摘 要" 為了闡明TetR家族轉(zhuǎn)錄因子SPA7074影響密旋鏈霉菌Act12的具體機(jī)制，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)方法，檢測(cè)了SPA7074缺失突變株（Δspa7074）與野生型Act12之間的胞內(nèi)代謝物圖譜，并進(jìn)行多元篩選統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：在正離子模式下Δspa7074中相較于野生型顯著差異代謝物共有55種，為氨基酸及其衍生物、核黃素、S腺苷甲硫氨酸和低碳有機(jī)酸等物質(zhì)，這些化合物多為寡霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素生物合成的前體或中間產(chǎn)物，以及能量代謝相關(guān)物質(zhì)；通過胞內(nèi)相關(guān)的次級(jí)代謝中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析，對(duì)寡霉素的生物合成途徑進(jìn)行了初步的闡述。以上結(jié)果說明SPA7074敲除后胞內(nèi)寡霉素生物的合成顯著提高并及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，消耗了大量的氨基酸代謝相關(guān)產(chǎn)物，增加了細(xì)胞的能量供應(yīng)，改變了胞內(nèi)的代謝流。

關(guān)鍵詞 密旋鏈霉菌；非靶向代謝組學(xué)；寡霉素D

密旋鏈霉菌Act12（Streptomyces pactum）是西北農(nóng)林科技大學(xué)薛泉宏教授課題組分離得到的一株生物防治菌，其能抑制真菌病原體、促進(jìn)植物生長[1-2]、改變植物根際微生物群落[3]、促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物積累[4]。

TetR家族是一類在原核生物中廣泛分布的轉(zhuǎn)錄因子，由保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端的配體調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組合而成。其可調(diào)節(jié)微生物滲透壓及生理平衡、促進(jìn)抗生素的生物合成、影響不同代謝通路中蛋白的活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，TetR家族轉(zhuǎn)錄因子SPA7074敲除突變株Δspa7074可顯著提高多種植物對(duì)病原真菌的拮抗能力，HPLC結(jié)果表明，與Act12野生型相比，Δspa7074中多種代謝物質(zhì)發(fā)生了較大改變，特別是抑菌物質(zhì)寡霉素D的產(chǎn)量最高，是野生型的7倍多[5]。

作為一種新興組學(xué)工具，代謝組學(xué)借由高效液相色譜[6]、核磁共振波譜[7]和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)[8-9]、植物學(xué)[10-11]以及醫(yī)學(xué)研究[12-13]，與轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)一起成為研究生物體代謝表達(dá)活動(dòng)的重要手段之一[14]。然而，目前借助代謝組手段對(duì)微生物的研究更多應(yīng)用于植物微生態(tài)[15]和人體微生態(tài)[16]等方面，針對(duì)單一菌株突變體代謝組變化的研究相對(duì)較少。為此，本研究利用基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)方法[17-18]，分析了TetR家族轉(zhuǎn)錄因子SPA7074敲除突變株（Δspa7074）與Act12野生型之間整體差異代謝物，并利用層次聚類分析、差異代謝物相關(guān)分析、KEGG富集分析等方法，篩選了突變株與野生型之間的差異代謝通路，可為揭示寡霉素的合成途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

密旋鏈霉菌Act12（Streptomyces pactum）野生型（WT）、SPA7074敲除突變株（Δspa7074），均來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)放線菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；TSB培養(yǎng)基：大豆蛋白胨3 g/L，胰蛋白胨17 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，121 ℃滅菌25 min。

1.2 主要試劑

10×binding buffer，50%甘油，0.1" mol/L MgCl2，1% NP40，20 mmol/L EDTA，10×TBE，10%過硫酸銨（APS），均由本實(shí)驗(yàn)室配置；SYBR safe DNA凝膠染料，購自thermo fisher；6×DNA loading buffer，購自擎科生物。

1.3 胞內(nèi)代謝物的制備和提取

將活化的密旋鏈霉菌Act12野生型（WT），SPA7074敲除突變株（Δspa7074）接種到TSB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)9 d后取樣，3種菌株樣本設(shè)置6個(gè)重復(fù)。4 ℃、5 000 r/min離心 "5 min收集菌體3次，使用預(yù)冷的PBS懸浮菌體；棄去全部上清液，將菌體分裝為0.1 mL收集在離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存。

取一管分裝后的菌體樣本，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇溶液（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），渦旋混勻，冰浴靜置5 min，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，收集上清液到新離心管中，加入150 μL超純水，渦旋混勻后，轉(zhuǎn)移到帶有0.22 μm濾膜的離心管中，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，收集濾液到進(jìn)樣瓶進(jìn)行質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.4 Δspa7074與野生型間差異代謝物篩選

在液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定后，先將得到的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行圖譜匹配和搜庫，擬合分析相應(yīng)的代謝物種類及含量；再進(jìn)行質(zhì)控以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，篩選統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。通過變量投影重要度（VIP值）和每個(gè)代謝物在2個(gè)處理中所有生物重復(fù)定量值的均值之比（FC值），結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行篩選，并繪制展示比較對(duì)（WT vs Δspa7074）間的差異代謝物整體分布火山圖。

1.5 Δspa7074與野生型間代謝物差異分析

1.5.1 差異代謝物相關(guān)性分析 計(jì)算比較對(duì)WT vs Δspa7074間差異代謝物間皮爾遜相關(guān)系數(shù)，進(jìn)行代謝物相關(guān)性分析，并進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)[19]，Plt;0.05即為顯著性差異。

1.5.2 差異代謝物功能分析 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡(luò)研究的重要方法[20-23]。對(duì)鑒定到的代謝物利用KEGG進(jìn)行功能和分類注釋，并在KEGG富集圖的基礎(chǔ)上進(jìn)一步解析代謝物所參與的生化途徑以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路線，使用超幾何檢驗(yàn)計(jì)算閾值（P-value），進(jìn)一步分類找出胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物所在通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 Δspa7074與野生型Act12間的差異代謝物分析

篩選VIPgt;1且Plt;0.05的代謝物，視為差異代謝物。由圖1可知，在正離子模式下，Δspa7074與Act12間的差異代謝物共有55種，其中47種顯著下調(diào)，8種顯著上調(diào)。表1列出了其中差異最顯著的10種化合物。

2.2 Δspa7074與野生型Act12間代謝物相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究代謝物之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)得到的差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2）。結(jié)果顯示，上調(diào)的8種代謝物差異代謝物具有強(qiáng)正相關(guān)性；下調(diào)的47種差異代謝物間也具有正相關(guān)性，且上、下調(diào)的差異代謝物兩兩間具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。另外，顯著上調(diào)的差異代謝物主要是次生代謝產(chǎn)物及其前體化合物，而顯著下調(diào)的代謝物主要是初生代謝產(chǎn)物與細(xì)胞能量代謝相關(guān)化合物。因此，初步推斷在敲除 "SPA7074基因后，胞內(nèi)初生代謝產(chǎn)物與能量代謝產(chǎn)物消耗速度加快，轉(zhuǎn)化為次生代謝產(chǎn)物，并使其積累量增加。

2.3 KEGG富集分析

在正離子模式下分析差異代謝物的富集通路，發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物種類較多，但大部分未能富集在通路上（圖3）。在上調(diào)的差異代謝物中有6種未能被富集在通路中，包括：磷脂酰甘油（16：1（9Z）/18：1（9Z））、15-脫氧-Δ12，14-前列腺素A1、松脂多辛、人參皂苷 Rg2、1-硬脂?；?2-油酰基-sn-甘油、2，3-二甲氧基-5-甲基-6-（3-甲基-2-丁烯-1-基）-1，4-苯二醇；其他上調(diào)差異代謝產(chǎn)物富集在C5支化二元酸代謝與丙酸鹽代謝通路中；在下調(diào)的差異代謝物中有10種差異代謝化合物未能富集在通路中，包括：3-甲氧基-2-（3-甲基丁-2-烯基）-5-戊基苯酚、CHEMBL465325、2-花生四烯酰甘油、3-甲氧基-2-（3-甲基丁-2-烯基）-5-戊基苯酚、19（R）-HETE、5′-氨基甲酰胺-5′-脫氧腺苷、脯氨酰亮氨酸、L-α-亞麻酸-γ-D-Glu-內(nèi)消旋二氨基庚二酸、N（2）-琥珀酰-L-鳥氨酸和2-庚基-4-羥基喹啉n-氧化物。除卻未被富集的差異代謝物，被富集的通路大多為次生產(chǎn)物、各類氨基酸以及能量的代謝通路。與野生型相比，突變株中氨基酸、部分次生代謝產(chǎn)物、能量相關(guān)化合物相關(guān)中間體的合成與代謝表達(dá)量均有明顯變化。

3 討" 論

鏈霉菌Act12野生型的基因簇大部分都是沉默或低表達(dá)的，前期高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示[5]，敲除SPA7074后突變株產(chǎn)生的寡霉素D的含量與野生型相比上升了7倍（圖4）。而通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)寡霉素生物合成基因簇內(nèi)多個(gè)基因表達(dá)量提高，與SPA7074在染色體上相鄰的通道蛋白R(shí)S00415的轉(zhuǎn)錄水平也提高了10倍左右[24]，因此寡霉素D生物合成量的增加可能與SPA7074敲除后，解除了對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)，寡霉素生物合成基因簇內(nèi)相關(guān)合成基因的表達(dá)水平可以提高寡霉素的合成量，通道蛋白表達(dá)水平的提高可以及時(shí)將寡霉素轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，從而解除寡霉素生物合成的產(chǎn)物反饋抑制。

而在本研究中，相較于野生型，突變株Δspa7074中氨基酸代謝產(chǎn)物、部分次生代謝物質(zhì)、能量代謝中間體表達(dá)量下降。這可能是寡霉素生物合成的顯著提高消耗了這些化合物，因?yàn)榘被岽x相關(guān)產(chǎn)物可作為寡霉素等聚酮類化合物的合成原料，寡霉素的大量合成也需要細(xì)胞更的供給能量；而部分代謝物質(zhì)的產(chǎn)量下降則一方面可能也是作為寡霉素的合成原料被消耗，也可能是由于寡霉素的合成增加消耗了這些共同前體化合物，從而降低了其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的合 "成量。

另外，研究者前期研究表明，寡霉素D由1，7-二氧雜螺[5.5]十一烷環(huán)的螺縮酮加一個(gè)十七碳的聚酮的結(jié)構(gòu)組成[25]，而此聚酮結(jié)構(gòu)的形成只需要活化的乙酸鹽，甲基丙二?；蛘咂浠罨男问剑ū］o酶A），活化的丁酸鹽就可以不斷縮合，形成不斷增長的聚酮類化合物鏈[26]，而在此縮合過程中，只需要十一碳大小的二羥基酮即可合成所需的1，7-二氧雜螺[5.5]的螺縮酮[27]。因此推測(cè)在此過程中，多種氨基酸產(chǎn)物，部分次生代謝物質(zhì)、能量代謝中間體的合成可能與此有一定聯(lián)系，且其中8種顯著上調(diào)的差異代謝物可能與寡霉素D合成有較強(qiáng)相關(guān)性。然而目前寡霉素D的生物合成通路并未闡明，且多數(shù)次生代謝產(chǎn)物合成通路也缺乏完整報(bào)道，目前還無法準(zhǔn)確揭示顯著上調(diào)代謝物影響寡霉素D合成的相關(guān) "機(jī)制。

本試驗(yàn)通過超高相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)方法，研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌Act12在在敲除轉(zhuǎn)錄因子SPA7074后，其代謝產(chǎn)物與野生型相比發(fā)生顯著變化，其中8種顯著上調(diào)，47種顯著下調(diào)，且上、下調(diào)差異代謝物之間有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。上調(diào)富集通路主要集中在C5支化二元酸通路、丙酸鹽代謝通路兩個(gè)通路中，他們可能與寡霉素D合成存在聯(lián)系。本研究可為揭示寡霉素D的生物合成途徑奠定基礎(chǔ)，為生防鏈霉菌Act12在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論參考。

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Impact of TetR Family Transcription Factor SPA7074 on Metabolism of

Streptomyces pactum Act12 Based on Metabolomics Research

Abstract To elucidate the specific mechanism by which the TetR-family transcription factor SPA7074 affects the Streptomyces pactum Act12. a non-targeted metabolomic approach using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to detect the intracellular metabolite profiles between the SPA7074 deletion mutant （ Δspa7074 ） and the wild-type Act12， followed by multivariate screening statistical analysis. Ultimately， 55 metabolites were found to be significantly differentially expressed in "Δspa7074" compared to the wild-type in positive ion mode， including amino acids and their derivatives， riboflavin， S-adenosylmethionine， and low-carbon organic acids， which are mostly precursors or intermediates of oligomycin-like macrolide antibiotics biosynthesis， as well as energy metabolism-related substances. The structural analysis of the intermediate products of secondary metabolites related to intracellular biosynthesis pathway of oligomycin D was conducted， which provided a preliminary description of the biosynthesis pathway of oligomycin D. These results indicate that knocking out of SPA7074 significantly increased the intracellular biosynthesis of oligomycin and timely transported it out of the cell， consuming a large amount of amino acid metabolism-related products， increasing the energy supply of cells， and changing the metabolic flow in cells.

Key words Streptomyces pactum; Non-targeted metabolomics; Oligomycin D