摘 要 為獲得對梨火疫病菌（Erwinia amylovora）抑菌活性高、防病效果好的拮抗菌組合，以實驗室前期從香梨酵素液中分離初篩出的E. amylovora拮抗細菌菌株為材料，采用對峙培養(yǎng)法檢測菌株之間的親和性，打孔-抑菌圈法測定復(fù)配組合菌株的抑菌活性。對篩選出相容性良好，對E. amylovora抑菌作用強的拮抗細菌組合通過噴施香梨離體花序和盆栽杜梨苗評價其對梨火疫病的防病效果。結(jié)果顯示：篩選出相容性良好的3個拮抗細菌組合FX1-FJ20、FX74-FN12和FX70-FX43，其復(fù)配比例為1∶1的組合菌體發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液的抑菌率均達到83%以上，明顯高于單一菌株。3個拮抗細菌組合菌體發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液對香梨花腐的3～7 d的平均預(yù)防型防效分別為56.26%～73.16%和72.02～82.66%；對杜梨苗的7～15 d的預(yù)防型防效分別為67.38%～77.73%和71.78%～80.11%，治療型防效分別為64.53%～75.01%和 "69.09%～79.03%。組合菌的防效均較單個菌株提高，組合菌除菌發(fā)酵液的防效優(yōu)于組合菌菌體發(fā)酵液，預(yù)防型防效優(yōu)于治療型防效。綜合防效試驗結(jié)果可見，拮抗菌組合FX74-FN12的防效最佳，其菌體發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液對香梨花腐3～7 d的預(yù)防型防效分別為73.16%、82.66%，比單菌株的平均防效分別增加12.90%和22.40%；對杜梨苗的7～15 d的平均預(yù)防型和治療型防效分別達到75.00%和79.00%以上，比單菌株的平均防效分別增加15.12%和11.02%，對梨火疫病具有較好的生防潛力。

關(guān)鍵詞 梨火疫病菌；拮抗菌組合；相容性；抑菌活性；防效

由解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的梨火疫病是新入侵我國、危害薔薇科仁果類果樹最具毀滅性的細菌病害，被列為國際重大檢疫性有害生物和我國一類農(nóng)作物病害[1]。該病害現(xiàn)已在新疆與甘肅65個縣、市（區(qū)）發(fā)生危害[2-3]，對全國林果業(yè)生產(chǎn)帶來巨大威脅和風(fēng)險。

化學(xué)藥劑防治是梨火疫病防治的重要手段。農(nóng)用鏈霉素曾經(jīng)是梨火疫病防治的最佳藥劑，但它的普遍使用所導(dǎo)致的病原菌抗藥性菌系的產(chǎn)生及對人類健康安全和環(huán)境安全的隱患，已被禁止和限制大田施用[4]。目前，我國針對梨火疫病的專用登記藥劑的種類較為有限[5]，研發(fā)出新型的高效殺菌劑，采取有效措施阻斷梨火疫病的進一步傳播擴散，是保障林果安全生產(chǎn)的重大需求。近年來國內(nèi)外研究者利用拮抗微生物防治梨火疫病方面開展了一些工作，取得較好進展，成為病害防治新的發(fā)展方向。有報道從果樹內(nèi)生菌、附生菌、土壤微生物中篩選拮抗菌，從植物提取物中提取抗菌成分用于梨火疫病的生物防治，涉及的生防微生物種類有熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[6]、草生歐文氏菌（E. herbicola）[7]、解淀粉歐文氏菌無毒菌系[8]、酵母菌和E. amylovora的特異性噬菌體[9]等。國內(nèi)在梨火疫病的生物防治所開展的研究工作尚處于起步階段[10-11]，目前尚無登記的梨火疫病專用生防菌劑。

有研究發(fā)現(xiàn)，在植物病害生防中采用單一菌株，在田間應(yīng)用存在菌株定殖性能不佳、適應(yīng)力不強，易受環(huán)境條件的影響，防效不穩(wěn)定等問題；而將親和性良好的生防菌株二元或多元復(fù)配使用，可以產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，能提高生防微生物防治的廣度及防效的穩(wěn)定性[12]。本研究以分離、篩選出的梨火疫病菌拮抗菌株為材料，測定拮抗細菌菌株之間親和性，篩選出菌株間親和力好、抑菌活性高的組合，明確其對梨火疫病的防治效果，為創(chuàng)制和應(yīng)用優(yōu)良的梨火疫病生防菌劑，安全防控病害、保障產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原菌 梨火疫病菌：E. amylovora 001菌株，庫爾勒香梨分離物，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室分離、鑒定并保存，致病力測定為強致病力的菌株。

1.1.2 供試拮抗菌菌株 以實驗室前期從香梨酵素液分離細菌中通過平板對峙試驗初篩出的對E. amylovora具有明顯的抑菌圈，或在與病原菌對峙培養(yǎng)平板上表現(xiàn)出競爭力強、生長速度快，能迅速覆蓋病原菌菌落的6個菌株作為待選組合生防潛力菌株，分別是FX1（Bacillus" velezensis）、FJ20（B." sp.）、FX74（B.amyloliquefaciens）、FN12（B.velezensis）、FX70（B. sp.）、FX43（B." sp.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 ""g/L、瓊脂粉18.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、氯化鈉5.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、蒸餾水 "1 000.00 mL。NB培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 ""g/L、蔗糖5.00 g/L、氯化鈉5.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、蒸餾水 "1 000.00 mL。

1.2 拮抗菌株間的親和性測定

1.2.1 E.amylovora菌液的制備 在NA培養(yǎng)基中活化E.amylovora 001菌株，挑取單菌落接入NB培養(yǎng)液中，在28 ℃、150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24～48 h至菌液OD600nm＝0.8～1.0，8 000" "r/min離心3 min，收集菌體用無菌水稀釋至濃度約為1×107 cfu/mL的菌懸液。

1.2.2 拮抗細菌單菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液的制備 將拮抗菌株在NA平板上活化后，用接種環(huán)移取一環(huán)接入裝有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180" "r/min的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子液。在NB培養(yǎng)液中按1%接種量接種拮抗細菌種子液，在28 ℃、180" "r/min的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600nm為 "0.8～1.0，稀釋至108 cfu/mL，備用。將發(fā)酵液在 "4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min去除菌體，上清液用微孔濾膜（d=0.22 μm）過濾除菌，得到除菌發(fā)酵液。

1.2.3 拮抗細菌單菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液對梨火疫病菌的抑菌活性測定 采用打孔—抑菌圈法測定拮抗菌的抑菌活性。將100 μL的梨火疫病菌（E. amylovora）菌液涂布于NA培養(yǎng)基上，用滅菌打孔器在涂菌培養(yǎng)基平板均勻打3個孔，分別在每孔中加入拮抗菌發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液200 μL，以等量的無菌培養(yǎng)液為對照，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后采用十字交叉法測定抑菌圈直徑大小，計算抑菌率[13]。

抑菌率=[（處理組抑菌圈直徑-對照組抑菌圈直徑）/處理組抑菌圈直徑]×100%

1.2.4 拮抗細菌不同菌株之間親和性的測定 采用對峙培養(yǎng)法測定拮抗細菌不同菌株之間親和性。取一個拮抗細菌菌株的新鮮發(fā)酵液100 μL均勻涂布于NA培養(yǎng)基上作為被測菌株，將無菌濾紙片（d=6 mm）放至在涂菌平板上，每皿2片，每個濾紙片滴加5 μL的另一個待測拮抗細菌的發(fā)酵液，以加入5 μL NB培養(yǎng)液的處理作為對照，各菌株均作為測試菌株和被測菌株交叉測試，每個處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察兩菌株間是否有抑菌圈，篩選出不產(chǎn)生抑菌圈，親和性良好的菌株組合。

1.3 拮抗細菌菌株組合抑菌活性的測定

1.3.1 拮抗細菌組合菌體發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的制備 在滅菌NB培養(yǎng)液中按1∶1比例加入拮抗細菌混合種子液，在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測定OD600nm約為0.8～1.0，獲得拮抗細菌組合菌體發(fā)酵液。將組合菌體發(fā)酵液在 "4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min去除菌體，上清液用微孔濾膜（d=0.22 μm）過濾除菌，得到組合除菌發(fā)酵液，備用。

1.3.2 拮抗菌組合菌體發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液對梨火疫病菌的抑菌活性測定 方法與“1.2.3”中單一拮抗菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液抑菌活性測定方法相似，在涂布E. amylovora菌液的培養(yǎng)基平板的打孔中（d=6 mm）加入200 μL的拮抗菌組合菌體發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液，觀察產(chǎn)生的抑菌圈并測定其直徑。

1.4 拮抗菌組合對梨火疫病的防效測定

1.4.1 拮抗細菌組合菌體發(fā)酵液及組合除菌發(fā)酵液接種液的制備 按照“1.3.1”制備拮抗細菌組合菌體發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液接種液。

1.4.2 香梨離體花序防效測定

在新疆庫爾勒市香梨園健康梨樹上采集初花期花枝插入3%蔗糖溶液中，待花苞全部綻放時用手持壓力噴霧器將待測拮抗菌單菌發(fā)酵液、單菌除菌發(fā)酵液，組合菌發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液噴霧接種至花序全部潤濕，每個處理接種50朵，重復(fù)3次；以噴施農(nóng)用鏈霉素（華北制藥廠生產(chǎn)，有效成分72%）4 000倍液為對照，同時設(shè)置無菌水代替拮抗菌發(fā)酵液（除菌發(fā)酵液）的對照，在25 ℃、75%空氣濕度的人工氣候箱中培養(yǎng)24 h后噴霧接種梨火疫病菌菌液。將接種后的花序置于人工氣候箱中25 ℃、75%空氣濕度繼續(xù)培養(yǎng)，3 d、4 d和5 d后定時觀察記錄發(fā)病情況，統(tǒng)計花腐率并計算防效。試驗結(jié)束后將發(fā)病植株材料干熱滅菌后銷毀。

花腐率=病花數(shù)/總花數(shù)×100%

花腐防效=[（噴施無菌水對照組花腐率-處理組花腐率）/噴施無菌水對照組花腐率]×100%

1.4.3 盆栽杜梨苗防效測定 在庫爾勒市巴州農(nóng)科所日光試驗溫室開展試驗，以2 a生盆栽杜梨盆栽苗10～25 cm的新生幼嫩枝條為接種材料。

預(yù)防型防效試驗：用手持壓力式噴霧器將拮抗菌發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液噴霧接種盆栽杜梨苗，噴霧至杜梨苗全部濕潤，每個處理噴施10～15個杜梨枝條，重復(fù)3次。同時設(shè)噴施農(nóng)用鏈霉素（72% WP，華北制藥廠）4 000倍液為對照，以無菌水噴霧為空白對照。接種后的杜梨苗放入搭建好的覆蓋塑料膜的保濕棚中， "48 h后再噴霧接種梨火疫病菌菌液，繼續(xù)在25 ℃～30 ℃、相對濕度75%以上，自然光照下的保濕棚中培養(yǎng)。待發(fā)病后掀開塑料膜，每天觀察發(fā)病情況，記錄發(fā)病枝條數(shù)，計算病情指數(shù)，統(tǒng)計防效。

治療型防效試驗：與預(yù)防型試驗接種順序相反，即先在杜梨苗上噴施接種病原菌液48 h后，再噴施拮抗菌發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液，培養(yǎng)條件及防效調(diào)查方法等均與預(yù)防性試驗一致。

盆栽杜梨苗梨火疫病的病情分級標(biāo)準(zhǔn)[7]： "0級，枝條無病斑；Ⅰ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的1/3；Ⅲ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的1/3～2/3；Ⅴ級，枝條病斑長度占接種枝條的2/3。依據(jù)病情指數(shù)計算試驗各處理的防效。

發(fā)病率=發(fā)病枝條數(shù)/接種總枝條數(shù)×100%

病情指數(shù)=[∑（各級發(fā)病枝條數(shù)×病級代表值）/（接種總枝條數(shù)×最高級值）]×100

枝枯防效=[（噴施無菌水對照組病情指數(shù)-噴施拮抗菌處理組病情指數(shù)）/噴施無菌水對照組病情指數(shù)]×100%

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel整理試驗數(shù)據(jù)，并采用SPSS統(tǒng)計分析軟件和Duncan氏新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌單一菌株對梨火疫病菌的抑制作用

供試拮抗細菌單一菌株對梨火疫病原菌的抑菌作用測定結(jié)果如表1所示，6個拮抗細菌菌株對梨火疫病菌具有較強的抑菌活性，發(fā)酵液的抑菌圈大小為27.35 mm±0.85 mm～33.04 mm±" 0.39 mm，抑菌率均達到78%以上；除菌發(fā)酵液的抑菌圈大小為29.05 mm±0.76 mm～ "33.44 mm±0.84 mm，抑菌率達79%以上，其中FX1、FJ20、FX70和FX43還具有生長速度快、競爭能力強的優(yōu)勢，在與梨火疫病菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基平板上能在24 h迅速覆蓋病原菌菌落。

2.2 不同拮抗細菌菌株間的相容性

分別將不同拮抗菌株進行交叉試驗，測定菌株之間的親和性。結(jié)果顯示（圖1），菌株FX1與FJ20、FX74與FN12、FX70與FX43在平板上分別作為測試菌株和被測菌株共培養(yǎng)時，菌株之間均不產(chǎn)生抑菌圈，表明菌株間相容性好；而其他組合菌株（FX1與FN12、FX1與FX70、FX74與FX1、FN12與FX1、FX74與FX70、FX74與FJ20、FX1與FX43、FJ20與FX70、FJ20與FX43、FX74與FX43、FJ20與FN12、FN12與FX70、FN12與FX43）共培養(yǎng)時均產(chǎn)生抑菌圈，表明菌株間相互抑制生長，菌株之間不相容。因此，選用相容性好的三個拮抗菌組合，分別命名為FX1-FJ20、FX74-FN12和FX70-FX43開展后續(xù)試驗。

2.3 拮抗細菌組合對梨火疫病菌的抑菌作用

對相容性良好3個拮抗菌組合測定其對梨火疫病菌的抑菌活性。結(jié)果表明（表2），拮抗菌組合FX74-FN12、FX1-FJ20、FX70-FX43的抑菌活性都較單一菌株提高，組合菌發(fā)酵液和組合菌除菌發(fā)酵液抑菌率分別為84.05%、83.84%、 "83.49%和84.21%、84.61%、84.06%，其中FX74-FN12組合的抑菌率最高。

2.4 拮抗細菌組合對梨火疫病的防效

將篩選出的對梨火疫病菌具有較強抑菌作用的3個拮抗菌組合FX1-FJ20、FX74-FN12、FX70-FX43及單菌FX1、FJ20、FX74、FN12、FX70、FX43的菌體發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液，通過香梨離體花序、盆栽杜梨苗接種，測定、比較其對病害的防治效果。

2.4.1 對香梨花序的預(yù)防型防效 在離體香梨花序上噴施拮抗菌組合菌和單個菌株的發(fā)酵液及除菌發(fā)酵液，再接種梨火疫病菌，測定其預(yù)防型防效，試驗結(jié)果如表3所示。未噴施拮抗菌菌液的對照，在接種病原菌后第2天香梨花序的花藥、柱頭、蜜腺、花萼、子房、花柄等處陸續(xù)開始出現(xiàn)深褐色、萎蔫和壞死的花腐癥狀，而預(yù)先噴施拮抗菌的處理能明顯延緩花腐癥狀出現(xiàn)的時間，降低花腐率。拮抗菌組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液對香梨花腐防效分別為FX74-FN12（73.16%、 "82.66%）、FX1-FJ20（59.37%、72.02%）、FX70-FX43（56.26%、73.43%），而單一拮抗菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液的防效分別為FX74（65.03%、69.36%）、FN12（55.49%、67.07%）、FX1 "（51.05、67.85%）、FJ20（43.88%、62.50%）、FX70（56.61%、68.56%）、FX43（48.64%、 "59.32%），拮抗菌組合的防效顯著優(yōu)于單一菌株，組合菌除菌發(fā)酵液的防效顯著優(yōu)于組合菌發(fā)酵液。FX74-FN12組合菌發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的防效最高，比2個單菌株的平均防效有較大幅度提高，分別增加12.90%和22.40%；其次是FX1-FJ20組合菌發(fā)酵液、組合菌除菌發(fā)酵液，比2個單菌株的平均防效分別增加11.91%和 "6.85%；再次是FX70-FX43組合菌發(fā)酵液、組合菌除菌發(fā)酵液比2個單菌株的平均防效分別增加3.64%和9.49%。

2.4.2 對杜梨苗梨火疫病的預(yù)防型和治療型防治效果 預(yù)防型防效試驗結(jié)果顯示（表4），在杜梨苗上預(yù)先噴施拮抗菌組合、單個菌株的發(fā)酵液及除菌發(fā)酵液能明顯降低嫩枝的枝枯率，減輕病情指數(shù)（Plt;0.05），具有明顯的保護效果，不同處理之間差異顯著。拮抗菌組合發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液的7～15 d平均預(yù)防型防效分別為FX74-FN12（77.73%、80.11%）、FX1-FJ20（76.06%、77.73%）、FX70-FX43（67.38%、71.78%），而單一拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液的7～15 d平均預(yù)防型防效分別為FX74（67.26%、72.09%）、FN12（56.87%、66.91%）、FX1（65.36%、 "70.06%）、FJ20（56.54%、60.59%）、FX70 "（61.46%、65.86%）和FX43（54.02%、 "55.79%），拮抗菌組合防效較單一拮抗菌株的平均防效分別增加FX74-FN12 "（15.11%、 "12.41%）、FX1-FJ20（15.66%、10.61%）、FX70-FX43 （9.46%、 10.96%）。

治療型試驗結(jié)果表明（表5），各處理對杜梨苗梨火疫病具有一定的治療效果。拮抗菌組合發(fā)酵液和組合菌除菌發(fā)酵液的7～15 d平均治療型防效分別為FX74-FN12（75.01%、79.03%）、FX1-FJ20（72.63%、75.10%）、FX70-FX43 "（64.53%、69.04%），而單一拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液的7～15 d平均治療型防效分別為FX74（64.06%、69.49%）、FN12（55.25%、 "64.71%）、FX1（59.84%、67.32%）、FJ20 "（51.65%、57.92%）、FX70（59.64%、62.67%）和FX43（50.99%、53.11%），拮抗菌組合發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液的防效較單一拮抗菌株的平均防效分別增加了FX74-FN12（15.23%、9.62%）、FX1-FJ20（16.89%、12.48%）、FX70-FX43 "（9.10%、11.15%）。

綜合預(yù)防和治療防效的試驗結(jié)果，3個拮抗菌組合的防效均比單個菌株明顯提高，組合除菌發(fā)酵液的防效顯著優(yōu)于組合菌發(fā)酵液的防效，預(yù)防型防效較治療型防效更佳。其中FX74-FN12組合的防效最好，其組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的預(yù)防型和治療型防效分別在75%以上和79%以上；其次是FX1-FJ20組合，其組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的預(yù)防型和治療型防效分別在72%以上和75%以上；再次是FX70-FX43，其組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的預(yù)防型和治療型防效分別在64%以上和69%以上。

3 討" 論

目前，對于植物病害生防菌的研究主要集中在單個菌株，多菌株組合復(fù)配對生防效果的影響研究較少。篩選不同類型、不同作用機制、不同營養(yǎng)需求、不同環(huán)境適應(yīng)性的多功能生防潛力菌株，通過菌株的二元或多元復(fù)配，利用不同菌株在時間、空間和生理上的互補、協(xié)同及互惠互生作用，構(gòu)建研制高效廣譜的復(fù)合菌劑，能克服單菌株功效的局限性和在環(huán)境中的不穩(wěn)定性，增強其防病效果，因而更具有應(yīng)用價值[14]。有研究表明，組合菌株的合理選擇對于發(fā)揮其防病功效，提高生防效果至關(guān)重要。組合復(fù)配的生防細菌菌株間的親和性良好，能提高對病害的防治效果；但菌株間存在拮抗性則影響其穩(wěn)定性，反而會降低防病效果[15]。本研究中所采用的6個供試菌株FX74、FN12、FX1、FJ20、FX70和FX43其發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液在平板對峙試驗中均表現(xiàn)出對梨火疫病菌較強的抑菌作用，除菌發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈大于發(fā)酵液，表明其胞外代謝產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)具有較強的抑菌活性；同時FX1、FJ20、FX70和FX43菌株還具有營養(yǎng)的競爭能力強、生長速度快的特性，形成的菌苔能迅速占據(jù)空間，快速覆蓋病原菌。本研究將這些具有不同抗菌機制的菌株通過相容性測定，從中篩選出相容性良好拮抗菌組合FX1-FJ20、FX74-FN12、FX70-FX43。將3個拮抗菌組合按照1∶1的比例復(fù)配，測定結(jié)果表明對梨火疫病菌的抑菌活性較單個菌株均有明顯增強。李恩琛等[16]試驗發(fā)現(xiàn)，生防細菌的不同組合、不同比例復(fù)配對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果不同，當(dāng)親和性菌株組合B1與FS-1206以2∶1復(fù)配時，其發(fā)酵液抑菌率達86.64%，抑菌效果顯著優(yōu)于單一生防細菌及其他復(fù)配組合。本研究篩選出的拮抗細菌組合，僅測定了1∶1的比例復(fù)配的抑菌活性，在后續(xù)工作中還需對組合菌株不同配比發(fā)酵對菌體生長速度、活菌數(shù)量和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量及抑菌活性和防病效果的影響等研究還有待在后續(xù)工作中開展。

本研究采用對梨火疫高度感病的香梨花序和杜梨苗（香梨砧木）作為接種材料，通過噴霧接種拮抗菌組合發(fā)酵液菌和除菌發(fā)酵液，測定、評價對梨火疫病的防病效果。試驗結(jié)果表明，噴施3個拮抗細菌組合發(fā)酵液和組合菌除菌發(fā)酵液對梨火疫病菌侵染造成的香梨花腐、杜梨苗枝枯均具有較好的防病效果，拮抗細菌組合的防效顯著優(yōu)于單一菌株，組合菌除菌發(fā)酵液的防效顯著優(yōu)于組合菌發(fā)酵液。綜合香梨花序和杜梨苗防效的試驗結(jié)果，F(xiàn)X74-FN12組合的防效最佳，對梨火疫病香梨花腐的預(yù)防型防效，對杜梨苗梨火疫病的預(yù)防型和治療型防效都能達到73%以上，組合除菌發(fā)酵液的防效更優(yōu)。其次是FX1-FJ20和FX70-FX43組合，也表現(xiàn)出較好的防病效果。李國等[17]將2株均能產(chǎn)生脂肽類抗生素的拮抗細菌特基拉芽孢桿菌C-9和鞘氨醇桿菌A1混合復(fù)配，提高了對棉花黃萎病菌的抑制能力和防病效果。分析其原因是2株菌混合提高了生長競爭性，能相互促進、相互利用，化解在發(fā)酵時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對活菌的反饋抑制現(xiàn)象，從而增強菌株的代謝活力，促進了抑菌性物質(zhì)的產(chǎn)生。本研究中的拮抗菌組合，F(xiàn)X74-FN12組合中的2個菌株的抑菌作用均是通過產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)，F(xiàn)X1-FJ20和FX70-FX43組合中的菌株除產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)外，同時具有競爭性強的優(yōu)勢，組合后都產(chǎn)生優(yōu)于單個菌株的防病效果。其組合復(fù)配是否增加活菌濃度，提升了抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生量、活性及穩(wěn)定性還有待分析。因此，不同或相似作用機制的拮抗菌組合復(fù)配使用時，其防病作用不是簡單的累加，而是具有一定的協(xié)同增效作用。本研究結(jié)果與陳志誼等[18]及藍星杰等[19]的研究結(jié)果相似。

本研究對篩選出的3個拮抗菌組合，通過室內(nèi)試驗測定對梨火疫病菌的抑制作用及其防病效果，組合菌株在植株上定殖性能、田間防效及穩(wěn)定性等都需進一步試驗驗證，為梨火疫病生防潛力菌株的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

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Determination of" Affinity for Combination of Antagonistic Bacteria against

Fire Blight Pathogen Erwinia amylovora and Their Biocontrol Effect

Abstract In the pursuit ofantagonistic bacterial combinations exhhibiting high inhibitory activity and efficacious disease prevention effect against Erwinia amylovora， strains isolated from the the fragrant pear enzyme solution at the early stage in the laboratory were used as materials.The affinity between these strains was assessed via plate confrontation culture， while their combined inhibitive activity were measured using punching-inhibition circle method. The antagonistic bacterial combination demonstrating substantial affinity and potent inhibition of" E.amylovora were identified and further evaluated through in vitro spraying fragrant inflorescence and potted Birchleaf Pear seedlings. The results showed that combinations FX1-FJ20， FX74-FN12 and FX70-FX43， exhibited affinity and achieved inhibition rates more than 83% in both combined strains fermentation broth and" combined strains" filtered fermentation broth， significantly higher than that of the single strains. The average protective efficacy of the three antagonistic bacterial combinations on fragrant pear inflorescences ranged from 56.26% to 73.16% for"" combined strains" fermentation broth and 72.02% to 82.66% for" combined strains" filtered fermentation broth over 3 to 7 days，similarly，on potted Birchleaf Pear seedlings， protective efficacy ranged from 67.38% to 77.73% for"" combined strains" fermentation broth and 71.78% to 80.11% for"" combined strains" filtered fermentation broth over 7 to 15 days， with therapeutic efficacy ranging from 64.53% to 75.01% and 69.09% to 79.03%， respectively.Overall， the combined strains consistently exhibited enhanced efficacy compared to the single strains， with filtered fermentation showing good results to fermentation alone in terms of protective and therapeutic effects. Particularly， combination FX74-FN12 demonstrated the highest efficacy， achieving protective efficacies of" "73.16% and 82.66% in fermentation broth and filtered fermentation， respectively， during the initial" "3-5 days against fragrant pear blossom rot-an increase of 12.90% and 22.40%， respectively， compared to single-strain efficacy averages. Moreover， average protective and therapeutic efficacies on potted Birchleaf Pear seedlings over 7-15 days were more than 75% and 79%， respectively， showing increases of 15.12% and 11.02% compared to single-strain averages. These findings have the potential of FX74-FN12 for effective prevention of Birchleaf Pear fire blight.

Key words Erwinia amylovora; Antagonistic bacterial combination; Affinity; Antibacterial activity; Control effect determination