王鵬+郭麗+周鳳超

摘要：以玉米皮為原料，分析液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲時間等單因素對類黃酮得率的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取類黃酮物質(zhì)工藝，優(yōu)化玉米皮制備天然抗氧化劑的提取工藝；通過測定所提取類黃酮物質(zhì)的清除自由基能力，評價玉米皮類黃酮物質(zhì)的抗氧化活性。結(jié)果表明：玉米皮類黃酮物質(zhì)提取的最佳工藝條件為料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度33 ℃、超聲時間57 min，類黃酮物質(zhì)的得率為12.96 mg/g；在優(yōu)化條件下，類黃酮物質(zhì)得率的試驗驗證值與預(yù)測值誤差在±1.0%之內(nèi)。在上述優(yōu)化工藝前提下，發(fā)現(xiàn)玉米皮類黃酮物質(zhì)對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均具有較強(qiáng)清除作用，其半數(shù)抑制濃度分別為8.436、0.825、0.621 mg/mL。

關(guān)鍵詞：玉米皮；類黃酮；響應(yīng)面法；超聲波；抗氧化

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0337-04

玉米是禾本科蜀黍?qū)僖荒晟荼局参?，我國玉米產(chǎn)量位居世界第2位，其中玉米皮作為玉米深加工的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量可達(dá)到2 000萬t。玉米皮的綜合利用，多以飼料為主。近年來，玉米皮的開發(fā)利用集中在功能性物質(zhì)的提取方面，有研究者從玉米皮中提取了多肽、多糖、黃色素等功能性物質(zhì)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米等禾本科植物細(xì)胞壁中含有一定量的阿魏酸、對香豆酸、芥子酸等類黃酮物質(zhì)[4]，在細(xì)胞壁中與多糖和木質(zhì)素進(jìn)行交聯(lián)。這些類黃酮物質(zhì)具有許多生理功能，如清除自由基、抗紫外線輻射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突變、防癌、增強(qiáng)精子活力以及調(diào)節(jié)人體免疫功能等[5-7]。超聲波提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物類原料類黃酮物質(zhì)的提取工藝中，該技術(shù)利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，通過破壞細(xì)胞組織、增大提取溶劑分子的運(yùn)動速度和穿透力以獲得生物有效成分，具有提取時間短、效率高的優(yōu)勢[8-10]。本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取玉米皮類黃酮物質(zhì)工藝，并進(jìn)一步研究玉米皮類黃酮物質(zhì)的抗氧化活性，以期為開發(fā)利用類黃酮等天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮：購自黑龍江省綏化市望奎縣，分離、粉碎成粉后過20目篩。

試劑：1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、蕓香苷、三羥基氨基甲烷（Tris）均購自美國Sigma-Aldrich公司，維生素C、鄰二氮菲、FeSO4、鄰苯三酚、無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器

KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；TU1901紫外-可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)，購自天津市泰斯特儀器有限公司；XT120A電子天平，購自瑞士普利賽斯有限公司；GL-16G-Ⅱ冷凍離心機(jī)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米皮類黃酮物質(zhì)的提取 準(zhǔn)確稱取2.0 g玉米皮粉，加入乙醇溶液，放入功率180 W、45 kHz超聲波清洗儀中，在不同溫度和時間下超聲處理提取類黃酮，以3 000 r/min離心10 min，上清液為玉米皮類黃酮提取液。

1.3.2 類黃酮物質(zhì)含量的測定 采用Chun等的方法[11]測定玉米皮類黃酮物質(zhì)含量。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液體積分別為0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL比色管中。加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，放置6 min，再加入0.4 mL 10%氯化鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后放置15 min。使用紫外-可見分光光度計在510 nm測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.029 900x-0.013 623（r2=0.990 4）。取一定稀釋倍數(shù)的樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中類黃酮含量。

1.3.3 玉米皮類黃酮物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗 研究料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲時間對玉米皮類黃酮物質(zhì)提取得率的影響。料液比分別取1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g ∶mL）；乙醇體積分?jǐn)?shù)分別取20%、30%、40%、50%、60%、70%；提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃；超聲時間分別為0、30、60、90、120 min。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以X1料液比、X2乙醇體積分?jǐn)?shù)、X3提取溫度、X4超聲時間為自變量，以玉米皮類黃酮物質(zhì)提取得率Y為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。因素水平選取見表1。

1.3.4 抗氧化特性分析 響應(yīng)面試驗的結(jié)果獲得了最佳提取條件，在此基礎(chǔ)上制備玉米皮類黃酮物質(zhì)提取液，以維生素C為對照，分析玉米皮類黃酮物質(zhì)抗氧化特性。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基清除率的測定參照Yamaguchi等的方法[12]進(jìn)行。精確稱取 4 mg DPPH自由基，用無水乙醇溶解并定容于250 mL棕色容量瓶中，配制成1×10-4 mol/L的DPPH自由基溶液，于0～4 ℃ 避光保存，備用。分別取2 mL待測提取溶液與2 mL DPPH溶液均勻混合，在黑暗中放置30、60 min后，于517 nm波長處測定2次吸光度，空白處理以無水乙醇取代樣品，2次重復(fù)。DPPH自由基清除率可表示為：

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米皮類黃酮物質(zhì)提取單因素試驗

以乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度40 ℃、超聲時間60 min為提取條件，研究料液比對玉米皮類黃酮物質(zhì)得率的影響（圖1-A）。隨著料液比的變大，玉米皮類黃酮得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在料液比為1 g ∶25 mL時得率最大，類黃酮物質(zhì)從原料中溶出最多。從節(jié)約溶劑角度考慮，選擇料液比的研究范圍為 1 g ∶（20～30） mL。

以料液比1 g ∶25 mL、提取溫度40 ℃、超聲時間60 min為提取條件，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對玉米皮類黃酮物質(zhì)得率的影響（圖1-B）。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，玉米皮類黃酮物質(zhì)得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時得率最大，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，因而對類黃酮物質(zhì)的溶解能力也有所不同[10]。

以料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時間 60 min 為提取條件，研究溫度對玉米皮類黃酮物質(zhì)得率的影響（圖1-C）。隨溫度的升高，玉米皮類黃酮物質(zhì)得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在30 ℃時，玉米皮類黃酮物質(zhì)得率最高。溫度大于30 ℃類黃酮物質(zhì)得率降低，可能是乙醇揮發(fā)使液料比發(fā)生變化影響得率，也可能是溫度高使類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞影響類黃酮的得率[13]。

以料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度 30 ℃ 為提取條件，研究超聲時間對玉米皮類黃酮物質(zhì)得率的影響（圖1-D）。提取60 min時類黃酮物質(zhì)得率達(dá)到最大，原因是玉米皮細(xì)胞破碎，提取劑充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，加速了類黃酮物質(zhì)的溶出。超聲提取60 min后，由于長時間超聲振動導(dǎo)致類黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞而分解，類黃酮物質(zhì)得率呈現(xiàn)下降趨勢[14-15]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化玉米皮類黃酮物質(zhì)提取工藝

在數(shù)學(xué)模型中固定2個因素，分析其他2個因素交互作用對類黃酮物質(zhì)得率的影響，結(jié)果見圖2。

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對回歸模型進(jìn)行優(yōu)化，對響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取玉米皮類黃酮物質(zhì)工藝結(jié)果擬合分析得到最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶25 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度33 ℃、超聲時間57 min，在此條件下對類黃酮得率的預(yù)測值為12.96 mg/g。在優(yōu)化條件下，驗證試驗中玉米皮類黃酮物質(zhì)得率為12.84 mg/g，驗證值與預(yù)測值誤差在±1.0%之內(nèi)，說明試驗結(jié)果符合模型，優(yōu)化的提取工藝參數(shù)是可靠的，此響應(yīng)面模型具有可行性。

2.3 玉米皮類黃酮物質(zhì)抗氧化性研究

對優(yōu)化條件下得到的玉米皮類黃酮物質(zhì)進(jìn)行抗氧化性研究，以維生素C為對照，結(jié)果如表4所示，類黃酮物質(zhì)對 DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力。玉米皮類黃酮物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力明顯高于維生素C，對超氧陰離子自由基的清除能力與坑壞血酸相近，對羥自由基的清除能力低于維生素C。玉米皮類黃酮物質(zhì)清除自由基能力的差異可能與其純度有關(guān)。

3 結(jié)論

玉米皮類黃酮物質(zhì)超聲波提取工藝最佳條件為料液比 1 g ∶25 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度33 ℃、超聲時間57 min，在此條件下類黃酮物質(zhì)得率達(dá)到12.96 mg/g。響應(yīng)面優(yōu)化模型能夠有效地提高玉米皮中類黃酮物質(zhì)得率，在今后的研究中可再結(jié)合酶法進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期得到更高的類黃酮物質(zhì)得率。

玉米皮類黃酮提取物對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均具有較強(qiáng)清除作用，半數(shù)抑制濃度分別為8.436、0.825、0.621 mg/mL。本研究結(jié)果對天然抗氧化劑的開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。

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