摘要目的：探討血清微小RNA-221（miR-221）、微小RNA-222（miR-222）評(píng)估先天性心臟?。–HD）合并肺動(dòng)脈高壓（PAH）病人預(yù)后的臨床價(jià)值。方法：選取2018年6月—2020年7月我院收治的208例CHD病人，其中無(wú)PAH病人88例（CHD無(wú)PAH組），合并PAH病人120例（CHD合并PAH組）；另選取同期健康體檢者100名作為對(duì)照組。對(duì)120例CHD合并PAH病人隨訪，根據(jù)預(yù)后情況分為死亡組（43例）和存活組（77例）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)血清miR-221、miR-222表達(dá)水平；受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-221、miR-222對(duì)CHD合并PAH病人死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值；Logistic回歸分析CHD合并PAH病人不良預(yù)后（死亡）的影響因素。結(jié)果：CHD無(wú)PAH組、CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平高于CHD無(wú)PAH組（P＜0.05）。與存活組比較，死亡組肺動(dòng)脈收縮壓、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、血肌酐（Scr）、N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、miR-221、miR-222水平升高，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及6 min步行距離（6MWD）降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。血清miR-221預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為72.09%，特異度為84.42%，截?cái)嘀禐?.81，ROC曲線下面積（AUC）為0.817；血清miR-222預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為76.74%，特異度為79.22%，截?cái)嘀禐?.03，AUC為0.824；miR-221聯(lián)合miR-222預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為81.40%，特異度為87.01%，AUC為0.889。Logistic回歸分析顯示，肺動(dòng)脈收縮壓、miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），LVEF是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的保護(hù)因素（P＜0.05）。結(jié)論：血清miR-221、miR-222水平升高與CHD合并PAH病人不良預(yù)后有關(guān)。

關(guān)鍵詞肺動(dòng)脈高壓；先天性心臟?。晃⑿NA-221；微小RNA-222；預(yù)后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.016

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多種原因引起的嚴(yán)重心肺疾病，以肺動(dòng)脈壓力、阻力持續(xù)增高為特征，由于肺血管阻力增加與肺動(dòng)脈壓升高，導(dǎo)致右心衰竭和死亡，與先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）病人不良預(yù)后密切相關(guān)［1-2］。PAH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）與PAH發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)控肺動(dòng)脈細(xì)胞增殖、分化及炎癥、氧化應(yīng)激等參與疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。另有研究顯示，PAH病人外周血miRNA異常表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，如特發(fā)性PAH病人外周血miR-199a表達(dá)下調(diào)，與肺動(dòng)脈平均壓、肺血管阻力和肺血管阻力指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，對(duì)病人預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值［4］。miR-221、miR-222參與腫瘤、心血管疾病的各種生理和病理過(guò)程，相關(guān)研究顯示，miR-221、miR-222在PAH肺組織與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中上調(diào)，可調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖［5-6］。CHD合并PAH病人血清miR-221、miR-222表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系尚未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)CHD合并PAH病人血清miR-221、miR-222表達(dá)，分析miR-221、miR-222與病人預(yù)后的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2018年6月—2020年7月我院收治的208例CHD病人，其中男96例，女112例；年齡32～75（43.5±7.7）歲。其中無(wú)PAH病人88例（CHD無(wú)PAH組），合并PAH病人120例（CHD合并PAH組）。另選取同期健康體檢者100名作為對(duì)照組，其中男47名，女53名，年齡36～73（43.9±7.6）歲。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)超聲心電圖檢查并經(jīng)血管CT或心血管造影確診為CHD，右心導(dǎo)管檢查肺動(dòng)脈平均壓（mean pulmonary arterial pressure，MPAP）≥25 mmHg診斷為CHD合并PAH［7］；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他心血管疾病病人；嚴(yán)重肝、腎功能不全病人；肺血管畸形、慢性阻塞性肺疾病等其他疾病繼發(fā)的PAH。

1.2研究方法

1.2.1血清miR-221、miR-222水平檢測(cè)

采集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，離心收集血清，生化檢測(cè)于當(dāng)天進(jìn)行，部分血清置于－80 ℃保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)。

Trizol試劑（碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：R0016）提取血清總RNA，BeyoRTTM III cDNA第1鏈合成試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：D7178M）合成cDNA，采用qRT-PCR檢測(cè)血清miR-221、miR-222水平，其中PlatinumTMSYBRTM Green qPCR SuperMix-UDG購(gòu)自Invitrogen公司（貨號(hào)：11733046），miR-221、miR-222及內(nèi)參U6引物由廣州銳博生物科技有限公司合成，miR-221正向引物序列（5′-3′）：ACCTGGCATACAATGTAG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；miR-222正向引物序列（5′-3′）：CTCAGTAGCCAGTGTAG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6正向引物序列（5′-3′）：AAAGACCTGTACGCCAACAC，反向引物序列（5′-3′）：GTCATACTCCTGCTTGCTGAT。

反應(yīng)體系共50 μL：其中SYBR Green Mix 25 μL，cDNA 2 μL，正向、反向引物各1 μL，無(wú)菌雙蒸水（ddH2O）加至體積為50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃、120 s，94 ℃、20 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，以U6為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算miR-221、miR-222相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2臨床資料收集

收集病人一般資料，包括性別、年齡、收縮壓、舒張壓、心率、血氧飽和度（arterial oxygen saturation，SaO2）；超聲測(cè)定肺動(dòng)脈收縮壓、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）；測(cè)量6 min步行距離（6 minute walk distance，6MWD）。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)尿酸（uric acid，UA）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、N末端腦鈉肽前體（N-terminal brain natriuretic peptide，NT-proBNP）等。

對(duì)所有病人每3～6個(gè)月進(jìn)行隨訪評(píng)估，共隨訪2年，以死亡為不良預(yù)后，原因明確為CHD合并PAH相關(guān)死亡。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)、四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-221、miR-222對(duì)CHD合并PAH病人死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值；Logistic回歸分析影響CHD合并PAH病人不良預(yù)后（死亡）的因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CHD無(wú)PAH組、CHD合并PAH組、對(duì)照組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平比較

CHD無(wú)PAH組、CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平高于CHD無(wú)PAH組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2CHD合并PAH不同預(yù)后病人臨床資料比較

隨訪結(jié)束，120例CHD合并PAH病人中死亡43例（死亡組），存活77例（存活組）。與存活組比較，死亡組肺動(dòng)脈收縮壓、LVEDD、Scr、NT-proBNP、miR-221、miR-222水平升高，LVEF及6MWD降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。詳見(jiàn)表2。

2.3血清miR-221、miR-222表達(dá)對(duì)CHD合并PAH病人預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清miR-221預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為72.09%，特異度為84.42%，截?cái)嘀禐?.81，ROC曲線下面積（AUC）為0.817；血清miR-222預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為76.74%，特異度為79.22%，截?cái)嘀禐?.03，AUC為0.824；miR-221聯(lián)合miR-222預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為81.40%，特異度為87.01%，AUC為0.889。詳見(jiàn)圖1。

2.4CHD合并PAH病人不良預(yù)后的影響因素

將表2中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量（賦值：miR-221≥3.81＝1，miR-221＜3.81＝0；miR-222≥4.03＝1，miR-221＜4.03＝0；肺動(dòng)脈收縮壓、LVEF、LVEDD、NT-proBNP、Scr、6MWD為實(shí)測(cè)值），以CHD合并PAH病人是否死亡為因變量（否＝0，是＝1），進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈收縮壓、miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；LVEF是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的保護(hù)因素（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

3討論

PAH是一種致命疾病，其特征是肺動(dòng)脈重塑和收縮，與內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，HPASMCs）異常增生、分化、凋亡等密切相關(guān)，目前對(duì)PAH尚無(wú)治愈方法，尋找有效的PAH標(biāo)志物，對(duì)病人進(jìn)行預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義［8］。CHD合并PAH病人長(zhǎng)期處于肺充血狀態(tài)，肺動(dòng)脈壓力升高，血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)可反映心功能狀態(tài)，血清指標(biāo)可反映心腎功能［9-10］。本研究結(jié)果顯示，與存活組比較，死亡組肺動(dòng)脈收縮壓、LVEDD、Scr、NT-proBNP升高，LVEF降低，表明CHD合并PAH病人心室負(fù)荷增加，心腎功能受損，不利于預(yù)后，易發(fā)生死亡；Logistic回歸分析結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈收縮壓、miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，LVEF是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的保護(hù)因素，提示CHD合并PAH病人死亡可能與心臟高負(fù)荷有關(guān)。

miRNA主要通過(guò)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與多種病理生理進(jìn)程。相關(guān)研究顯示，肺血管中miRNA具有維持肺動(dòng)脈穩(wěn)態(tài)的作用，其異常表達(dá)與PAH的發(fā)生有關(guān)［11］。有研究表明，PAH病人外周血miRNA異常表達(dá)，檢測(cè)miRNA水平可用于PAH早期診斷及預(yù)后判斷。CHD合并PAH病人血清miR-21、miR-210高表達(dá)，是CHD病人發(fā)生PAH的危險(xiǎn)因素［12］。miRNA通過(guò)調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積等影響PAH的發(fā)生發(fā)展［13］。miR-221、miR-222與心血管疾病、炎癥性疾病、腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。有研究顯示，PAH病人肺組織和缺氧HPASMCs中miR-221和miR-222表達(dá)顯著增加，lnc-Ang362可上調(diào)HPASMCs中miR-221和miR-222表達(dá)并激活核因子（NF）-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移［14］。miR-221、miR-222在血管重塑中發(fā)揮著重要作用，miR-221、miR-222可刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，引起血管內(nèi)膜增厚［15］。本研究結(jié)果顯示，CHD無(wú)PAH組、CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平高于對(duì)照組，CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達(dá)水平高于CHD無(wú)PAH組，提示血清miR-221、miR-222水平升高可能與CHD發(fā)生及合并PAH有關(guān)。分析原因是高水平miR-221、miR-222可調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，血管內(nèi)膜增厚，升高肺動(dòng)脈壓力。

本研究結(jié)果還顯示，死亡組血清miR-221、miR-222水平高于存活組，提示miR-221、miR-222表達(dá)與CHD合并PAH病人預(yù)后相關(guān)。PAH的發(fā)病機(jī)制包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥等。有研究顯示，PAH與NF-κB通路激活有關(guān)，抑制NF-κB通路激活可減輕小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓［16］。另有研究顯示，miR-221、miR-222通過(guò)激活NF-κB通路促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性和腫瘤生長(zhǎng)［17］。推測(cè)miR-221、miR-222在PAH中表達(dá)升高，通過(guò)持續(xù)激活NF-κB通路、增加體內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病人病情加重，預(yù)后不良。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-221預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為72.09%，特異度為84.42%，截?cái)嘀禐?.81，AUC為0.817；血清miR-222預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人死亡的敏感度為76.74%，特異度為79.22%，截?cái)嘀禐?.03，AUC為0.824；二者聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.889，提示miR-221、miR-222預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人預(yù)后不良有一定的臨床價(jià)值，且二者聯(lián)合的預(yù)測(cè)價(jià)值更高。多因素Logistic分析結(jié)果顯示，miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示血清miR-221≥3.81，miR-222≥4.03，CHD合并PAH病人有發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)，可為臨床針對(duì)性治療提供依據(jù)。

綜上所述，CHD合并PAH病人血清miR-221、miR-222水平升高，對(duì)CHD合并PAH病人發(fā)生預(yù)后不良具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，且二者是CHD合并PAH病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能作為預(yù)測(cè)CHD合并PAH病人預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

［1］PASCALL E，TULLOH R M.Pulmonary hypertension in congenital heart disease［J］.Future Cardiology，2018，14（4）：343-353.

［2］符武島，陳娟，馮光球，等.血清胱抑素C評(píng)估先天性心臟病并發(fā)肺動(dòng)脈高壓患者預(yù)后的臨床價(jià)值［J］.內(nèi)科急危重癥雜志，2019，25（4）：306-308;321.

［3］SANTOS-FERREIRA C A，ABREU M T，MARQUES C I，et al.Micro-RNA analysis in pulmonary arterial hypertension：current knowledge and challenges［J］.JACC Basic to Translational Science，2020，5（11）：1149-1162.

［4］宋瑋，齊詠，陳卓昌.外周血microRNA-199a水平與特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓預(yù)后的相關(guān)性［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2021，42（8）：763-766.

［5］NIE X W，CHEN Y，TAN J X，et al.MicroRNA-221-3p promotes pulmonary artery smooth muscle cells proliferation by targeting AXIN2 during pulmonary arterial hypertension［J］.Vascular Pharmacology，2019，116：24-35.

［6］XU Y，BEI Y H，SHEN S T，et al.MicroRNA-222 promotes the proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells by targeting P27 and TIMP3［J］.Cellular Physiology and Biochemistry，2017，43（1）：282-292.

［7］中國(guó)醫(yī)師學(xué)會(huì)心血管內(nèi)科醫(yī)師分會(huì).2015年先天性心臟病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓診治中國(guó)專家共識(shí)［J］.中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2015，23（2）：61-69.

［8］SNIPELISKY D，JENTZER J，BATAL O，et al.Serum albumin concentration as an independent prognostic indicator in patients with pulmonary arterial hypertension［J］.Clinical Cardiology，2018，41（6）：782-787.

［9］邸金，劉彩霞.先天性心臟病伴肺動(dòng)脈高壓患兒血清HIF-1α和miR-210的動(dòng)態(tài)變化及意義［J］.中國(guó)婦幼保健，2021，36（5）：1066-1070.

［10］黃春云，倪殿軍，倪衛(wèi)娟，等.左心疾病患者血清微小RNA-206水平與肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系［J］.臨床內(nèi)科雜志，2019，36（6）：400-403.

［11］CARUSO P，DUNMORE B J，SCHLOSSER K，et al.Identification of microRNA-124 as a major regulator of enhanced endothelial cell glycolysis in pulmonary arterial hypertension via PTBP1（polypyrimidine tract binding protein） and pyruvate kinase M2［J］.Circulation，2017，136（25）：2451-2467.

［12］茅煥豪，葉劍飛，劉曉凱，等.血清miR-21與miR-210在先天性心臟病相關(guān)肺動(dòng)脈高壓中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2021，29（2）：217-220.

［13］王婷霞.微小RNA在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中的作用研究進(jìn)展［J］.國(guó)際兒科學(xué)雜志，2018，45（5）：345-348.

［14］WANG H，QIN R L，CHENG Y Q.LncRNA-Ang362 promotes pulmonary arterial hypertension by regulating miR-221 and miR-222［J］.Shock，2020，53（6）：723-729.

［15］張雪梅，徐新，陶軍.MiR-221/222在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性血管重塑中的作用［J］.中華高血壓雜志，2016，24（10）：923-927.

［16］張婷，蔡海鑒，楊林，等.積雪草苷通過(guò)抑制NF-κB/p38通路減輕小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓［J］.中國(guó)病理生理雜志，2019，35（9）：1600-1607.

［17］LI B L，LU Y，YU L H，et al.MiR-221/222 promote cancer stem-like cell properties and tumor growth of breast cancer via targeting PTEN and sustained Akt/NF-κB/COX-2 activation［J］.Chemico-Biological Interactions，2017，277：33-42.

（收稿日期：2023-03-23）

（本文編輯薛妮）