摘 要 以鏈格孢菌（Alternaria alternata）DT-DYLC為研究對象，以生物量和孢子量（OD600nm）為響應(yīng)值，采用單因素試驗和Plackett-Burman試驗及響應(yīng)面試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明，察氏固體培養(yǎng)基7 d時的菌落直徑為73.1 mm，菌絲質(zhì)量達0.049 g，均顯著高于其他培養(yǎng)基。通過Plackett-Burman試驗篩選出無機鹽為影響孢子量的主要因素。運用響應(yīng)面分析確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖68.853 g/L，NaNO3 11.41 g/L、K2HPO4 5.523 g/L、KCl 1.405 g/L、MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.0375 g/L。在此條件下，孢子量達到3.4 ×107 CFU/mL，是優(yōu)化前的2.72倍。優(yōu)化培養(yǎng)基可用于液體發(fā)酵工廠化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 鏈格孢；孢子量；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面法

雜草是影響農(nóng)作物豐產(chǎn)豐收的重要生物因子之一。其與作物爭光、爭水肥、爭空間，阻礙農(nóng)作物機械化播種及收獲，并在一定程度上傳播病蟲害，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，是導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量減少的重要因素。其中藜（Chenopodium album "L.）為藜科（Chenopodiaceae）藜屬（Chenopodium）1 a生闊葉雜草，是青海省危害農(nóng)田的一種闊葉雜草優(yōu)勢種[1]。在全世界分布有 250 個種和亞種[2]，危害世界不同地區(qū)25種農(nóng)作物[3]。藜干擾目的作物生長，惡化環(huán)境，是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要生物逆境之一[4]。減少雜草數(shù)量可以通過機械除草等綜合管理的方法[5-6]，可是僅使用單一的控制措施不能有效地控制田間雜草的生長，所以效果顯著、使用便捷、便于大面積使用的化學(xué)除草劑[7]更容易被選擇，但其最大的缺點便是對環(huán)境有污染[8-9]。因此，對環(huán)境友好、無污染的微生物除草劑應(yīng)運而生。

微生物除草劑是指一類直接以微生物個體為對象開發(fā)制備的生物農(nóng)藥。而其中的主要成分為雜草生防微生物（主要為真菌），其多以自然界為來源，具有毒性低和長效防治的特點[10-11]。如“魯保一號”是利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）制成的微生物制劑用于防除大豆田里的菟絲子[12]（Cuscuta" sp.），其防效可達70%～95%[13]；1971年，Hasan[14]從意大利維埃斯特引進了一株銹菌，并成功防治了澳大利亞當(dāng)?shù)胤簽E的澳大利亞粉孢苣；Stierle等[15]發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌（Alternaria alternate）產(chǎn)生的環(huán)肽毒素對黑矢車菊（Centaurea maculosa）有極強的毒性；顧瓊楠等[16]在發(fā)病牛筋草上分離得到一株牛筋草炭疽菌（Colletotrichum eleusines）NJC-16，對牛筋草鮮重防效達到了73%；劉璐等[17]從野外感病稗草上分離得到的彎孢屬新種（Curvularia" sp.）處理稗草的發(fā)病指數(shù)最高可達62.53。

具有生防活性的微生物自然生長條件下的生防能力不能夠達到生防要求，故需要人工培養(yǎng)進行生防能力的優(yōu)化，其中優(yōu)化生長培養(yǎng)基是一種有效提高生防菌株能力的方式。楊景艷[18]對殺線蟲活性菌株KM2501-1培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)的菌株的殺線蟲能力提高了 "61.61%；彭上[19]對刺糖多孢菌培養(yǎng)基進行了成分和發(fā)酵條件優(yōu)化，所得多殺菌素較對照組提高了60.74%；黎秋雨等[20]對具有枸杞木虱生防效果的雷斯青霉進行了發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，優(yōu)化后的產(chǎn)孢量提高了9.84倍，對枸杞木虱三齡若蟲同期防效高了25.56%；可見，優(yōu)化生防微生物生長培養(yǎng)基有助于優(yōu)化其生防能力。

本研究團隊前期從青海省西寧市大通縣達隆村農(nóng)田感病大葉藜葉片中分離到一株鏈格孢菌（Alternaria alternata）DT-DYLC，通過研究發(fā)現(xiàn)其對藜具有高致病活性，對小麥、青稞、玉米、番茄和黃瓜安全，具有在以藜為優(yōu)勢雜草的禾本科、茄科和葫蘆科田中應(yīng)用潛力[21]。為了篩選低成本、廉價的培養(yǎng)基配方，獲得高濃度的鏈格孢菌的孢子量，本研究以孢子量（OD600nm）為響應(yīng)值，采用單因素試驗及響應(yīng)面試驗對Alternaria alternata DT-DYLC的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，得出其最優(yōu)培養(yǎng)基配方，以期為該菌株規(guī)?；a(chǎn)和農(nóng)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

鏈格孢菌（Alternaria alternata） DT-DYLC，從青海省西寧市大通縣達隆村農(nóng)田中采集到自然感病的大葉藜（Chenopodium hybridum）植株葉片篩選獲得。

1.2 試驗方法

1.2.1 固體培養(yǎng)基的篩選

將于PDA培養(yǎng)基保存并活化好的DT-DYLC菌株接種于7種培養(yǎng)基平板中央（表1），于 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用游標卡尺以十字交叉法測量菌落直徑，并拍照記錄菌落形態(tài)后，將菌絲刮下放到50 ℃烘箱中烘至恒量后于分析天平上準確稱量并記錄數(shù)據(jù)。每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化 以“1.2.1”篩選出的最佳固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對配方各成分進行單因素試驗。在接種并培養(yǎng)活化的平板中打直徑為8 mm的菌餅接種于裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，于搖床培養(yǎng)7 d（25 ℃、180" "r/min），用紫外分光光度計測定培養(yǎng)液最大吸收波長λ=600 nm的OD值，重復(fù)3次。培養(yǎng)基各成分及水平選擇如表2所示。

1.2.3 成分及配比優(yōu)化 根據(jù)中心組合設(shè)計原理進行成分配比優(yōu)化，以單因素結(jié)果為中心點，菌株DT-DYLC的OD（λ=600 nm）值為響應(yīng)值（Y），以碳、氮源及無機鹽含量設(shè)計3因素5水平的響應(yīng)面（RSM）試驗，其因素及水平如表3 "所示。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS Statistics 27、 "Design Expert 13和Excel對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法比較差異顯 "著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)基的篩選

綜合分析菌落直徑和菌絲干質(zhì)量，以水瓊脂培養(yǎng)基作為對照，平板置于25 ℃培養(yǎng)箱7 d后。察氏培養(yǎng)基上的菌落直徑最大，為73.1 mm，其次為PDA和PSA培養(yǎng)基，菌落直徑分別達 "68.54 mm和67.74 mm；菌絲干質(zhì)量，在PDA和察氏培養(yǎng)基上分別達0.052 g和0.049 g（圖1）。結(jié)合二者評價，在察氏培養(yǎng)基中菌落直徑和菌絲干質(zhì)量均顯著高于其他培養(yǎng)基，故選定察氏培養(yǎng)基為鏈格孢菌DT-DYLC菌株菌絲生長的最適培養(yǎng)基。由圖2可見，DT-DYLC菌株菌落在察氏、PDA和PSA培養(yǎng)基長勢最優(yōu)。

2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 蔗糖含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 菌株DT-DYLC液體培養(yǎng)基的OD值在蔗糖含量30～50 g/L的區(qū)間內(nèi)上升， "50～60 g/L下降，60～70 g/L又突然上升，并在70 g/L達到最大值之后，隨著蔗糖含量增加，培養(yǎng)基的OD值迅速下降（圖3-A），故選定70 g/L為菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳蔗糖 "含量。

2.2.2 硝酸鈉含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著硝酸鈉含量增加，菌株DT-DYLC的OD值在3～6 g/L的區(qū)間內(nèi)迅速上升，6～12 g/L間上升平緩，在12 g/L達到最大值，之后隨著硝酸鈉含量上升，OD值迅速下降（圖3-B），故選定12 g/L為菌株DT-DYLC培養(yǎng)基的最佳硝酸鈉含量。

2.2.3 MgSO4·7H2O含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著MgSO4·7H2O含量的增加，菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的OD值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在2 g/L時達到最大值，之后在MgSO4·7H2O含量2.0～2.5 g/L時急劇下降，2.5～3.0 g/L時略微上升，后又隨著MgSO4·7H2O含量增加下降（圖3-C）。故選定2 g/L為菌株DT-DYLC培養(yǎng)基的最佳MgSO4·7H2O含量。

2.2.4 KCl含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著KCl的含量增加，DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的OD值呈升高-降低-升高-降低的形式，OD值在0.5～1.5 g/L內(nèi)迅速上升，在1.5 g/L時達到最大值。后在1.5～2.0" "g/L內(nèi)下降，在2.0～3.0 g/L區(qū)間內(nèi)上升。在 "3.0～ "3.5 g/L區(qū)間內(nèi)下降（圖3-D）。故選定1.5 g/L為菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳KCl含量。

2.2.5 K2HPO4含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著K2HPO4的含量增加，DT-DYLC的OD值先升高后降低，在1～2 g/L內(nèi)迅速升高，2～4 g/L開始略微下降，4～6 g/L內(nèi)上升，最終在6 g/L達到最大值。6～7 g/L內(nèi)下降（圖3-E）。故選定6 g/L為菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳K2HPO4含量。

2.2.6 FeSO4含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著FeSO4含量的增加，DT-DYLC的OD值總體呈先升高后降低的趨勢，在0.01～0.04 g/L區(qū)間內(nèi)DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值呈上升趨勢。并在0.04 g/L達到最大值之后開始下降（圖3-F）。故選定0.04 g/L為菌株DT-DYLC培養(yǎng)基的最佳FeSO4含量。

2.3 成分及配比優(yōu)化

根據(jù)“2.2”得出的結(jié)果對鏈格孢菌 "DT-DYLC菌株的液體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，利用Design expert中心組合試驗設(shè)計3因素5水平試驗，每個處理3個重復(fù)，結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示，如表4所示。

以DT-DYLC發(fā)酵液的OD值（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合的試驗結(jié)果（表4）進行分析得到OD值與蔗糖（A）、NaNO3（B）與無機鹽（C）的二次多項回歸方程：

Y=0.690 4-0.013 7A+0.023 4B-0.050 7C-0.039 4AB+0.045 6AC-0.031 7BC- "0.014 44A2-0.083 7B2-0.167 0C2

通過方差分析上述回歸模型可知（表5），回歸模型的Plt;0.000 1，顯著性檢驗極顯著，失擬項的P值0.341gt;0.05，顯著性檢驗不顯著，說明未知因素對試驗的干擾很小，模型穩(wěn)定，回歸方程的決定系數(shù)為99.12%，證明該方程與實際情況較符合，該模型能夠模擬菌株DT-DYLC的OD值與碳源、氮源和無機鹽之間的關(guān)系。

模型數(shù)據(jù)顯示，各因子的影響主次順序為：C gt;AC gt; AB gt; BC gt; C2gt; B gt; A2gt;Agt; B2。一次項B、C、交互項AB、AC、BC及二次項 A2、C2影響顯著。

根據(jù)試驗因素（蔗糖、硝酸鈉、無機鹽）之間的交互效應(yīng)三維立體響應(yīng)面和等高線圖（圖4），確定一個因素后觀察另外兩個因素對DT-DYLC的OD值影響。綜上，三者交互作用響應(yīng)面皆為開口向下的凸形曲面，且交互效應(yīng)的等高線形狀為橢圓形，說明兩兩之間的交互作用效果較顯著。

利用回歸方程計算得到菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的培養(yǎng)基條件為：蔗糖 68.853 g/L，硝酸鈉 11.41 g/L，無機鹽8.94 g/L（其中K2HPO4 5.523 g/L、KCl 1.405 g/L、MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.0375 g/L）。

3 討論與結(jié)論

微生物農(nóng)藥具有綠色環(huán)保、低毒無害、高效可控、抗性低、安全易存儲等優(yōu)點，是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向之一。而篩選具有抑草作用的微生物是微生物除草劑研究的重要途徑之一[22-24]，孢子是微生物生長過程中的一個重要間體[25]，孢子數(shù)量決定著生防菌劑的生防效用。故產(chǎn)孢率也是評價生防菌制劑的一個重要指標[26]。但在自然屆篩選到的具有生防能力的菌株，其致病力和產(chǎn)孢量往往不能滿足微生物農(nóng)藥的工業(yè)化生產(chǎn)，所以需要對自然篩選的菌株進行培養(yǎng)基碳源、氮源及無機鹽的優(yōu)化，以優(yōu)化菌株產(chǎn)孢能力。同時，優(yōu)化培養(yǎng)基也是提高經(jīng)濟效益的重要途徑[27]。通過優(yōu)化培養(yǎng)基提高孢子產(chǎn)量可為真菌制劑制備及其工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)保障[28]。

本研究通過先對固體培養(yǎng)基進行篩選，選出最適固體培養(yǎng)基，后進行單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化，旨在使鏈格孢DT-DYLC達到最適生長條件后，增加其孢子和抑草物質(zhì)的產(chǎn)量。李祥等[29]研究得出察氏培養(yǎng)基為除草鏈格孢HY-02的最佳培養(yǎng)基，與本研究結(jié)果相同；通過單因素實驗確定了培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖，這與杜艷麗等[30]研究結(jié)果一致；本研究中所采用的無機鹽對鏈格孢DT-DYLC培養(yǎng)基的OD值影響效果較明顯，這與楊瑩等[25]利用中心組合優(yōu)化出芽短梗霉菌PA-2菌株所用的無機鹽效果相似，均能優(yōu)化促進菌株生長產(chǎn)孢；王雪妍等[31]對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HP-24進行發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵液中的活菌數(shù)可達到 1.17×109 CFU/mL；郭建軍等[32]通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基使多粘類芽孢桿菌LY1發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)量達到了 "6.825×109 CFU/mL；戴寶等[33]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus） BsR05的芽孢產(chǎn)量提高了1.27倍；證明通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基可以促進產(chǎn)孢。

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，確定鏈格孢菌DT-DYLC的最佳固體培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢的最佳條件為：蔗糖 68.853 g/L、NaNO3 11.41 g/L、無機鹽 8.94 g/L（其中K2HPO45.523 g/L、KCl 1.405 g/L、 "MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.037 5" "g/L），在此條件下，孢子量達到3.4×107" "CFU/mL，是優(yōu)化前的2.72倍。優(yōu)化后的發(fā)酵條件，不僅能有效提高菌液中的孢子量，而且可進一步降低培養(yǎng)成本，為鏈格孢菌DT-DYLC生防菌劑的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。本研究目前只優(yōu)化了該菌株液體發(fā)酵的配方，后期還需進行發(fā)酵條件探索，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

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Liquid Medium Optimization of Alternaria alternata DT-DYLC with High

Pathogenic Activity" against Chenopodium album

Abstract Using Alternaria alternata DT-DYLC as the research object， and with mycelium biomass and spore number （OD600nm） as the response value， the fermentation medium was optimized by single factor test， Plackett-Burman test， and response surface test. The results showed that after 7 days of cultivation at 25 °C on Chaw’s medium， the colony diameter and mycelium mass of DT-DYLC reached 73.1 mm， and the mycelial mass was 0.049 g， both significantly higher than other tested media. The main factors affecting the spore number of A.alternata DT-DYLC was inorganic salt. The optimal fermentation medium for spore production was determined by response surface methodology consisted of sucrose 68.853 g/L， NaNO3 11.41 g/L， K2HPO4 5.523 g/L， KCl" 1.405 g/L， MgSO4·7H2O" "1.874 g/L， FeSO4 0.037 5 g/L. Under these conditions， the spore number in the fermentation broth of A.alternata DT-DYLC reached 3.4×107 CFU/mL， which was 2.72 times that of the unoptimized condition. The optimized medium can be used for the industrial-scale liquid fermentation of" A.alternata" DT-DYLC.

Key words Alternaria alternata; Spore yield; Medium optimization;Response surface methods