摘 要：本文系統(tǒng)總結(jié)了食品微生物計量檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和應(yīng)用前景。文中詳細(xì)闡述了平板計數(shù)法、最大或然數(shù)法和顯微鏡計數(shù)法等傳統(tǒng)檢測方法的原理、優(yōu)勢和局限性。同時，重點分析了分子生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測和生物傳感器等現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的特點和應(yīng)用進(jìn)展。研究表明，盡管現(xiàn)代檢測技術(shù)在檢測速度、靈敏度和特異性等方面具有顯著優(yōu)勢，但在成本和操作便利性方面仍有改進(jìn)空間。未來，多種檢測技術(shù)的優(yōu)勢互補和創(chuàng)新融合，將為食品微生物安全檢測提供更加有力的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：食品安全；微生物檢測；快速檢測技術(shù)

Research on Microbial Metrology Detection Methods in Food Safety

GAN Meiling

（Shenzhen Huimeikang Trading Co.， Ltd.， Shenzhen 518100， China）

Abstract： This article systematically summarizes the current development status and application prospects of food microbiological quantitative detection technology. The article elaborates in detail on the principles， advantages， and limitations of traditional detection methods such as plate counting， maximum probability counting， and microscopic counting. At the same time， the characteristics and application progress of modern rapid detection technologies such as molecular biology detection， immunological detection， and biosensors were analyzed in detail. Research has shown that although modern detection technologies have significant advantages in detection speed， sensitivity， and specificity， there is still room for improvement in terms of cost and operational convenience. In the future， the complementary advantages and innovative fusion of multiple detection technologies will provide stronger technical support for food microbiological safety detection.

Keywords： food safety; microbiological analysis; rapid detection technology

食品安全直接關(guān)乎公眾健康和社會穩(wěn)定。在食品的生產(chǎn)、加工、運輸和儲存過程中，存在微生物污染和腐敗變質(zhì)的風(fēng)險。例如，食源性致病菌，如沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7等，可通過污染食品導(dǎo)致疾病暴發(fā)，從而威脅消費者健康[1]。因此，切實加強食品微生物安全檢測對保障食品安全和維護(hù)公眾健康具有重要意義。本文將系統(tǒng)綜述食品微生物計量檢測領(lǐng)域的最新進(jìn)展。通過分析傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢與局限，評述分子生物學(xué)、免疫學(xué)等快速檢測技術(shù)的原理及其在實際中的應(yīng)用，并探討新興技術(shù)的發(fā)展前景，以期為相關(guān)領(lǐng)域的從業(yè)者提供有價值的參考，推動微生物檢測技術(shù)創(chuàng)新，進(jìn)而為保障食品安全和提升公眾健康水平貢獻(xiàn)力量。

1 傳統(tǒng)微生物計量檢測方法

1.1 平板計數(shù)法

平板計數(shù)法是食品微生物檢測領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛且歷史悠久的傳統(tǒng)計數(shù)方法。其基本原理是將適當(dāng)稀釋的待測樣品涂布于固體培養(yǎng)基平板表面，在特定條件下培養(yǎng)一定時間后，通過計數(shù)平板上形成的可見菌落數(shù)，并結(jié)合樣品稀釋倍數(shù)，換算出樣品中微生物的濃度[2]。平板計數(shù)法的優(yōu)勢在于所需設(shè)備簡單，僅需恒溫培養(yǎng)箱和梯度稀釋裝置即可開展檢測，大幅降低了實驗室的資源投入。此外，該方法允許多人同時進(jìn)行分析，具有通量較高，數(shù)據(jù)直觀的特點，因此在基層實驗室中應(yīng)用廣泛。然而，平板計數(shù)法也存在明顯局限性。①檢測周期長。常規(guī)平板需培養(yǎng)48～72 h才能形成可計數(shù)菌落。②僅能夠檢出可培養(yǎng)、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，對于受損、休眠狀態(tài)細(xì)胞則無法有效計數(shù)。③活菌檢出限通常在100 CFU·g-1，靈敏度有限。④無法提供微生物的種屬信息，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。盡管存在一些不足，但平板計數(shù)法憑借其成本低、適用范圍廣等優(yōu)勢，在食品工業(yè)中仍然是應(yīng)用最普遍的微生物計數(shù)方法。

1.2 最大或然數(shù)法

最大或然數(shù)法（Most Probable Number，MPN）是一種基于概率統(tǒng)計原理的間接微生物計數(shù)方法。與平板計數(shù)法直接計數(shù)菌落數(shù)不同，MPN通過將待測樣品接種到一系列梯度稀釋的液體培養(yǎng)基中，然后根據(jù)各稀釋度試管中菌生長的情況，利用MPN表進(jìn)行估算，從而得出原始樣品中微生物的最大或然數(shù)[3]。MPN的理論基礎(chǔ)源自泊松分布。該方法假設(shè)微生物在試管中隨機分布，則每個試管中微生物數(shù)量服從泊松分布。通過極大似然估計，可以推斷出樣品中微生物的濃度，而結(jié)果通常表示為一個置信區(qū)間。MPN的主要優(yōu)勢有以下3點。①檢測靈敏度高，理論上可檢出樣品中1 CFU·mL-1的菌量。②所需設(shè)備簡單，適用于資源有限的實驗室。③可檢測難以形成可數(shù)菌落的微生物。但MPN也存在明顯局限性。例如，結(jié)果依賴于統(tǒng)計推斷，導(dǎo)致準(zhǔn)確性和重復(fù)性通常不如平板計數(shù)法；假設(shè)條件較為理想化，而實際樣品中菌體易聚集，偏離隨機分布；工作量大，單次檢測的通量低；無法區(qū)分混合菌群，因此選擇性較差。盡管存在這些局限，但MPN仍在低菌量樣品的定量檢測中發(fā)揮重要作用。

1.3 顯微鏡計數(shù)法

顯微鏡計數(shù)法是一種利用光學(xué)顯微鏡直接觀察和計數(shù)微生物細(xì)胞的定量檢測方法。操作時，將適當(dāng)稀釋的樣品置于血球計數(shù)板或其他刻度計數(shù)室中，然后在顯微鏡下觀察并計數(shù)視野中的細(xì)胞數(shù)量，通過結(jié)合樣品稀釋倍數(shù)和計數(shù)室體積，可以直接推算出原始樣品中微生物的濃度。與依賴培養(yǎng)的平板計數(shù)法和最大或然數(shù)法不同，顯微鏡計數(shù)法無須等待微生物生長，可在接種后即刻獲得結(jié)果，因此被廣泛用于對微生物計數(shù)速度有較高要求的領(lǐng)域。顯微鏡計數(shù)法的主要優(yōu)勢有以下5點。①可直接觀察微生物細(xì)胞的形態(tài)特征，有助于初步判斷菌種類型。②檢測速度快，從樣品制備到結(jié)果獲得僅需數(shù)十分鐘。③所需設(shè)備簡單，僅需光學(xué)顯微鏡和計數(shù)室。④可檢測難以培養(yǎng)或生長緩慢的微生物。⑤可用于大范圍篩查，快速估計菌量水平。然而，該方法也存在明顯的局限性。①計數(shù)過程依賴人工操作，不同操作者之間的技能差異可能導(dǎo)致重現(xiàn)性差。②由于視野面積小，單次檢測的通量低。③難以分辨細(xì)胞團(tuán)聚，可能導(dǎo)致菌量被低估。④檢出限較高，通常在104～105 CFU·mL-1。盡管存在一些不足，顯微鏡計數(shù)法仍在微生物檢測領(lǐng)域中占據(jù)重要位置。對于需要快速檢測和菌量水平較高的樣品，顯微鏡計數(shù)法能夠快速提供可靠的定量結(jié)果。然而，由于該方法依賴于人工操作，它在標(biāo)準(zhǔn)化、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性方面不如儀器檢測法。

2 現(xiàn)代快速檢測技術(shù)

2.1 分子生物學(xué)檢測方法

分子生物學(xué)檢測方法是基于特異性核酸序列的檢測，屬于一類現(xiàn)代微生物快速檢測技術(shù)。常用的分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR）、核酸序列雜交和基因芯片等。這些方法利用核酸分子的互補配對原理，通過特異性引物或探針與目標(biāo)微生物的基因組DNA或rRNA互補結(jié)合，實現(xiàn)對特定微生物的定性或定量檢測。例如，PCR技術(shù)利用特異性引物，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下，實現(xiàn)目標(biāo)基因片段的快速擴增。擴增產(chǎn)物可通過凝膠電泳進(jìn)行檢測。而qPCR在PCR基礎(chǔ)上引入了熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，實現(xiàn)擴增過程的實時動態(tài)定量。核酸雜交技術(shù)則利用標(biāo)記的探針與樣品中的DNA或RNA雜交，形成特異性雙鏈，并通過酶標(biāo)等方式檢測雜交信號。基因芯片技術(shù)將大量探針固定于一個支持物表面，通過與樣品核酸的雜交，獲得微生物組成和豐度信息。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，采用TaqMan探針qPCR技術(shù)對食品中沙門氏菌進(jìn)行定量檢測，靈敏度可達(dá)

1 CFU/25 g，且檢測時間縮短至24 h以內(nèi)[4]；利用PCR技術(shù)對牛肉中大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行快速檢測，在8 h內(nèi)即可得到結(jié)果，為食品安全監(jiān)控提供了有力工具[5]。分子生物學(xué)檢測方法的主要優(yōu)勢有以下3個方面。①特異性強，可精確鑒定目標(biāo)微生物。②靈敏度高，可檢出極低豐度的菌種。③檢測速度快，通常從樣品制備到結(jié)果獲得的時間在24 h以內(nèi)。但這類方法也存在一定的局限性。例如，儀器設(shè)備昂貴，對實驗室資質(zhì)要求高；對核酸提取純度要求高，食品基質(zhì)易干擾；無法區(qū)分活菌和死菌，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。盡管存在局限，分子生物學(xué)方法仍憑借其獨特優(yōu)勢成為食品微生物快速檢測的主流技術(shù)。未來，分子檢測方法有望與自動化樣品制備、數(shù)字PCR、高通量測序等新技術(shù)深度融合。這種融合將進(jìn)一步提高檢測靈敏度和特異性，拓展多重檢測能力，并全面提升食品微生物快速檢測的效率和準(zhǔn)確性，為保障食品安全提供更加有力的技術(shù)支撐。

2.2 免疫學(xué)檢測方法

免疫學(xué)檢測方法是基于抗原和抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，用于實現(xiàn)食品中特定微生物定性和定量分析的一類技術(shù)。常用的免疫學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫熒光技術(shù)等。這些方法的基本原理是利用特異性抗體與目標(biāo)微生物表面抗原結(jié)合，然后通過酶標(biāo)、熒光標(biāo)記或磁性微球等信號放大系統(tǒng)，將抗原-抗體結(jié)合信號轉(zhuǎn)化為可定量檢測的信號值，從而實現(xiàn)微生物的定量分析。以三明治ELISA為例，操作開始時將特異性捕獲抗體包被于微孔板上，加入待測樣品后，其中的抗原會與捕獲抗體特異性結(jié)合；洗滌除去非特異結(jié)合物后，加入另一種酶標(biāo)記的檢測抗體，形成“抗體-抗原-抗體”復(fù)合物；再次洗滌后，加入酶底物進(jìn)行顯色，通過比色或光度測量，可以定量分析抗原濃度，從而實現(xiàn)目標(biāo)微生物的定量檢測。有研究利用三明治ELISA建立了一種金黃色葡萄球菌腸毒素A的直接定量分析方法，檢測限達(dá)到0.3 ng·mL-1，線性范圍為0.3～10.0 ng·mL-1，可實現(xiàn)食品中葡萄球菌腸毒素的快速定量檢測[6]。免疫熒光技術(shù)通過熒光素標(biāo)記的抗體與目標(biāo)微生物抗原結(jié)合，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接計數(shù)熒光標(biāo)記的微生物細(xì)胞，實現(xiàn)快速定量檢測。例如，應(yīng)用免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)對牛奶中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行定量分析，檢測時間可縮短至2 h以內(nèi)，檢測限可達(dá)103 CFU·mL-1，為李斯特氏菌污染的快速篩查提供了有效工具。

2.3 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是一類集生物識別元件和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件為一體，可實現(xiàn)待測物的快速且特異性定量分析的現(xiàn)代傳感技術(shù)。根據(jù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)原理，生物傳感器主要分為電化學(xué)、光學(xué)、壓電等類型。其基本原理是利用生物識別元件（如酶、抗體、核酸和細(xì)胞等）與目標(biāo)物特異性結(jié)合，然后將結(jié)合信號通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件（如電極、光學(xué)裝置、壓電晶體等）轉(zhuǎn)化為可定量的電信號、光信號或質(zhì)量信號，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的定量檢測。

電化學(xué)生物傳感器利用生物識別元件與待測物結(jié)合引起的電化學(xué)響應(yīng)實現(xiàn)定量檢測。例如，利用功能化石墨烯和納米金顆粒修飾電極構(gòu)建酶傳感器，用于牛奶中金黃色葡萄球菌腸毒素B的高靈敏檢測，其檢測線性范圍為0.05～15.00 ng·mL-1，檢出限低至20 pg·mL-1[7]。光學(xué)生物傳感器通過測定生物反應(yīng)過程中光信號的變化，實現(xiàn)對目標(biāo)物的定量分析。例如，基于熒光量子點-抗體探針構(gòu)建的光學(xué)免疫傳感器可在1 h內(nèi)實現(xiàn)雞肉中沙門氏菌的快速定量檢測，其檢測的線性范圍為103～106 CFU·mL-1，檢出限為103 CFU·mL-1[8]。而壓電生物傳感器則利用壓電晶體質(zhì)量的變化，對生物反應(yīng)過程進(jìn)行實時監(jiān)測和定量分析。

3 結(jié)語

食品微生物檢測技術(shù)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法到現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的革新發(fā)展。雖然傳統(tǒng)方法操作簡便，但耗時較長。相比之下，現(xiàn)代檢測技術(shù)，如分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物傳感器技術(shù)，在檢測速度、靈敏度和特異性等方面具有顯著優(yōu)勢。未來，隨著微納技術(shù)、人工智能等新興技術(shù)的深度融合，食品微生物檢測將向著自動化、智能化、便攜化方向發(fā)展。通過多種檢測技術(shù)的優(yōu)勢互補和協(xié)同創(chuàng)新，將為食品安全提供更加全面、快速和精準(zhǔn)的技術(shù)支撐，從而有效保障公眾健康。

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