March 25 to May 19，2022，Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were cultured，and HUVEC with blank serum was served as the control group，100 μg/mL ox-LDL treated HUVEC for 48 hours was served as the model group. Liraglutide was added in concentrations of 100 nmol/L，200 nmol/L，and 400 nmol/L to the HUVECs treated with ox-LDL for 24 hours，forming low，medium，and high concentration liraglutide groups，respectively. Cell proliferation rates were calculated using the CCK-8 method. Pyroptotic cell morphology was observed by using scanning electron microscopy. Lactate dehydrogenase（LDH）activity was measured. The expression levels of interleukin （IL）-1β and IL-18 were detected using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Western blot was used to assess the expression levels of NLRP3，apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD（ASC），caspase-1，gasdermin D（GSDMD），and N-terminal GSDMD（N-GSDMD）. Results Cell proliferation rate in the model group and both low and medium concentration liraglutide groups were lower than the control group，while the rate in all liraglutide-treated groups were higher than the model group（Plt;0.05）. Scanning electron microscopy showed obvious pyroptosis in the model group cells，which was significantly reduced in all liraglutide-treated groups. LDH activity in the model group and the low concentration liraglutide group was higher than the control group，while it was lower in all liraglutide-treated groups compared to the model group（Plt;0.05）. IL-1β level in the model group and the low concentration liraglutide group was higher than the control group，whereas IL-1β levels in the medium and high concentration liraglutide groups was lower than the model group（Plt;0.05）. IL-18 level in the model group was higher than the control group，while level in all liraglutide-treated groups was lower than the model group（Plt;0.05）. The expression levels of NLRP3，ASC，Caspase-1，GSDMD，and N-GSDMD in the model group were higher than the control group. In the low concentration liraglutide group，ASC and Caspase-1 levels were higher than the control group，whereas in the medium concentration group，NLRP3 and ASC levels were lower than the model group. In the high concentration group，NLRP3，ASC，and Caspase-1 levels were lower than the model group（Plt;0.05）. Conclusion Liraglutide significantly inhibits NLRP3 inflammasome activation in endothelial cells induced by ox-LDL，and can inhibit endothelial cell pyroptosis，with anti-atherosclerotic effects.

【Key words】 Atherosclerosis；Liraglutide；Endothelial cells；Oxidized low-density lipoprotein；NOD-like receptor 3

動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病率逐年上升，是世界范圍內(nèi)引起心腦血管疾病的最主要原因，給患者、社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。故尋找新的預(yù)防和治療方法，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。AS的發(fā)病機(jī)制涉及免疫炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷及血流動力學(xué)的改變等，是一個極其復(fù)雜的病理過程。脂代謝紊亂和炎癥是目前研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，具體機(jī)制尚不明確，目前針對NOD樣受體3（NLRP3）的研究主要集中在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)，對其他細(xì)胞內(nèi)有關(guān)NLRP3炎癥小體的研究較少。最近的研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生，介導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡，參與了AS的進(jìn)程［1］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以通過抑制血管內(nèi)皮損傷，預(yù)防AS，降低體質(zhì)量，減輕機(jī)體慢性炎癥等方式來減少心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險［2］。近期有研究報道利拉魯肽抑制了游離脂肪酸誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化，減少了白介素（IL）-1β和天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）的分泌，降低了肝臟中接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）的產(chǎn)生［3］。也有研究表明，利拉魯肽通過激活磷酸腺苷來減弱氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚，從而抑制AS［4］?；诖?，本研究團(tuán)隊提出如下假說：利拉魯肽可能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的NLRP3炎癥小體活化和細(xì)胞焦亡，發(fā)揮對AS的抑制作用。本研究基于NLRP3炎性小體通路，進(jìn)一步探討利拉魯肽通過拮抗氧化ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時間

2022-03-25—05-19。

1.2 細(xì)胞與主要試劑

利拉魯肽注射液購自諾和諾德，貨號：8074252；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購自普諾賽，貨號：CL-0122；HUVEC細(xì)胞專用培養(yǎng)基；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（Solarbio，貨號：BC0685）；肌動蛋白（β-actin）抗體（內(nèi)參抗體，兔抗）（Bioss，貨號：bs-0061R）、抗NLRP3抗體（Bioss，貨號：bs-10021R）、抗ASC抗體（Bioss，貨號：bs-34024R）、抗Caspase-1抗體（Bioss，貨號：bs-10743R）；抗焦亡執(zhí)行蛋白（GSDMD）抗體（Abcam，貨號：ab209845）、抗N端結(jié)構(gòu)域的焦亡執(zhí)行蛋白（N-GSDMD）抗體（Abcam，貨號：ab215203）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（solarbio PC0020）、高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液（solarbio R0010）。

1.3 主要儀器設(shè)備

氣套式觸屏CO2恒溫培養(yǎng)箱（CI-191X）；低速臺式離心機(jī)（L600-A）；渦旋儀（GL-88D）；生物安全柜（BSC-1304ⅡA2）；倒置生物顯微鏡系統(tǒng)（ICX41）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-1）；酶標(biāo)儀（K6600-B）；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器；流式細(xì)胞儀（LSRII）；電子顯微鏡（Hitachi Regulus 8100）；Bio小型垂直電泳及轉(zhuǎn)印（1645050）；低溫冷凍離心機(jī)（H2050R）。

1.4 細(xì)胞處理與分組

1.4.1 細(xì)胞處理方法：HUVEC接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置在5% CO2、37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞HUVEC密度，當(dāng)生長至細(xì)胞培養(yǎng)皿面積的90%左右即可傳代。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入EDTA-胰蛋白酶分離細(xì)胞。將分離后的細(xì)胞置入15 mL的離心管中，室溫1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，第3～7代傳代細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥：培養(yǎng)HUVEC，分為對照組、模型組、利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組。取HUVEC加空白血清作為對照組，100 μg/mL的ox-LDL干預(yù)HUVEC 48 h作為模型組，100 μg/mL的ox-LDL干預(yù)HUVEC 24 h后分別加入100、200、400 nmol/L利拉魯肽處理24 h作為利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組。參考高奮等［5］的研究選擇ox-LDL的濃度；參考高海娜［6］描述的方法選擇的利拉魯肽干預(yù)HUVEC濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 CCK-8法計算細(xì)胞增殖率：將各組細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處各組樣本的吸光度（OD）。細(xì)胞增殖率（%）=［（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）］×100%。

1.5.2 通過掃描電鏡觀察焦亡細(xì)胞形態(tài)。

1.5.3 乳酸脫氫酶（LDH）活力：用移液槍吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，12 000×g，4 ℃離心20 min，取上清液。按照檢測試劑盒說明書操作步驟，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處各組樣本的OD，計算各組LDH的活力。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測炎癥因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平：用移液槍吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000×g離心20 min，取上清液。參照試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞外液IL-1β、IL-18表達(dá)水平。

1.5.5 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測NLRP3炎性小體活化相關(guān)蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）與焦亡相關(guān)蛋白（GSDMD、N-GSDMD）蛋白表達(dá)水平：提取細(xì)胞總蛋白，嚴(yán)格按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉，用特異性抗體進(jìn)行免疫雜交檢測，β-actin作為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光劑顯色，最后對目的條帶進(jìn)行掃描密度分析，通過ImageJ 1.0處理分析得出各條帶灰度值，得到目的條帶與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。每組重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組HUVEC細(xì)胞增殖率比較

5組HUVEC細(xì)胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；其中模型組、利拉魯肽低濃度組和利拉魯肽中濃度組細(xì)胞增殖率低于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組細(xì)胞增殖率高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 細(xì)胞掃描電鏡結(jié)果

電鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，各組細(xì)胞存在明顯差異，對照組細(xì)胞形態(tài)較好，未見明顯損傷，整體結(jié)構(gòu)尚可，與對照組比較，模型組細(xì)胞焦亡特征較明顯，細(xì)胞膜鼓包、隆起、破損，出現(xiàn)窗孔，部分細(xì)胞內(nèi)容物釋放至胞外；與模型組比較，利拉魯肽干預(yù)后細(xì)胞焦亡有不同程度的減輕，其中利拉魯肽高濃度組細(xì)胞焦亡程度相對最輕，細(xì)胞膜局部隆起、偽足可見；利拉魯肽中濃度組細(xì)胞焦亡程度相對較輕，膜破損或隆起、窗孔略少、偏小；利拉魯肽低濃度組細(xì)胞焦亡程度較重，細(xì)胞膜大面積隆起、破損。各組細(xì)胞電鏡掃描結(jié)果見圖1。

2.3 5組HUVEC細(xì)胞LDH活力比較

5組HUVEC細(xì)胞LDH活力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；其中模型組、利拉魯肽低濃度組高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

2.4 5組HUVEC細(xì)胞IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較

5組HUVEC細(xì)胞IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），其中模型組、利拉魯肽低濃度組IL-1β表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-1β表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；模型組IL-18表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-18表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表3。

2.5 5組HUVEC細(xì)胞NLRP3炎性小體活化相關(guān)蛋白與焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

5組HUVEC細(xì)胞NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。組間比較結(jié)果顯示，模型組NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組ASC、Caspase-1表達(dá)水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組NLRP3、ASC表達(dá)水平低于模型組，利拉魯肽高濃度組NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表4、圖2。

3 討論

研究表明，先天免疫模式識別受體的作用不僅局限于AS的形成，而且還可以作為一種連接機(jī)制，將其與其他免疫反應(yīng)相聯(lián)系，從而影響到整個動脈硬化的進(jìn)程［7-8］。先天免疫模式識別受體主要包含兩類：一類是胞漿內(nèi)的NOD樣受體（NLRs），另一類則是細(xì)胞膜上的Toll樣受體（TLRs）。NLRP3炎癥小體為細(xì)胞內(nèi)模式識別受體，也是目前研究最為深入、最為廣泛的炎性小體。

NLRP3炎癥小體由受體蛋白NLRP3、ASC和效應(yīng)蛋白半胱氨酸天冬酶原-1（pro-Caspase-1）組成［9］。NLRP3炎癥小體受各種信號刺激，當(dāng)受體蛋白NLRP3被激活后表達(dá)水平顯著提升，招募ASC并互相作用，從而將原本無活性的pro-Caspase-1活化為Caspase-1，以此發(fā)揮效應(yīng)蛋白的功效［10］，活化后的Caspase-1對pro-IL-1等底物進(jìn)行切割，最后促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18的成熟和分泌［11］。在AS發(fā)生、發(fā)展的全過程中，作為先天免疫反應(yīng)中重要介質(zhì)IL-1β和IL-18是炎癥反應(yīng)的總閥門，不僅自身參與炎癥反應(yīng)，其還作為上游因子導(dǎo)致下游其他炎癥因子的級聯(lián)樣釋放［12］。CCK-8實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M細(xì)胞增殖率降低，模型組LDH活力增加，說明造模成功；利拉魯肽可拮抗ox-LDL造成的內(nèi)皮細(xì)胞增殖率降低及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，說明利拉魯肽可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，IL-1β、IL-18含量在利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組中明顯下降，說明一定濃度的利拉魯肽可以抑制炎癥反應(yīng)。

炎性小體可以促進(jìn)Caspase-1活化，進(jìn)一步引起細(xì)胞程序性死亡，也就是細(xì)胞焦亡［13］，其特征包括細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)炎性內(nèi)容物釋出［14］。在經(jīng)典焦亡途徑中不同的NLRs對相應(yīng)的刺激信號產(chǎn)生選擇性應(yīng)答，隨后pro-Caspase-1通過ASC與NLR受體蛋白連接形成高分子復(fù)合物，自身剪切成有酶學(xué)活性的Caspase-1，切割GSDMD，釋放N-GSDMD與細(xì)胞膜脂類相結(jié)合，多聚化并在細(xì)胞膜形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹而焦亡［15-17］。由于細(xì)胞膜孔的形成，IL-1β和IL-18等促炎癥因子釋放至細(xì)胞外，放大炎癥反應(yīng)［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，在AS破裂的斑塊中檢測到大量的Caspase-1，進(jìn)一步證明NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡參與AS的發(fā)展［20］。與對照組相比，炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和N-GSDMD在模型組中表達(dá)量升高，說明炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡參與AS，進(jìn)一步說明造模成功。與模型組相比，NLRP3、ASC和Caspase-1在利拉魯肽高濃度組中表達(dá)量降低，ASC在利拉魯肽中濃度組中表達(dá)量降低，說明高劑量的利拉魯肽可以抑制炎癥小體的表達(dá)。

隨著對AS的研究日益深入，科研工作者開始探索其發(fā)病機(jī)制。過量的脂質(zhì)沉積導(dǎo)致了AS斑塊的形成，而炎癥反應(yīng)會使促炎細(xì)胞因子釋放，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，從而加速AS的發(fā)展［21］。本研究表明利拉魯肽顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體活化，減少內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡，從而發(fā)揮抗動脈硬化作用，有望為臨床AS的治療研究提供新的思路和新靶點(diǎn)。由于經(jīng)費(fèi)的限制，本實(shí)驗(yàn)未設(shè)計動物實(shí)驗(yàn)，以及NLRP3炎癥小體的具體激活機(jī)制，這也是本研究未來研究發(fā)展方向。

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