摘要" 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接和分子動力學模擬技術(shù)，探討愈梗通瘀湯治療心絞痛的作用機制，通過體外實驗進行驗證。方法：通過查詢TCMSP和TCMIP中藥成分數(shù)據(jù)庫，篩選愈梗通瘀湯的化學成分及相應(yīng)的蛋白靶點，進一步通過UniProt數(shù)據(jù)庫查詢基因名稱。根據(jù)數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果，構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)。同時，通過GeneCards和OMIM疾病靶點數(shù)據(jù)庫篩選與心絞痛的疾病相關(guān)靶點，將愈梗通瘀湯的作用靶點與心絞痛疾病相關(guān)靶點取交集，獲得兩者的共同靶點。隨后利用Cytoscape與STRING數(shù)據(jù)庫分別構(gòu)建了“活性成分-潛在作用靶點”及“藥物-靶點-基因本體（GO）/京都基因與基因組百科全書（KEGG）”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。使用AutoDock Vina進行分子對接驗證，利用OpenMM軟件對分子對接后的蛋白-配體體系進行模擬驗證，最后通過體外細胞實驗進行了驗證。結(jié)果：共篩選獲得了265種活性成分及671個潛在作用靶點；進一步篩選出了182條信號通路；GO富集分析表明，主要涉及炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等；KEGG富集分析表明，主要涉及動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥以及非酒精性脂肪性肝病等相關(guān)通路；分子對接結(jié)果顯示，10對關(guān)鍵活性成分和核心靶點最小結(jié)合能均＜－5.0 kJ/mol，同時小于靶點原配體的結(jié)合能，提示對接效果良好；分子動力學模擬中展示人參皂苷Rh2與磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α（PIK3CA）具有良好的結(jié)合穩(wěn)定性和活性；體外細胞實驗表明，人參皂苷Rh2具有明顯的心肌保護作用，同時激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）通路。結(jié)論：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測愈梗通瘀湯可能通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、異黃酮、黃芩素、隱丹參酮、蘆薈大黃素、人參皂苷Rh2、金黃紫堇堿、延胡索單酚堿等關(guān)鍵活性成分，調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）、腫瘤壞死因子（TNF）、PIK3CA、雌激素受體1（ESR1）等潛在通路靶點，這些通路與代謝性疾病中的炎癥及氧化應(yīng)激關(guān)系最為密切；且通過分子對接及分子動力學模擬和細胞實驗表明人參皂苷Rh2的藥理作用與激活PIK3-AKT通路關(guān)系密切；預(yù)測結(jié)果提示抗炎作用可能是愈梗通瘀湯治療心絞痛的潛在作用機制之一。

關(guān)鍵詞" 心絞痛；愈梗通瘀湯；網(wǎng)絡(luò)藥理學；分子對接；分子動力學模擬

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.23.008

Mechanism of Yugeng Tongyu Decoction for Treating Angina Pectoris Based on Network Pharmacology Combined with Molecular Dynamics Simulation Technique

HUANG Xi1， HUANG Jingjing1， ZHANG Shuo1， JIANG Hongmei1， WU Liming2， ZHANG Wenqiang3， ZHENG Kunsen3， ZENG Jingyi3， LIANG jian4， LIAN Dawei1，3，4

1.The Third People′s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， Fujian， China; 2.Fujian Medical University Union Hospital; 3.Institute of Integrative Chinese and Western Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， Fujian， China; 4.Dongguan Research Institute， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Dongguan 523106， Guangdong， China

Corresponding Author" LIAN Dawei， E-mail： 2022028@fjtcm.edu.cn

Abstract" Objective：Mechanism of Yugeng Tongyu decoction for treating angina pectoris was studied through network pharmacology，molecular docking and molecular dynamics simulation techniques.Methods：By searching the traditional Chinese medicine（TCM） system pharmacology database（TCMSP） and Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine（TCMIP） traditional Chinese medicine component databases，the chemical components and corresponding protein targets of Yugeng Tongyu decoction were screened，and the gene names were further queried through UniProt database.According to the query results of the database，the interaction network of \"TCM-active ingredient-target\" was constructed.At the same time，the disease-related targets of angina pectoris were screened through GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM） disease target databases，and the target of Yugeng Tongyu decoction were intersected with the target of angina pectoris disease to obtain the common target.The \"active ingredient-potential target\" and \"drug-target-gene ontology（GO）/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） \" network diagrams were constructed by Cytoscape and STRING databases respectively.AutoDock Vina was used

基金項目" 國家自然科學基金青年項目（No.82204662）；中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高校重點實驗室開放課題（No.CKJ2022017）；福建省自然科學基金項目（面上）（No.2023J01886）；福建中醫(yī)藥大學校管科研課題（No.XB2021039）；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項目（No.2021B1515140050）；全國大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（No.202310393007）

作者單位" 1.福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院（福州 350108）；2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院；3.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院（福州 350108）；4.東莞廣州中醫(yī)藥大學研究院（廣東東莞523106）

通訊作者"" 連大衛(wèi)，E-mail：2022028@fjtcm.edu.cn

引用信息" 黃希，黃靜靜，張碩，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子動力學模擬技術(shù)探討愈梗通瘀湯治療心絞痛的作用機制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（23）：4274-4284.

for molecular docking verification.OpenMM software were used to simulate and verify the protein-ligand system after molecular docking.Finally，it was verified by cell experiments in vitro.Results：A total of 265 active ingredients and 671 potential targets were obtained.Further，182 signal pathways were screened.GO enrichment analysis showed that it mainly involves in inflammatory reactions，tissue repair，oxidative stress reactions.KEGG enrichment analysis showed that it mainly involved atherosclerosis，diabetes complications and non-alcoholic fatty liver disease" related pathways.The results of molecular docking showed that the minimum binding energy of 10 pairs of key active ingredients and core target was less than －5.0 kJ/mol，which was smaller than the binding energy of the primary ligand of the target，indicating better docking effect.Molecular dynamics simulation showed that ginsenoside Rh2 and phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α（PIK3CA） showed better binding stability and activity.In vitro cell experiments showed that ginsenoside Rh2 showed obvious myocardial protective effect and activated the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）-protein kinase B（AKT） pathway.Conclusion：Through network pharmacology，it was predicted that Yugeng Tongyu decoction might be composed of quercetin，luteolin，kaempferol，isoflavone，baicalein，cryptotanshinone，aloe emodin，ginsenoside Rh2，corydaline，fumarine monophenol，and other key active ingredients.The regalation of hypoxia inducible factor-1（HIF-1），tumor necrosis factor（TNF），PIK3CA，estrogen receptor 1（ESR1） and other potential pathway targets were most closely related to inflammation and oxidative stress in metabolic diseases.Through molecular docking，molecular dynamics simulation and cell experiments，the pharmacological effects of ginsenoside Rh2 were closely related to the activation of PIK3-AKT pathway.The results suggest that the anti-inflammatory effect may be one of the potential mechanisms of Yugeng Tongyu decoction for the treatment of angina pectoris.

Keywords" angina pectoris; Yugeng Tongyu decoction; network pharmacology; molecular docking; molecular dynamics simulation

缺血性心臟病是全球范圍內(nèi)主要導(dǎo)致死亡和致殘的疾病，其中心絞痛是最常見的癥狀之一［1］。心絞痛是由于冠狀動脈供血不足導(dǎo)致心肌急劇而暫時的缺血和缺氧的一種臨床綜合征。這一疾病的發(fā)病原因涉及冠狀動脈的粥樣硬化、代謝綜合征等多種因素［2］。每年全球因冠狀動脈疾病而死亡的人數(shù)高達720萬例，占全球總死亡人數(shù)的12%［3］。我國60歲以上人群中冠心病的患病率為2.78%，這給政府財政和國民健康帶來了巨大的負擔［4］。因此，迫切需要尋找更有效的治療方案。

目前，治療心絞痛的常規(guī)藥物包括β受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑、抗血小板藥物等，然而，對一些病人來說，這些治療方法可能存在耐受性問題或不良反應(yīng)，無法始終有效地控制心絞痛的癥狀［5］。與之相比，中醫(yī)藥治療心絞痛具有獨特的優(yōu)勢。雖然古代醫(yī)學文獻中未明確提及心絞痛的名稱，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，心絞痛通常被歸屬于“胸痹心痛”或“脅痛”的范疇。陳可冀院士提出了血瘀、痰濁和痹阻心脈是心絞痛的主要病機，因此，治療心絞痛的關(guān)鍵在于祛瘀利濕、化瘀通脈。在陳可冀院士的理論指導(dǎo)下，愈梗通瘀湯作為治療心肌梗死的基本處方在臨床實踐中得到廣泛應(yīng)用，已被證明可以改善心絞痛癥狀并對病人的預(yù)后有益［6-7］。

研究表明，愈梗通瘀湯通過抗炎和保護心肌細胞等機制，能夠減少心絞痛的發(fā)作次數(shù)，并且具有更好的安全性［8-9］，但愈梗通瘀湯的確切藥理機制仍未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學（network pharmacology）是一種系統(tǒng)性和整體性的方法，與中醫(yī)的“整體觀念”相契合，在揭示中藥復(fù)方治療疾病作用機制的同時，可以起到從分子機制到中醫(yī)臨床的橋梁作用。據(jù)此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討愈梗通瘀湯治療心絞痛的分子機制，為愈梗通瘀湯下一步的基礎(chǔ)、臨床研究提供依據(jù)。

1" 資料與方法

1.1" 愈梗通瘀湯化學成分及靶點的獲取

通過查詢中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php），設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為篩選界值，獲取愈梗通瘀湯中丹參、當歸、川芎、延胡索、人參、黃芪、廣藿香、佩蘭、陳皮、半夏、大黃11味中藥的化學成分及相應(yīng)蛋白靶點，通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）數(shù)據(jù)再加以補充。查詢UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）獲得蛋白靶點對應(yīng)的基因名稱。

1.2" “中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將中藥、有效成分及靶點作為輸入數(shù)據(jù)，使用Cytoscape v3.10.1軟件構(gòu)建互作用網(wǎng)絡(luò)，并對互作用網(wǎng)絡(luò)進行分析和可視化，得到愈梗通瘀湯“中藥-有效成分-靶點”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3" 心絞痛相關(guān)靶點的獲取

借助人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.genecards.org）和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//www.omim.org）篩選心絞痛的疾病靶點，輸入“Angina Pectoris”關(guān)鍵詞進行檢索，合并及刪除重復(fù)后得到心絞痛的疾病靶點信息。

1.4" 愈梗通瘀湯與心絞痛共同靶點韋恩圖及蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將愈梗通瘀湯對應(yīng)靶點和心絞痛疾病靶點取交集以獲得兩者的共同靶點，采用基于Python v3.11.3的matplotlib-venn v0.11.9包繪制韋恩圖。同時使用STRING v12.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）分析共同靶點，設(shè)定置信度為0.900，去除游離靶點，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5" 愈梗通瘀湯與心絞痛共同靶點的富集分析

使用R包clusterProfiler v4.8.3對共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析；同時進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，預(yù)測愈梗通瘀湯治療心絞痛的可能機制。

1.6" 分子對接驗證

以共同靶點作為輸入數(shù)據(jù)，查詢PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）獲取其蛋白結(jié)構(gòu)，進一步使用分子模擬工具包OpenMM v8.0對其進行刪除水分子、離子配體及添加氫原子等對接前預(yù)處理；以所得化學成分作為輸入數(shù)據(jù)，查詢PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），獲取SDF格式分子結(jié)構(gòu)文件；運行AutoDock Vina v1.2.5進行分子對接（molecular docking，MD），根據(jù)結(jié)合能＜－5 kJ/mol水平評估對接結(jié)果合理性，將合理的對接結(jié)果按升序排列，選取能量最低的對接結(jié)果；最后運用PyMOL v2.5.0進行對接結(jié)果可視化。

1.7" 分子動力學模擬

采用OpenMM v8.0對分子對接后的蛋白-配體體系進行模擬。加載蛋白分子后，使用amber的ff14SB力場，TIP3P標準模型對其進行參數(shù)化，基于openmmforcefields和Espaloma生成配體小分子力場。Langevin積分器參數(shù)：非鍵相互作用的Cutoff值設(shè)定為1 nm，粒子網(wǎng)格Ewald用于長距離靜電相互作用，模擬溫度為310.65 K以模擬人體環(huán)境。設(shè)置后將體系能量最小化，并對其進行1萬步，步長0.004 ps的分子動力學模擬，每50步記錄軌跡幀（trajectory frame）數(shù)據(jù)。最后使用Bio3D v2.4對分子模擬軌跡記錄數(shù)據(jù)進行分析和可視化。

1.8" 體外實驗

1.8.1" 細胞培養(yǎng)及造模

大鼠心肌細胞株H9c2細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%二氧化碳（CO2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H9c2細胞培養(yǎng)至80%密度，棄去原有培養(yǎng)液，加入Earle′s無糖平衡鹽溶液，放入三氣培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2，95%N2）干預(yù)6 h，建立缺氧缺糖氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型。本研究獲得福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（2022KS-104-1）。

1.8.2"" 細胞分組與給藥

人參皂苷Rh2（Selleck公司，貨號：S9023）無細胞毒性實驗設(shè)置不同質(zhì)量濃度（0、5、10、20 μmol/L）組。人參皂苷Rh2保護作用實驗設(shè)置對照組、OGD組、人參皂苷Rh2組。

1.8.3" 細胞生存率的檢測

取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞，進行分組給藥處理后按增強型細胞活力（CCK-8）檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0037）說明書操作，隨后放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，于酶標儀450 nm處檢測吸光度，計算細胞活性。取各組細胞上清液及細胞裂解液，按乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0016）說明書操作；并計算 LDH 釋放率，LDH 釋放率（%）＝細胞上清液中LDH/（細胞內(nèi) LDH＋細胞上清液 LDH）×100%。

1.8.4" 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測

使用RIPA緩沖液裂解細胞后收集各組總蛋白，并在4 ℃下以10 000×g的速度離心15 min。采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定上清液中蛋白濃度。細胞勻漿物被還原的 Laemmli SDS 樣品緩沖液變性，并在95 ℃的金屬浴中煮沸5 min。相同數(shù)量的蛋白樣品通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后孵育一抗和二抗顯影。一抗體包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，1∶1 000，CST）、磷酸化PI3K（p-PI3K，1∶1000，CST）、蛋白激酶B（AKT，1∶1 000，Santa Cruz）、磷酸化AKT（p-AKT，1∶1 000，Santa Cruz），內(nèi)參β-Actin （1∶1 000，BOSTER）。通過Image J軟件進行檢測和分析。

1.9" 統(tǒng)計學處理

采用R v4.3.1軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 愈梗通瘀湯成分及靶點的獲取

共篩選出愈梗通瘀湯有效成分200種，進一步查詢UniProt數(shù)據(jù)庫獲取對應(yīng)的基因靶點349個；查詢TCMIP數(shù)據(jù)庫，并以相似度得分（Similarity Score）的第90%分位數(shù)為基準進行篩選，保留得分大于第90%分位數(shù)的有效成分92種、基因靶點382個；綜合得到有效成分265種、基因靶點671個。

2.2" “中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將11味中藥、265種有效成分和671個靶點基因輸入Cytoscape v3.10.1軟件，以篩選愈梗通瘀湯治療心絞痛的主要活性成分。通過“Analyze Network”功能得到網(wǎng)絡(luò)參數(shù)連接度（Degree）值，按Degree值降序排列，選取排名居前10位的化合物，分別為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、異黃酮（irisolidone）、黃芩素（baicalein）、隱丹參酮（cryptotanshinone）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2）、金黃紫堇堿［（S）-scoulerine］、延胡索單酚堿（isocorypalmine），詳見表1。將篩選后的活性成分、對應(yīng)靶點進行互作用可視化，得到“活性成分-靶點”PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。

2.3" 心絞痛相關(guān)靶點的獲取

借助GeneCards、DisGeNET和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選心絞痛的疾病靶點，設(shè)置關(guān)鍵詞“Angina Pectoris”進行檢索，合并返回結(jié)果并刪除重復(fù)值后，使用R v4.3.1的quantile函數(shù)來計算基因靶點相關(guān)性分數(shù)的第90%分位數(shù)，并以第90%分位數(shù)為基準進行篩選，得到靶點439個。

2.4" 愈梗通瘀湯與心絞痛共同靶點可視化及互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將愈梗通瘀湯和心絞痛相關(guān)的靶點取交集，得到69個共同靶點，應(yīng)用基于Python v3.11.3的matplotlib-venn v0.11.9包繪制共同靶點的韋恩圖（見圖2）。將69個共同靶點作為STRING v12.0數(shù)據(jù)庫的輸入數(shù)據(jù)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）?？梢暬Y(jié)果顯示，相互作用關(guān)系共107條，平均節(jié)點數(shù)為3.1，平均局部聚類系數(shù)為0.486。將STRING數(shù)據(jù)庫生成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape v3.10.1軟件中，使用cytoHubba插件的MCC算法［10］進行核心靶點基因篩選，按Rank值降序排列，選取排名居前10位的核心靶點基因，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素γ（IFNG）、白細胞介素1β（IL1B）、TNF 受體超家族成員 1A（TNFRSF1A）、Toll 樣受體 4（TLR4）、白細胞介素6（IL6）、CD40、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α（PIK3CA）、雌激素受體1（ESR1）以及原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC），將PPI網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果可視化，詳見圖4。

2.5" GO功能富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示，共富集到3 843個條目，包括細胞組成（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）3個部分，其中MF 201個，CC 365個，BP 3 277個，主要涉及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、損傷愈合、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）瀑布正向調(diào)節(jié)、氧水平感知以及細胞水平的化學壓力感知等。詳見圖5。

2.6" KEGG通路富集分析

利用clusterProfiler v4.8.3對共同靶點進行KEGG富集分析，結(jié)果按校正P值降序排列，將前20條通路進行可視化，主要涉及動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥以及非酒精性脂肪性肝病等相關(guān)通路。詳見圖6。

2.7" 分子對接結(jié)果

將前10位活性化學成分和前10位核心靶點進行分子對接驗證。結(jié)果顯示，結(jié)合能的中位數(shù)為－38.75 kJ/mol，小于－5.0 kJ/mol，詳見圖7。篩選每個靶點結(jié)合能最低的對接結(jié)果并除去重復(fù)，得到的配體化合物為人參皂苷Rh2、隱丹參酮，其中PIK3CA-人參皂苷Rh2組合的結(jié)合能最低，為－51.52 kJ/mol，選擇各靶點結(jié)合能最低對接結(jié)果進行可視化，詳見圖8。

（A為TNF-人參皂苷Rh2對接；B為IFNG-人參皂苷Rh2對接；C為IL1B-人參皂苷Rh2對接；D為TNFRSF1A-人參皂苷Rh2對接；E為TLR4-隱丹參酮對接；F為IL6-人參皂苷Rh2對接；G為CD40-人參皂苷Rh2對接；H為PIK3CA-人參皂苷Rh2對接；I為ESR1-隱丹參酮對接；K為SRC-人參皂苷Rh2對接）

2.8" 分子動力學模擬結(jié)果

進一步選取分子對接中結(jié)合最穩(wěn)定的PIK3CA-人參皂苷Rh2組合進行分子動力學模擬。

2.8.1" 均方根偏差

蛋白質(zhì)和配體的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）的變化趨勢是判斷模擬是否達到穩(wěn)定的重要表征。RMSD值在模擬啟動約1 000幀后逐漸趨于穩(wěn)定，顯示此時配體與受體復(fù)合物在模擬條件下結(jié)合比較緊密，并可保持穩(wěn)定。詳見圖9。

2.8.2" 均方根漲落

均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）提示配體對蛋白質(zhì)分子空間的波動，PIK3CA-ginsenoside rh2組合的RMSF呈現(xiàn)2簇波動區(qū)間，詳見圖10。提示相應(yīng)的位置區(qū)間的殘基可能是關(guān)鍵功能殘基，利用PyMOL將對應(yīng)蛋白質(zhì)殘基序列渲染為紅色，詳見圖11。

2.9" 人參皂苷Rh2毒性檢測及對OGD誘導(dǎo)的H9c2細胞活力的影響

為了探討人參皂苷Rh2的藥理作用，首先篩選人參皂苷Rh2的無細胞毒性濃度。與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L濃度的人參皂苷Rh2均不會影響H9c2細胞活力和LDH釋放率（見圖12、圖13），說明人參皂苷Rh2濃度＜20 μmol/L對H9c2無毒性。因此，后續(xù)選取20 μmol/L濃度作為受試濃度。與對照組比較，OGD組H9c2細胞活力明顯降低（P＜0.01），LDH釋放率明顯增加（P＜0.01）；與OGD組比較，人參皂苷Rh2組H9c2細胞活力明顯升高（P＜0.01），LDH釋放率明顯降低（P＜0.01），提示人參皂苷Rh2具有細胞保護作用。詳見圖14、圖15。

（與對照組比較，＊P＜0.01；與OGD組比較，# P＜0.01）

（與對照組比較，＊P＜0.01；與OGD組比較，# P＜0.01）

2.10" 人參皂苷Rh2對OGD誘導(dǎo)的H9c2細胞相關(guān)蛋白表達的影響

與OGD組比較，人參皂苷Rh2組p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01），提示PI3K-AKT通路途徑被激活，可能是發(fā)揮心肌保護作用的關(guān)鍵。詳見圖16～圖18。

（與OGD組比較，＊P＜0.01）

（與OGD組比較，＊P＜0.01）

3" 討" 論

中醫(yī)學認為，心絞痛可歸屬于中醫(yī)學“真心痛”“卒心痛”“厥心痛”等范疇，其病機主要包括心陽不振、鼓動無力，平素心陽不振、受寒邪侵襲虛弱之體，或者痰濁上升阻礙胸陽，以及情志不暢所致的氣機逆亂，導(dǎo)致心脈氣血運行受阻，進而引發(fā)疼痛［11］。心絞痛病人往往伴有素體水濕、痰濁的蓄積和停滯，同時新舊因素共同作用，導(dǎo)致瘀血內(nèi)阻和痰濁、濕濁相互干擾［12-13］。陳可冀院士主張以芳香溫通、行氣活血治療冠心病，其中愈梗通瘀湯是陳可冀院士以祛濁利濕、活血化瘀為治療大法創(chuàng)制的針對缺血性心臟病急性期及恢復(fù)期基礎(chǔ)治療方劑。臨床用于控制術(shù)后心絞痛發(fā)作，療效肯定［14-15］。

現(xiàn)代藥理研究表明，愈梗通瘀湯中人參具有多種功效，包括抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常和抑制心肌纖維化等［16］；黃芪能夠抗心肌缺血再灌注損傷、縮小心肌梗死面積以及提高心肌組織超氧化物歧化酶活力［17］；延胡索具有抗心肌缺血再灌注損傷、抗血栓形成和心肌保護的作用；川芎通過多種途徑，如減輕心肌缺血/再灌注損傷、調(diào)節(jié)自噬、抗氧化應(yīng)激等，以及降低炎癥對心肌細胞的傷害，減輕梗死心肌的纖維化和心肌細胞肥大，抑制心肌梗死后心腔擴大［18］。然而，對于愈梗通瘀湯的全面藥理機制研究目前仍然相對不足。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，旨在深入分析愈梗通瘀湯治療心絞痛的有效活性成分、核心作用靶點以及相關(guān)生物信號通路，以揭示其潛在的分子作用機制。這一研究有望為深入了解愈梗通瘀湯在治療心絞痛中的作用機制提供重要的理論依據(jù)。

動脈粥樣硬化斑塊炎癥是誘發(fā)心絞痛的始動因素之一［19］。近期研究據(jù)表明持續(xù)的炎癥過程推動了冠狀動脈疾病的一系列病理變化［20-22］，因此，抑制炎癥反應(yīng)成為治療心絞痛的重要策略之一［13］。心絞痛通常伴隨著心肌缺氧情況，調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的組織損傷也是治療和預(yù)防心絞痛的關(guān)鍵因素［23］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)現(xiàn)，愈梗通瘀湯治療心絞痛主要涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、氧化應(yīng)激的控制以及細胞對缺氧的感知和調(diào)節(jié)等多個信號通路，結(jié)合KEGG分析結(jié)果顯示，高度富集于TNF和低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路，進一步表明愈梗通瘀湯治療心絞痛可能與抗炎和缺氧反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，從而有助于發(fā)揮心肌的保護作用。此外，冠心病涉及的危險因素，如脂質(zhì)代謝、血流剪切力調(diào)控和非酒精性脂肪肝相關(guān)通路，也可能是愈梗通瘀湯的臨床治療靶標。

本研究進一步對愈梗通瘀湯治療心絞痛的潛在作用靶點進行了PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析和篩選，得到了關(guān)鍵活性成分和潛在核心靶點。選取靠前的活性成分和核心靶點通過分子對接驗證，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2和隱丹參酮與這些疾病靶點具有良好的結(jié)合活性，可能通過競爭原配體與靶點結(jié)合來發(fā)揮藥理作用。隨后選擇與PIK3CA結(jié)合能最低的PIK3CA-人參皂苷Rh2組合進行了分子動力學模擬，結(jié)果表明，在人體內(nèi)環(huán)境溫度下，這一組合具有良好的穩(wěn)定性。因此，認為這些活性成分與靶點蛋白之間存在著較強的親和力和結(jié)合穩(wěn)定性，隨后通過建立體外心肌細胞OGD模型，證明了人參皂苷Rh2具有明顯的心肌細胞保護作用，通過對PI3K-ATK通路的檢測，也進一步驗證了預(yù)測的人參皂苷Rh2的藥效靶點。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接和分子動力學模擬等預(yù)測手段，篩選出復(fù)方中活性成分人參皂苷Rh2與PIK3-AKT通路的靶點關(guān)系密切，并通過細胞實驗進一步驗證了相關(guān)藥理機制，為中藥復(fù)方在治療心絞痛的多靶點、多通路干預(yù)提供了初步的理論支持。這些研究成果不僅為深入研究愈梗通瘀湯在治療心絞痛方面提供了新的理論基礎(chǔ)，還為未來的實驗研究提供了方向和指導(dǎo)。

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（收稿日期：2023-10-30）

（本文編輯郭懷?。?/p>