袁歡　王濤　祝晨蔯　吳愛芝　林朝展

[摘要]以中性紅為分子探針研究2種苯乙醇苷類化合物（PhGs）毛蕊花糖苷和連翹酯苷B在生理?xiàng)l件下與小牛胸腺DNA（ctDNA）之間的相互作用。熒光光譜、紫外光譜、黏度、DNA熱變性實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接結(jié)果表明：這2種PhGs主要采用氫鍵作用以溝區(qū)方式結(jié)合到ctDNA雙螺旋小溝中，毛蕊花糖苷與DNA結(jié)合作用更強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞]苯乙醇苷； ctDNA； 中性紅； 分子對(duì)接

[Abstract]In physiological condition， the interaction of acteoside and forsythoside B with calf thymus DNA using neutral red （NR） as a fluorescence probe were investigated by fluorescence， UVvisible spectrophotometry， viscosity， DNA melting techniques， and molecular docking It is observed that acteoside and forsythoside B can react with DNA The major mode of recognition between drug and DNA is groove binding by hydrogen bonds， and the interaction of acteoside with DNA is stronger than that of forsythoside B

[Key words]phenylethanoid glycosides； ctDNA； neutral red； molecular docking

眾所周知，脫氧核糖核酸（DNA）是生命體內(nèi)基因表達(dá)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究藥物小分子與DNA之間的相互作用機(jī)理，是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的課題。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，糖苷藥物中的糖基作為藥物分子的一部分不僅可以調(diào)節(jié)脂水分配系數(shù)、調(diào)節(jié)血漿半衰期、改善藥動(dòng)學(xué)性能，而且其糖基片段上豐富的羥基對(duì)DNA等作用靶點(diǎn)具有特異性的識(shí)別與結(jié)合功能，因此糖基作為直接功能基團(tuán)可以存在于許多以DNA為靶點(diǎn)的抗腫瘤化療藥物中[1]。含雙糖和三糖的苯乙醇苷類成分（PhGs） 毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B在紫珠屬植物Callicarpa L中廣泛存在，藥理實(shí)驗(yàn)顯示這2個(gè)化合物具有良好的抗癌和抗炎活性[23]。PhGs抑制惡性細(xì)胞增生的能力主要取決于苯乙基上的取代基，表現(xiàn)為3，4鄰二羥基苯乙基芳香體系有相當(dāng)強(qiáng)的抗腫瘤作用[4]。毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B中正含有這樣的結(jié)構(gòu)片斷，因此研究二者與DNA的微觀相互作用具有重要意義。

DNA本身熒光極弱，常用溴化乙錠作為熒光探針，但其毒性大，具有強(qiáng)致癌性，污染環(huán)境。與溴化乙錠相比，中性紅（NR）作為熒光探針穩(wěn)定性好、毒性低[5]。本文將以NR為分子探針，選擇紫珠屬植物中富含的2個(gè)PhGs成分毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B作為藥物小分子，結(jié)構(gòu)見圖1，采用光譜法和分子對(duì)接技術(shù)首次研究其與ctDNA的相互作用，旨在闡明PhGs與DNA的作用方式、糖基片段對(duì)作用方式的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為以DNA為靶標(biāo)的藥物分子設(shè)計(jì)提供有益探索，同時(shí)也為紫珠屬植物的深入臨床醫(yī)學(xué)研究提供重要理論依據(jù)。

1材料

F2500熒光光度計(jì)（Hitachi公司），UV1000紫外可見光譜儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司），CHIRASCAN圓二色光譜儀（英國(guó)應(yīng)用光物理公司），VG ZABHS質(zhì)譜儀（英國(guó)VG公司），AVANCE400超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker公司），伍氏黏度計(jì)。

毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B（從紫珠屬植物藤紫珠中分離得到，純度>98%）溶液：配制成濃度為128×10-3mol·L-1的水溶液。中性紅（上海阿拉丁，純度99%）溶液：配制成100×10-5mol·L-1的水溶液。DNA（華美生物工程），溶液濃度以A260 nm/A280 nm>18衡量，濃度以260 nm處吸光度來確定（ε=6 600 L·mol-1·cm-1），4 ℃以下避光保存。緩沖液由01 mol·L-1Tris溶液和01 mol·L-1HCl配制（pH 740），實(shí)驗(yàn)過程中所用試劑均為分析純，用水為二次蒸餾水。

2方法

21紫外測(cè)試在5 mL量瓶中，加入1 mL的trisHCl緩沖溶液和50μL的藥物溶液，分別在容量瓶中依次加入不同體積的DNA溶液，trisHCl溶液定容。室溫放置20 min后，以緩沖液為參比，測(cè)定200～400 nm紫外圖譜。間隔05 nm，狹縫2 nm。

22熒光試驗(yàn)分別移取濃度為100×10-3 mol·L-1的DNA溶液50 μL，濃度為100×10-3 mol·L-1的NR溶液50 μL于4 mL石英吸收池中，加入緩沖液TrisHCl 3 mL，用微量注射器進(jìn)行熒光滴定，每次加入10 μL藥物溶液，混合均勻，靜置5 min。以467 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，入射和發(fā)射狹縫分別為5 nm，在熒光光度計(jì)上記錄500～700 nm波長(zhǎng)的發(fā)射光譜。

23DNA熔點(diǎn)試驗(yàn)配制2組NRDNA溶液，其中1組加入適量藥物，水浴加熱，在40～100 ℃，每隔5 ℃監(jiān)測(cè)DNA在260 nm處吸光值的變化。以fss=（A-A0）/（Af -A0）為縱坐標(biāo)（A，Af 分別為起始吸光度和最終吸光度，A為表觀吸光度），溫度為橫坐標(biāo)作圖，得到DNA的熱變性溫度曲線圖。

24黏度試驗(yàn)DNA濃度固定為440 ×10-4 mol·L-1，藥物濃度依次增大，溫度恒定在（25±01） ℃，反應(yīng)20 min后，進(jìn)行測(cè)量。數(shù)據(jù)以（η/η0）1/3對(duì)藥物濃度作圖。η代表DNA在藥物體系時(shí)的黏度，η0代表DNA單獨(dú)存在時(shí)的黏度。

25分子對(duì)接藥物小分子初始結(jié)構(gòu)由分子模擬軟件SybylX13 獲得，運(yùn)用Tripos力場(chǎng)和GasteigerHückel電荷對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。DNA晶體結(jié)構(gòu)來自PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（編號(hào)425D）。采用Surflex程序進(jìn)行分子對(duì)接時(shí)，考慮了小分子10個(gè)構(gòu)象，結(jié)合自由能最低的構(gòu)象用來做進(jìn)一步理論分析。dsDNA分子優(yōu)化前去除其結(jié)構(gòu)中的水分子。對(duì)接原型分子通過選擇堿基對(duì)生成，對(duì)接過程中考慮了配體小分子環(huán)的柔性。

3結(jié)果與討論

31紫外光譜NR與DNA相互作用的紫外可見光譜圖，見圖2，顯示了DNA的加入對(duì)NR吸收光譜的影響。圖2中曲線 （a）是NR的吸收譜圖，可以看出其最大吸收峰在462 nm，DNA的加入使得NR在462 nm處的吸收峰發(fā)生了明顯減色效應(yīng)和一定程度的紅移現(xiàn)象，說明NR與DNA發(fā)生了嵌插作用[6]。545 nm處附近出現(xiàn)了1個(gè)新吸收峰，此峰應(yīng)該是NRDNA復(fù)合物的吸收峰[7]。462 nm處明顯的減色效應(yīng)表明NR和DNA堿基之間緊密靠近，DNA中大量堿基層層堆積，使得雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個(gè)強(qiáng)大的疏水區(qū)。紅移現(xiàn)象表明NR嵌入到DNA堿基對(duì)后，周圍所處的環(huán)境發(fā)生了改變，DNA與溶劑水分子形成氫鍵的能力降低。結(jié)果表明，NR主要以嵌插方式與DNA結(jié)合形成復(fù)合物。

毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA相互作用的紫外可見吸收光譜，見圖3。這2個(gè)PhGs由于丙烯酸酯雙鍵與苯環(huán)共扼振動(dòng)發(fā)生在333 nm附近，因而這類成分在333 nm附近具有特定的吸收光譜。與DNANR體系的吸收?qǐng)D譜比較，見圖2。當(dāng)PhGs溶液中不斷增加DNA濃度時(shí)，這類小分子在333 nm處的最大吸收峰強(qiáng)度幾乎沒有發(fā)生紅移和減色效應(yīng)，表明這2個(gè)小分子與DNA的作用方式不是典型

32藥物對(duì)NRDNA體系熒光猝滅程度的影響NR在pH 740水溶液中熒光很弱，當(dāng)有DNA存在時(shí)，NR在DNA中的嵌插式結(jié)合會(huì)使體系熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。2種PhGs逐漸加入到NRDNA體系時(shí)的熒光猝滅曲線，其中F0為不加藥物時(shí)在602 nm處的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為藥物存在時(shí)在602 nm處的熒光強(qiáng)度，見圖4。熒光光譜顯示隨著PhGs加入到NRDNA體系，熒光峰的形狀和位置并沒有改變，但其熒光強(qiáng)度隨著藥物濃度的增加而不斷降低，并且2個(gè)PhGs化合物對(duì)NRDNA體系熒光猝滅的程度存在明顯差異，猝滅程度毛蕊花糖苷明顯大于連翹酯苷 B，表明PhGs與NR之間存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，間接反映了毛蕊花糖苷與DNA的結(jié)合強(qiáng)度大于連翹酯苷B。熒光猝滅的原因可能是富含羥基的PhGs參與了和NR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA的過程，使得NR和DNA結(jié)合力減弱，從而導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度降低，推測(cè)氫鍵作用對(duì)PhGs和DNA的結(jié)合具有重要影響[9]。

33藥物對(duì)NRDNA熱變性溫度的影響通常把DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔接溫度，用Tm表示，藥物與DNA的相互作用會(huì)影響Tm。嵌插作用能夠使雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，因而會(huì)使Tm增加5～8 ℃，而溝區(qū)結(jié)合不會(huì)使Tm有明顯增加[10]。當(dāng)fss=05時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度就是Tm，當(dāng)藥物加入到DNANR后，體系Tm減小，再次證明藥物與DNA的結(jié)合不是嵌插式結(jié)合，Tm的降低可能是由于藥物與DNA溝區(qū)的結(jié)合作用，一定程度上改變了體系的構(gòu)象，使體系穩(wěn)定性降低，見圖5。

34黏度試驗(yàn)黏度測(cè)定一般被認(rèn)為是確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一。當(dāng)藥物以嵌插方式進(jìn)入DNA雙螺旋堿基對(duì)時(shí)，相鄰堿基對(duì)之間的距離會(huì)增大以便容納插入的配體，導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)膨脹變粗變長(zhǎng)，DNA溶液的黏度會(huì)增大；而以溝區(qū)結(jié)合等非嵌插方式與DNA作用時(shí)，DNA 結(jié)構(gòu)不會(huì)伸展，此時(shí)DNA 溶液的黏度無(wú)明顯變化[11]。DNA在不同濃度藥物存在時(shí)的相對(duì)黏度變化見圖 6。結(jié)果顯示，加入藥物后，DNA的相對(duì)黏度變化并未明顯增加，表明藥物與DNA的作用未引起DNA雙螺旋骨架的扭曲變化，推測(cè)其與DNA作用方式為溝區(qū)結(jié)合。

35分子對(duì)接利用分子對(duì)接技術(shù)可以直觀形象的反映藥物與DNA 的結(jié)合情況，這有助于從理論上確定小分子與DNA相互作用的機(jī)制和模式[1214]。結(jié)合毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B主要以溝區(qū)方式與DNA結(jié)合。因此分子對(duì)接過程中選擇DNA分子的雙螺旋小溝作為PhGs結(jié)合靶點(diǎn)，2個(gè)小分子與DNA作用的最佳分子對(duì)接模型，見圖7。藥物與DNA相互作用過程中根據(jù)分子對(duì)接分值（total score）值計(jì)算得到的結(jié)合常數(shù)Ka和ΔG，見表1。

對(duì)接結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B可以緊密結(jié)合在ctDNA的GGTAC小溝區(qū)域，形成雙螺旋d（GGTACCCATG）2DNA復(fù)合物。2個(gè)PhGs中的苯乙基、咖啡?；吞黔h(huán)上的羥基可與DNA上的胸腺嘧啶、腺嘌呤、戊糖、磷酸之間生成多個(gè)氫鍵，即PhGs與DNA二者之間存在強(qiáng)的氫鍵相互作用，這些氫鍵的存在對(duì)于PhGs結(jié)合在DNA小溝區(qū)域起著至關(guān)重要的作用。毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA結(jié)合時(shí)的total score值分別為753和711，結(jié)合常數(shù)Ka分別為339×107和129×107，結(jié)合吉布斯自由能變化值ΔG分別為-4299，-4059 kJ·mol-1，計(jì)算結(jié)果表明毛蕊花糖苷與DNA的結(jié)合能力大于連翹酯苷 B，結(jié)論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。毛蕊花糖苷中主要是苯乙基、葡萄糖基和咖啡?；Y(jié)合于DNA小溝，鼠李糖暴露在DNA鏈外；而連翹酯苷 B中主要是苯乙基、葡萄糖基和芹糖結(jié)合于DNA小溝，咖啡?；褪罄钐潜┞对贒NA鏈外，表明PhGs中心葡萄糖6位被芹糖取代后的角度更有利于小分子與DNA雙螺旋小溝匹配，見圖7，。原因可能是小分子中的這些多元環(huán)由扭轉(zhuǎn)的自由鍵連接，由此可產(chǎn)生合適的扭轉(zhuǎn)力來匹配小溝區(qū)的螺旋曲線，并在DNA雙螺旋鏈中AT富集的小溝區(qū)邊緣主要通過氫鍵作用形成接觸。這種選擇性作用可以非嵌入性地捆縛住DNA，阻止DNA的模板作用，從而達(dá)到抗腫瘤、抗病毒的目的。

4結(jié)語(yǔ)

本文用光譜學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)探討了生理?xiàng)l件下PhGs類成分毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B分別與DNA的相互作用。結(jié)果表明：結(jié)構(gòu)類似的PhGs由于糖基種類、數(shù)目和取代位置的不同導(dǎo)致了與DNA結(jié)合模式的差異，這對(duì)于從分子水平深入理解PhGs化合物與DNA的作用機(jī)制，以及如何修飾一系列結(jié)構(gòu)類似的PhGs藥物促進(jìn)其在體內(nèi)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)具有極為重要的意義。另外，探究結(jié)構(gòu)不同的PhGs與DNA之間可能的序列選擇性為PhGs可不同程度修復(fù)損傷的DNA提供了合理解釋。

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[責(zé)任編輯丁廣治]