摘要目的：探討CYPs 24亞家族A成員1（CYP24A1）酶多態(tài)性rs2762939和環(huán)境因素的交互作用及其與冠狀動脈疾?。–AD）的相關性。方法：選取2019年2月—2021年2月我院收治的230例CAD病人作為觀察組，另選取同期于我院進行體檢的183名冠狀動脈無明顯病變的健康者作為對照組。比較兩組一般資料；采用Sanger測序法檢測CYP24A1基因rs2762939多態(tài)性；采用多因素非條件Logistic回歸分析影響CAD發(fā)生的因素；比較rs2762939不同基因型病人間的臨床特征；分析rs2762939基因型與環(huán)境因素的交互作用。結果：兩組收縮壓、舒張壓、糖尿病、高血壓、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、同型半胱氨酸（Hcy）、rs2762939基因型、等位基因比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。糖尿病、高血壓、TC、TG水平升高、CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型為GC型、CC型、C等位基因是導致CAD發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05）。GG型、GC型、CC型糖尿病、高血壓比例、TC、TG比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CC型糖尿病、高血壓比例、血清TC、TG水平高于GG型、GC型，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。rs2762939基因型GC型、CC型與糖尿病、高血壓、TC、TG存在明顯的交互作用（P＜0.05）。結論：攜帶rs2762939基因型為GC型、CC型屬于CAD高危人群，這些基因型與糖尿病、高血壓、TC、TG之間的交互作用促進了CAD的發(fā)生發(fā)展。

關鍵詞冠狀動脈疾??；CYPs 24亞家族A成員1；基因多態(tài)性；交互作用

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.025

冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）是由冠狀動脈粥樣硬化引起的，導致流向心臟血液受限的疾病［1］。CAD發(fā)病機制較復雜，受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，是造成世界范圍內殘疾和死亡的主要公共衛(wèi)生問題之一，死亡人數(shù)約占老年總死亡人數(shù)的30%［2］。隨著人口老齡化程度的加劇及生活環(huán)境、飲食結構的改變，CAD發(fā)病率呈逐年升高趨勢［3］。流行病學研究結果顯示，年齡、吸煙、肥胖、飲食、家族史等因素與CAD的發(fā)生密切相關［4］。隨著蛋白質組學和基因組學研究的不斷深入，全基因組關聯(lián)研究顯示，越來越多的疾病發(fā)生與基因多態(tài)性有關［5］。細胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）是單加氧酶，可催化與藥物代謝、脂質合成相關的反應，是一組超家族基因編碼結構和功能的同工酶［6］。CYPs 24亞家族A成員1（CYPs 24 subfamily A member 1，CYP24A1）是CYPs家族中的一員，可編碼24-羥化酶，通過多種途徑降解維生素D的活性形式［7］。有研究表明，CYP24A1基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)病風險有關［8］。文獻報道顯示，CYP24A1基因多態(tài)性與冠心病、川崎病等有關［9］，國內相關研究鮮有報道。由于CYP24A1種族和地域分布差異較大，我國CYP24A1基因多態(tài)性與CAD發(fā)生的相關性尚未明確。本研究通過檢測CYP24A1基因的rs2762939位點，探討CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939與CAD的相關性，以期為闡明疾病的診斷和疾病發(fā)生的分子機制提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2019年2月—2021年2月我院收治的230例CAD病人作為觀察組，其中男88例，女142例；年齡45～75（62.58±7.35）歲；體質指數(shù)（24.45±2.12）kg/m²。另選同期于我院進行體檢的183名冠狀動脈無明顯病變（冠狀動脈狹窄程度＜25%）的健康者作為對照組，其中男85名，女98名；年齡45～75（61.35±7.65）歲；體質指數(shù)（24.39±2.28）kg/m²。對照組健康者至少存在CAD家族史、吸煙、糖尿病、高血壓、血脂異常等CAD危險因素中的1項。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批。

CAD病人納入標準：經(jīng)冠狀動脈造影證實回旋支、前降支、左主干、右冠狀動脈等主要血管中至少1支狹窄≥50%；臨床資料完整。排除標準：肺炎、敗血癥等感染性疾病；惡性腫瘤；自身免疫性疾??；嚴重血液系統(tǒng)疾病。

1.2方法

1.2.1一般資料收集

通過電子病歷收集所有研究對象的一般資料，包括年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病情況；測量病人身高和體重，計算體質指數(shù)（體質指數(shù)＝體重/身高2）；血壓計測量病人的舒張壓和收縮壓。高血壓病人的診斷參照《中國高血壓防治指南》2018年修訂版中的相關標準［10］，糖尿病病人的診斷參照美國糖尿病學會制定的《糖尿病醫(yī)學診療標準》［11］。

1.2.2樣本采集

于病人入院后次日清晨或對照組體檢當日，采集空腹靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心15 min獲得血清，采用cobas c800全自動生化分析儀（羅氏公司）及配套試劑檢測病人血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（how density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平。

1.2.3全血DNA提取

采集所有研究對象空腹靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸二鉀（dipotassium ethylenediamine tetraacetate，EDTA-K2）抗凝管中，采用AxyPrep血基因組小量試劑盒（康寧生命科學有限公司）提取、純化全血基因組DNA，采用紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）測定全血基因組DNA的濃度和純度。以超純水為陰性對照，當OD260/OD230＞2.0、OD260/OD280≈1.8時，表明DNA純度合格，DNA濃度＞1.0 μg/μL。

1.2.4CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939檢測

采用Sanger測序法對全血基因組DNA進行測序，檢測CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939的等位基因。正向引物為5′-CTCTCCCTTATCCTTTTTACTCCT-3′，反向引物為5′-AGCTGTGAGGTGACCATTGAG-3′，引物序列均由上海生工合成。1）將提取的DNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），反應體系：MTHFR擴增液22 μL，1.0 μL反應液A，2 μL樣品DNA溶液（濃度為40 ng/μL），10 μmol/L的正向、反向引物各1 μL，使用無菌去離子水補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃修復延伸10 min。2）測序反應：檢測CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型（GG型、GC型和CC型）和等位基因（G等位基因、C等位基因）。PCR產(chǎn)物測序反應體系：純化后PCR產(chǎn)物2 μL，引物2 μL，滅菌水2 μL，Big Dye Seq 5*Buffer 1.2 μL，Big Dye 0.4 μL。PCR產(chǎn)物測序體系：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，60 ℃ 3 min，共30個循環(huán)。采用自動單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型軟件對SNP進行數(shù)據(jù)分析。3）PCR產(chǎn)物純化：每50 μL PCR產(chǎn)物中加入4 μL 3 mol/L NaAc和80 μL 95%乙醇，離心去上清液，待乙醇揮發(fā)后加入20 μL TE溶解。4）電泳及凝膠成像檢測：對PCR產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后放入凝膠成像系統(tǒng)測定條帶情況。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用χ2檢驗。采用基因頻率計數(shù)法計算等位基因及基因型分布情況，Hardy-Weinberg（H-W）平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗。采用多因素非條件Logistic回歸分析影響病人CAD發(fā)生的因素。GMDR軟件分析CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型與環(huán)境因素的交互作用。檢驗水準α＝0.05。

2結果

2.1兩組臨床資料比較

兩組收縮壓、舒張壓、糖尿病、高血壓、TC、TG、Hcy比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

2.2CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939單核苷酸多態(tài)性分析

基因分型后獲得純合子GG型片段、雜合突變GC型片段和純合突變CC型片段，3、5、7、8、9、12為純合子GG型，2、4、6、10為雜合突變GC型，11為純合突變CC型。詳見圖1。

2.3兩組CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型及等位基因頻率比較

對照組和觀察組CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.092，P＝0.928），具有群體代表性。兩組CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以野生型（GG）基因頻率及G等位基因為參考進行單因素Logistic回歸分析，結果顯示，GC、CC基因頻率及C等位基因為CAD的危險因素（P＜0.05）。詳見表2。

2.4多因素非條件Logistic回歸分析影響CAD發(fā)生的因素

將差異有統(tǒng)計學意義的指標作為自變量，將CAD發(fā)生情況（未發(fā)生＝0，發(fā)生＝1）作為因變量，采用多元線性逐步Logistic回歸分析影響CAD發(fā)生的因素。結果顯示，糖尿病、高血壓、TC、TG水平升高、CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型為GC型、CC型、C等位基因是CAD發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05）。詳見表3。

2.5不同rs2762939基因型臨床特征比較

GG型、GC型、CC型糖尿病、高血壓比例、TC、TG比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CC型糖尿病、高血壓比例、血清TC、TG水平高于GG型、GC型，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.6CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型和環(huán)境因素的交互作用及其與CAD的關系

分析CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型和環(huán)境因素的交互作用與CAD的關系。結果顯示，rs2762939基因型GC、CC分別與糖尿病、高血壓、TC、TG間的交互作用均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），交叉驗證一致性較好。詳見表5。

3討論

CAD又稱為冠狀動脈性心臟病，是由于冠狀動脈改變引起的管腔狹窄、痙攣或阻塞，導致心肌缺血、缺氧或壞死的心臟病，動脈粥樣硬化是CAD的主要發(fā)病機制［12］。世界衛(wèi)生組織報道，我國每年約70萬例病人死于CAD［13］。血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平異常與CAD的發(fā)生密切相關，這些因素也是干預和治療CAD的靶點［14］。CAD的發(fā)生是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結果，是一種復雜的異質性疾病。家族流行病學研究顯示，遺傳敏感性是導致CAD發(fā)生的重要因素，遺傳因素占CAD所有危險因素的40%～60%［15］。SNP是人類可遺傳變異中的常見類型，指在基因水平由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。相關研究表明，肝細胞核因子1A（hepatocyte nuclear factor 1 A，HNF1A）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、溶酶體酸性脂肪酶A（lysosomal acid lipase A，LIPA）等脂類代謝相關基因多態(tài)性與CAD的發(fā)病有關［16］。目前，關于CYP24A1基因多態(tài)性與我國人群CAD風險關系的研究報道較少。因此，本研究探討CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939與CAD的相關性，以期為闡明疾病的診斷和疾病發(fā)生的分子機制提供參考。

CYP24A1是CYPs家族的成員之一，參與膽固醇、類固醇和其他脂質合成及藥物代謝等過程，具有促進1，25-二羥基維生素D［1，25-（OH）2D］的分解代謝和25-羥維生素D（25-OH）D的轉換、消除作用［17］。據(jù)報道，CYP24A1功能的喪失可影響血清1，25-（OH）2D水平，維生素D缺乏導致腎素和血管緊張素Ⅱ生成增加，是影響心血管疾病進展的重要因素［18］。CYP24A1的基因位點包括rs2762939、rs1570669、rs6068816等，其中，CYP24A1基因位點rs1570669與腦卒中風險降低有關，rs6068816可增加缺血性腦卒中的易感性［19］。Verdoia等［9］研究結果顯示，CYP24A1基因rs2762939多態(tài)性與冠心病的患病率和病情嚴重程度無關，C等位基因攜帶者顯著降低了冠狀動脈硬化的發(fā)生率。本研究結果顯示，CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型為GC型、CC型、G等位基因是導致CAD發(fā)生的獨立危險因素，與Verdoia等［9］研究結果存在差異，可能與不同種族和地域分布差異有關。

El-Menyar等［20］研究結果顯示，女性是影響CAD發(fā)生的獨立危險因素，CAD多發(fā)于中老年人群，中老年人群中的女性多處于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期狀態(tài)，雌激素驟然降低，失去對心血管的保護作用，增加了CAD的發(fā)生風險。本研究未得到與El-Menyar等［20］研究結果一致的結論，可能與本研究樣本量不足有關，需擴大樣本量進一步探討。Jamee等［21］研究結果顯示，糖尿病、高血壓與CAD有顯著相關性。糖尿病病人血糖升高及胰島素抵抗，使血管內皮合成一氧化氮含量減少，促進血管收縮和血小板黏附，導致CAD風險增加。高血壓病人在血流動力學的作用下，冠狀動脈管壁剪切力發(fā)生變化，導致血管內皮結構和功能改變，發(fā)生脂質、血小板黏附沉積、血管內膜損傷，促進動脈粥樣硬化進展，從而增加CAD的發(fā)生風險。本研究結果顯示，血清TC、TG水平增加是導致CAD發(fā)生的獨立危險因素，與Qiu等［22］研究結果一致。進一步分析CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939基因型與環(huán)境因素的交互作用結果顯示，GC、CC基因型均與糖尿病、高血壓、TC、TG均存在明顯的交互作用，表明GC、CC基因型與相關危險因素相互作用促進了CAD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，CYP24A1酶多態(tài)性rs2762939與冠狀動脈疾病存在相關性，基因型GC型、CC型、C等位基因均是影響CAD發(fā)生的獨立危險因素，rs2762939的基因型GC、CC與糖尿病、高血壓、TC、TG之間的交互作用和CAD的發(fā)生有關。

參考文獻：

［1］GAO W H，CUI H B，LI Q J，et al.Upregulation of microRNA-218 reduces cardiac microvascular endothelial cells injury induced by coronary artery disease through the inhibition of HMGB1［J］.Journal of Cellular Physiology，2020，235（3）：3079-3095.

［2］KONDURACKA E，CIESLIK G，MAECKI M T，et al.Obstructive and nonobstructive coronary artery disease in long-lasting type 1 diabetes：a 7-year prospective cohort study［J］.Polish Archives of Internal Medicine，2019，129（2）：97-105.

［3］JIN J L，ZHANG H W，CAO Y X，et al.Long-term prognostic utility of low-density lipoprotein（LDL） triglyceride in real-world patients with coronary artery disease and diabetes or prediabetes［J］.Cardiovascular Diabetology，2020，19（1）：152.

［4］BOGARI N M，ALJOHANI A，DANNOUN A，et al.Association between HindⅢ（rs320） variant in the lipoprotein lipase gene and the presence of coronary artery disease and stroke among the Saudi population［J］.Saudi Journal of Biological Sciences，2020，27（8）：2018-2024.

［5］KARSLI-CEPPIOGLU S，YAZAR S，KESKIN Y，et al.Association of genetic polymorphisms in the matrix gla protein（MGP） gene with coronary artery disease and serum MGP levels［J］.Balkan Journal of Medical Genetics，2019，22（2）：43-50.

［6］ZHANG Y Y，ZHOU X，JI W J，et al.Association between CYP2C19*2/*3 polymorphisms and coronary heart disease［J］.Current Medical Science，2019，39（1）：44-51.

［7］QIAN P，CAO X C，XU X J，et al.Contribution of CYP24A1 variants in coronary heart disease among the Chinese population［J］.Lipids in Health and Disease，2020，19（1）：181.

［8］ANGELI-TERZIDOU A E，GKOTINAKOU I M，PAZAITOU-PANAYIOTOU K，et al.Inhibition of calcitriol inactivating enzyme CYP24A1 gene expression by flavonoids in hepatocellular carcinoma cells under normoxia and hypoxia［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2021，704：108889.

［9］VERDOIA M，CECCON C，NARDIN M，et al.Polymorphism rs2762939 of CYP24A1 enzyme and coronary artery disease：angiographic results from a large prospective cohort of patients［J］.Blood Coagulation amp; Fibrinolysis，2020，31（6）：366-371.

［10］《中國高血壓防治指南》修訂委員會.中國高血壓防治指南2018年修訂版［J］.心腦血管病防治，2019，19（1）：1-44.

［11］李一卉，楊慧，余洋，等.2020年美國糖尿病學會糖尿病醫(yī)學診療標準（微血管和糖尿病足部分）的更新與解讀［J］.中華糖尿病雜志，2020，12（9）：733-735.

［12］WANG Z S，YAP J，KOH Y L E，et al.Correction to：predicting coronary artery disease in primary care：development and validation of a diagnostic risk score for major ethnic groups in southeast Asia［J］.Journal of General Internal Medicine，2021，36（6）：1514-1524.

［13］CHEN Y D，YANG X C，PHAM V N，et al.Resting heart rate control and prognosis in coronary artery disease patients with hypertension previously treated with bisoprolol：a sub-group analysis of the BISO-CAD study［J］.Chinese Medical Journal，2020，133（10）：1155-1165.

［14］BAHRAMI L S，RANJBAR G，NOROUZY A，et al.Vitamin D supplementation effects on the clinical outcomes of patients with coronary artery disease：a systematic review and meta-analysis［J］.Scientific Reports，2020，10（1）：12923.

［15］PARK H S，KIM I J，KIM E G，et al.A study of associations between CUBN，HNF1A，and LIPC gene polymorphisms and coronary artery disease［J］.Scientific Reports，2020，10（1）：16294.

［16］ZHENG H L，ZENG Z Y，WEN H，et al.Application of genome-wide association studies in coronary artery disease［J］.Current Pharmaceutical Design，2019，25（40）：4274-4286.

［17］HUANG W，RAY P，JI W B，et al.The cytochrome P450 enzyme CYP24A1 increases proliferation of mutant KRAS-dependent lung adenocarcinoma independent of its catalytic activity［J］.The Journal of Biological Chemistry，2020，295（18）：5906-5917.

［18］FAM M S，HASSANEIN S I，ABDEL RAHMAN M F，et al.Contribution of CYP27B1 and CYP24A1 genetic variations to the incidence of acute coronary syndrome and to vitamin D serum level［J］.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，2019，97（12）：1152-1158.

［19］YANG W，MA F H，WANG L，et al.The association analysis between CYP24A1 genetic polymorphisms and the risk of ischemic stroke in Chinese Han population［J］.Brain and Behavior，2020，10（2）：e01503.

［20］EL-MENYAR A，ABUZAID A，ELBADAWI A，et al.Racial disparities in the cardiac computed tomography assessment of coronary artery disease：does gender matter［J］.Cardiology in Review，2019，27（1）：14-22.

［21］JAMEE SHAHWAN A，ABED Y，DESORMAIS I，et al.Epidemiology of coronary artery disease and stroke and associated risk factors in Gaza community-Palestine［J］.PLoS One，2019，14（1）：e0211131.

［22］QIU W Y，CHEN J L，HUANG X Z，et al.The analysis of the lipid levels in patients with coronary artery disease after percutaneous coronary intervention：a one-year follow-up observational study［J］.Lipids in Health and Disease，2020，19（1）：163.

（收稿日期：2023-02-20）

（本文編輯薛妮）