汪宇　孫浩　朱家穎　趙寧　楊斌

摘要：為研究云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）氣味結(jié)合蛋白（odorantbindingproteins，OBPs）參與其嗅覺識別過程的機理，基于氣味結(jié)合蛋白、綠葉揮發(fā)性物質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，采用分子對接方法對云南切梢小蠹OBP與3個綠葉揮發(fā)性物質(zhì)可能的結(jié)合方式和結(jié)合能力進行模擬，結(jié)果表明，（E）-2-己烯醇較其他2個小分子而言更容易與云南切梢小蠹OBP結(jié)合，形成穩(wěn)定的氫鍵。（E）-2-己烯醇與TyunOBP2結(jié)合能最低，更容易與TyunOBP2結(jié)合，TyunOBP2與小分子物質(zhì)的結(jié)合，可能通過占有該蛋白與寄主氣味結(jié)合的空間或者通過改變TyunOBP2三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致TyunOBP2難以識別寄主松樹散發(fā)的氣味。

關(guān)鍵詞：氣味結(jié)合蛋白；分子對接；三維結(jié)構(gòu)；云南切梢小蠹；嗅覺識別；揮發(fā)性物質(zhì)

中圖分類號：5；433.5 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0132-03

以計算機為工具，通過理論模擬來指導(dǎo)輔助新型干擾劑分子的設(shè)計，可以避免研發(fā)干擾劑的盲目性并縮短干擾劑開發(fā)周期。例如，受體的三維結(jié)構(gòu)通常用于解釋配體和受體的相互作用機制、生物化學(xué)反應(yīng)過程、分子生物學(xué)數(shù)據(jù)以及設(shè)計合理的新型抑制劑等。蛋白質(zhì)一小分子的分子對接是在已知的三維結(jié)構(gòu)下，觀察它們之間是否可以結(jié)合并預(yù)測復(fù)合物的結(jié)合模式，把配體小分子放在受體活性位點區(qū)間，然后按照幾何互補、能量互補以及化學(xué)環(huán)境互補原則來評價配體與受體之間的關(guān)系，尋找兩者之間的最佳結(jié)合模式。不少植食性昆蟲都通過嗅覺識別來感受植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)。參與嗅覺最重要的蛋白質(zhì)包括氣味結(jié)合蛋白（OBP）、化學(xué)感受蛋白（csP）、嗅覺受體（OR）、味覺受體（GR）。氣味物質(zhì)與昆蟲氣味結(jié)合蛋白（OBP）結(jié)合是云南切梢小蠹（Tomicusyunnanensis）識別氣味物質(zhì)的基礎(chǔ)，也是引發(fā)昆蟲生理反應(yīng)、行為反應(yīng)的首要條件。云南切梢小蠹是我國西南地區(qū)云南松的重要害蟲，專化性較強。自然條件下，云南切梢小蠹以云南松為寄主，搜尋寄主過程中，不可避免會遇上各類非寄主植物。研究表明，非寄主闊葉樹種植物散發(fā)的綠葉氣味物質(zhì)能干擾小蠹蟲識別寄主植物的能力，成為搜尋寄主的障礙。本研究選用已經(jīng)克隆獲得的云南切梢小蠹?xì)馕督Y(jié)合蛋白TyunOBP2為對象，將r11yunOBP2與綠葉揮發(fā)性物質(zhì)進行分子對接，獲得其復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，通過配體與受體之間相互作用能和結(jié)構(gòu)分析給出氣味結(jié)合蛋白與綠葉揮發(fā)性物質(zhì)的具體結(jié)合方式，闡明其干擾機制，旨在為利用非寄主植物的次生代謝產(chǎn)物調(diào)控云南切梢小蠹提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

云南切梢小蠹TyunOBP2基因序列來源于GenBank（登錄號：YN-2E01NAXM0001_B03.seq）。所用同源模建的結(jié)構(gòu)與配體小分子的晶體數(shù)據(jù)都由分子繪圖GaussView軟件生成優(yōu)化。

1.2方法

AutoDock是半柔性配體整體分子自動對接程序，允許小分子構(gòu)象發(fā)生變化。進行配體取向及構(gòu)象搜索時，采用模擬退火、遺傳算法來尋找最優(yōu)結(jié)合取向和構(gòu)象，用半經(jīng)驗自由能計算方法來評價受體、配體之間的匹配情況。采用綠葉揮發(fā)性物質(zhì)：（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇，（z）一3一己烯醇與模建氣味蛋白進行對接，討論其與受體的相互作用。

應(yīng)用Autodocktool對蛋白質(zhì)及小分子結(jié)構(gòu)進行編輯，并轉(zhuǎn)換成pdbqt格式，應(yīng)用Autodocktool進行剛性對接，將GridBox大小設(shè)置為60點×60點×60點，格點間距0.0375nm，即空間大小為2.25nm×2.25nm×2.25nm。將此晶格的中心位于預(yù)測得到的蛋白質(zhì)活性中心附近，運用Lamarckian遺傳算法LGA，將能量搜索與遺傳算法相結(jié)合，以半經(jīng)驗勢能函數(shù)作為自由能打分函數(shù)，對小分子構(gòu)象及位置進行全局搜索，利用評分網(wǎng)格以及對接參數(shù)（Population為150，Maximun_num_evals設(shè)置為2500000）進行分子對接，并進行評分，計算小分子與生物大分子的結(jié)合強度（結(jié)合自由能）。應(yīng)用均方根偏差（RMSD，表示預(yù)測構(gòu)象對實際構(gòu)象的偏差）對對接結(jié)果進行評價分析。

2.結(jié)果與分析

2.1結(jié)合自由能

在Autodock4進行循環(huán)搜尋對接構(gòu)象后，以能量絕對值打分較高的前提下，選取均方根偏差較小的構(gòu)象進行研究分析，從對接計算得到的聚類構(gòu)象以及（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）-3-己烯醇對接的結(jié)合能對比結(jié)果可以看出，3個受體中對接的殘基不同直接導(dǎo)致配體在受體中的構(gòu)象不同（圖1），受體中的氧原子與（E）-2-己烯醇的羧基氫形成的氫鍵能量和表1中的相互作用勢能要低于另外2個小分子結(jié)合的勢能，表明氣味結(jié)合蛋白分子對（E）-2-己烯醇具有更高的親和力。

2.2結(jié)合模式

從圖2可以看出，云南切梢小蠹OBP活性位點位于蛋白質(zhì)表面上的凹槽中，周圍分布OBP的重要功能殘基。在多種作用力的參與下，化合物（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）一3一己烯醇牢固地結(jié)合在活性位點。從口袋結(jié)合模式看，與其他2個小分子相比，（E）-2-己烯醇較深入地進入了OBP的活性口袋，這是由于（E）-2-己烯醇較容易形成穩(wěn)定的氫鍵，以利于其深入口袋（圖3、圖4）。

3.結(jié)論與討論

（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）-3-己烯醇是非寄主植物闊葉樹的主要揮發(fā)性物質(zhì)，是6個碳的綠葉揮發(fā)性物質(zhì)。當(dāng)這3種綠葉揮發(fā)性物質(zhì)與寄主植物的氣味相混合時，會對小蠹蟲選擇產(chǎn)生干擾。本研究結(jié)果表明，（E）-2-己烯醇較其他2個小分子而言，更容易與云南切梢小蠹OBP結(jié)合，形成穩(wěn)定的氫鍵。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，（E）-2-己烯醇中的糖取代基、羧基較多，更容易形成氫鍵；（E）-2-己烯醛、（z）-3-己烯醇中的羧基相對較少，形成的氫鍵較少，導(dǎo)致3種綠葉揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)合能各不相同。王大偉等認(rèn)為，48h后，經(jīng)（E）-2-己烯醇處理后留在松梢外的云南切梢小蠹數(shù)量最多，（E）-2-己烯醇處理對云南切梢小蠹影響最大。本研究結(jié)果表明，（E）-2-己烯醇與BunOBP2結(jié)合能最低，更容易與r11yunOBP2結(jié)合，TyunOBP2與小分子物質(zhì)的結(jié)合，可能通過占有該蛋白與寄主氣味結(jié)合的空間或者通過改變TyunOBP2三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致TyunOBP2難以識別寄主松樹散發(fā)的氣味。從對接的結(jié)合模式圖來看，小分子與受體分子表面的作用也是決定其活性的重要因素之一，（E）-2-己烯醇和OBP之間可能存在疏水作用力、范德華力，導(dǎo)致其結(jié)合能較低；因此，加強小分子的疏水性或者形成氫鍵能力均有可能增強化合物的抑制活性。本研究選用云南切梢小蠹1個已知的氣味結(jié)合蛋白作為對象，計算并模擬TyunOBP2與3個綠葉氣味物質(zhì)的分子對接，計算結(jié)果與前人試驗結(jié)果一致，說明利用同源建模和分子對接方法模擬氣味物質(zhì)與氣味結(jié)合蛋白結(jié)合有一定的可靠性。實際上，昆蟲在進化過程中發(fā)展多個氣味結(jié)合蛋白識別多種氣味物質(zhì)，云南切梢小蠹也有多個氣味結(jié)合蛋白，是否還存在比TyunOBP2更容易與小分子綠葉氣味物質(zhì)結(jié)合的其他氣味結(jié)合蛋白還需進一步研究。