摘要：目的 探究椎旁肌退變（PMD）中的基因表達(dá)譜，并鑒定關(guān)鍵的鐵死亡基因。方法 選取正常和PMD患者各3例，分別取椎旁肌組織進(jìn)行RNA測(cè)序，獲得差異表達(dá)的基因。通過(guò)蛋白-蛋白相互作用（PPI）和基因功能富集分析，與鐵死亡基因取交集，鑒定與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵中樞基因。通過(guò)受試者工作特征（ROC）曲線分析鐵死亡基因?qū)MD疾病的診斷價(jià)值。結(jié)果 在PMD中共鑒定出292個(gè)差異表達(dá)的基因，其中125個(gè)顯著下調(diào)，167個(gè)顯著上調(diào)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)差異表達(dá)的基因與鐵死亡相關(guān)，其中鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A是關(guān)鍵的中樞基因，對(duì)診斷PMD具有良好的敏感度和特異度。功能富集分析發(fā)現(xiàn)它們可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡、鐵死亡和骨骼肌組織發(fā)育、分化等介導(dǎo)PMD的發(fā)生與進(jìn)展。結(jié)論 鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A可作為診斷PMD的生物標(biāo)志物，為解碼PMD的病理機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的藥物提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：序列分析，RNA；鐵死亡；計(jì)算生物學(xué)；椎旁肌退變

中圖分類號(hào)：R685 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240587

Identification of key ferroptosis genes in paraspinal muscle degeneration based on RNA sequencing and bioinformatics analysis

ZHANG Chunhong1， HUANG Hongchao1， LIU Yue1， DU Lilong1， XU Haiwei1， LI Ning1， LI Yongjin2△

1 Department of Minimally Invasive Spine Surgery， Tianjin Hospital， Tianjin 300211， China; 2 Department of Spine Surgery， the First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of China

△Corresponding Author E-mail： yongjin816@xwh.ccmu.edu.cn

Abstract： Objective To explore the gene expression profile in paraspinal muscle degeneration （PMD） and identify key ferroptosis genes. Methods RNA sequencing was performed on paraspinal muscle tissue of 3 normal and 3 PMD patients respectively to obtain differentially expressed genes. Through protein-protein interaction （PPI） and gene functional enrichment analysis， the intersection of ferroptosis genes was identified to identify key hub genes associated with ferroptosis. The diagnostic value for PMD disease was analyzed by receiver operating characteristic （ROC） curves. Results A total of 292 differentially expressed genes were identified in PMD. Among them， 125 genes were significantly downregulated and 167 genes were significantly upregulated. Bioinformatics analysis revealed that 14 differentially expressed genes were associated with ferroptosis. Among them， ferroptosis genes MUC1， ATF3 and CDKN1A were key hub genes with good specificity and sensitivity for diagnosing PMD. Functional enrichment analysis revealed that they may mediate the occurrence and progression of PMD by regulating cell apoptosis， ferroptosis and skeletal muscle tissue development and differentiation. Conclusion Ferroptosis genes MUC1， ATF3 and CDKN1A can serve as biomarkers for diagnosing PMD， providing theoretical basis for decoding the pathological mechanism of PMD and developing new drugs.

Key words： sequence analysis， RNA; ferroptosis; computational biology; paraspinal muscles degeneration

腰痛是引起患者運(yùn)動(dòng)功能障礙的主要原因［1］。椎旁肌在支持脊柱的直立姿勢(shì)和動(dòng)態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用［2］。椎旁肌退變（paraspinal muscle degeneration，PMD）可破壞脊柱穩(wěn)定性，引起腰痛［3］。引起椎旁肌退變的原因很多，其中之一是基因差異表達(dá)［4］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，基因表達(dá)失調(diào)通常與人類疾?。òㄗ甸g盤(pán)和椎旁肌退變）的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，基因在介導(dǎo)細(xì)胞死亡、細(xì)胞外基質(zhì)代謝以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4-5］。批量RNA測(cè)序（RNA-seq）是鑒定組織中差異表達(dá)基因（DEGs）并闡明其功能和機(jī)制的常用方法［5］。然而，在PMD中基因的表達(dá)譜尚未確定；基因介導(dǎo)PMD病理機(jī)制的研究還比較有限，缺乏針對(duì)人椎旁肌的RNA測(cè)序研究。因此，全面了解PMD中基因介導(dǎo)的關(guān)鍵病理改變對(duì)診斷和開(kāi)發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。本研究旨在通過(guò)對(duì)人椎旁肌組織進(jìn)行RNA-seq和生物信息學(xué)分析，探究PMD中的基因表達(dá)譜并鑒定關(guān)鍵的鐵死亡相關(guān)基因（FRGs）。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2022年12月—2023年12月就診于天津醫(yī)院微創(chuàng)脊柱外科的腰痛患者6例，其中女4例，男2例；年齡15～67歲，中位年齡41歲。根據(jù)磁共振成像結(jié)果，應(yīng)用Goutellier視覺(jué)半定量評(píng)估方法評(píng)估PMD的嚴(yán)重程度［6］。0級(jí)：肌肉中沒(méi)有任何脂肪條紋；1級(jí)：肌肉內(nèi)有脂肪條紋；2級(jí)：肌內(nèi)顯示多發(fā)灶性脂肪密度，脂肪浸潤(rùn)小于肌肉質(zhì)量；3級(jí)：脂肪浸潤(rùn)大致等于肌肉質(zhì)量；4級(jí)：脂肪浸潤(rùn)大于肌肉質(zhì)量，脂肪沉積超過(guò)50%［6］。將納入研究的患有腰椎間盤(pán)突出癥且需要脊柱外科手術(shù)治療的Goutellier分級(jí)2—4級(jí)患者作為PMD組；將患有急性腰椎間盤(pán)突出癥或脊柱骨折的年輕而無(wú)椎旁肌退變的Goutellier分級(jí)0—1級(jí)患者作為對(duì)照組。排除兼有感染、肺結(jié)核、帕金森病、腫瘤的患者。所有患者均簽署知情同意書(shū)。研究方案獲得天津醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)督與批準(zhǔn)。在L4—5節(jié)段，共收集3個(gè)相對(duì)正常和3個(gè)退變性多裂椎旁肌組織。

1.2 方法

1.2.1 RNA測(cè)序 使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌椎旁肌組織，再用無(wú)菌剪刀清除結(jié)締組織和脂肪組織。使用TRIzol試劑提取總RNA，并評(píng)估RNA純度和完整性。制備RNA-seq文庫(kù)，在上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控 FastQC軟件用于評(píng)估原始數(shù)據(jù)質(zhì)量。BWA軟件用于將干凈的數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比較，以產(chǎn)生序列比對(duì)文件。

1.2.3 基因表達(dá)譜分析 使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段（FPKM）公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用R軟件處理數(shù)據(jù)，通過(guò)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正P值。篩選閾值設(shè)置為|log2（FC）|gt;1，F(xiàn)DRlt;0.05。使用聚類熱圖和火山圖分析PMD中基因表達(dá)模式。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)［7］。首先將DEGs輸入STRING網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org/），下載相關(guān)數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)輸入Cytoscape軟件中。使用Cytoscape軟件的CytoHubba插件的MCC算法鑒別關(guān)鍵的中樞基因。

1.2.5 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 GO包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析可尋找顯著性富集的信號(hào)通路。BP和KEGG可以直接反映基因的潛在功能。

1.2.6 鐵死亡相關(guān)的DEGs鑒定 從FerrDb網(wǎng)站（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）中下載FRGs［5，8］。為鑒定與PMD相關(guān)的FRGs，使用Venn圖將FRGs與RNA-seq獲得的DEGs合并，篩選重疊基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R軟件中的pROC軟件包進(jìn)行受試者工作特征（ROC）曲線分析以預(yù)測(cè)關(guān)鍵FRGs的預(yù)后價(jià)值，并通過(guò)曲線下面積（AUC）評(píng)估基因的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 獲得PMD中基因表達(dá)譜 經(jīng)過(guò)RNA-seq，在PMD中共鑒定出16 536個(gè)基因，見(jiàn)圖1。依據(jù)|log2（FC）|gt;1和FDRlt;0.05的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)292個(gè)DEGs；其中125個(gè)基因顯著下調(diào)，167個(gè)基因顯著上調(diào)。

2.2 獲得PMD中鐵死亡相關(guān)的DEGs 從鐵死亡數(shù)據(jù)庫(kù)FerrDb共下載567個(gè)FRGs，與RNA-seq獲得的292個(gè)DEGs取交集，在PMD中共篩選出14個(gè)鐵死亡相關(guān)的DEGs，見(jiàn)圖2A、表1。如火山圖和條形圖所示，CHAC1、GPT2、SLC40A1、NR1D2、TFRC相關(guān)的DEGs顯著下調(diào)；HILPDA、NDRG1、SESN2、MUC1、STING1、ATF3、GCH1、CDKN1A、SLC2A1相關(guān)的DEGs顯著上調(diào)，見(jiàn)圖2B、C。其中CHAC1在PMD中下調(diào)最明顯，SLC2A1上調(diào)最明顯。

2.3 PPI獲得DEGs中關(guān)鍵的中樞基因 將292個(gè)DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，PPI分析結(jié)果顯示DEGs的前20個(gè)中樞基因（RPS4Y1、UTY、PRKY、USP9Y、EIF1AY、NLGN4Y、KDM5D、ZFY、DDX3Y、CDKN1A、CCL2、HSP90AA1、ICAM1、ATF3、SELE、MUC1、SELP、GADD45A、HSPA1B、PTX3）中有3個(gè)與鐵死亡相關(guān)，分別是MUC1、ATF3和CDKN1A，見(jiàn)圖3。

2.4 DEGs功能富集分析結(jié)果 對(duì)292個(gè)DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，共顯著富集了475條BP以及225條KEGG通路（P＜0.05）。與PMD相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞凋亡、鐵死亡、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)降解、骨骼肌組織發(fā)育、分化等。其中SESN2、MUC1、CDKN1A、NDRG1與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；MUC1、ATF3、CDKN1A與細(xì)胞凋亡有關(guān)；NR1D2、ATF3與骨骼肌組織發(fā)育、分化有關(guān)（圖4A）。SLC40A1、TFRC與鐵死亡有關(guān)（圖4B）。

2.5 確定關(guān)鍵FRGs的診斷價(jià)值 CDKN1A的AUC值、敏感度、特異度、約登指數(shù)為1。ATF3和MUC1的AUC值大于0.85，敏感度為1；提示以上FRGs具有良好的敏感度和特異度，對(duì)PMD具有較高的診斷價(jià)值，可作為診斷PMD的生物標(biāo)志物。見(jiàn)圖5。

3 討論

3.1 PMD的致病機(jī)制與研究現(xiàn)狀 腰痛是一種復(fù)雜的多因素疾病，包括PMD、椎間盤(pán)退變性疾病、脊柱側(cè)后凸等［3， 9-10］。椎旁肌在維持脊柱的運(yùn)動(dòng)和穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，背闊肌和腹部肌群，如腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌、腹橫肌、腹直肌以及腰方肌等也有一定的作用［2-3］。Panjabi［2］提出脊柱穩(wěn)定性依賴于主動(dòng)系統(tǒng)（如椎旁?。?，若其病變可導(dǎo)致脊柱失穩(wěn)，觸發(fā)腰痛。PMD與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括椎間盤(pán)退變［3，10］、矢狀位失衡和脊柱側(cè)凸［9，11］、腰椎滑脫［12］、腰椎管狹窄［13］、肌少癥［14］等。Hey等［9］發(fā)現(xiàn)椎旁肌退變小鼠出現(xiàn)椎間盤(pán)高度降低、椎體楔入和脊柱后凸，表明椎旁肌病變可促使椎間盤(pán)退變和脊柱后凸。Huang等［10］報(bào)告慢性腰痛患者出現(xiàn)PMD的特征為椎旁肌橫截面積降低和脂肪浸潤(rùn)增加；該課題組通過(guò)穿刺腰椎椎間盤(pán)建立大鼠慢性腰痛模型，證明慢性腰痛引起的腰椎間盤(pán)退變可誘導(dǎo)椎旁肌脂肪浸潤(rùn)，促進(jìn)PMD進(jìn)展，這與腫瘤壞死因子（TNF）-α的表達(dá)有關(guān)。Li等［11］證明重度椎旁肌損傷可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，導(dǎo)致肌細(xì)胞壞死、凋亡和異常肌肉生成，肌肉功能喪失，脊柱失穩(wěn)，進(jìn)而加重特發(fā)性脊柱側(cè)彎進(jìn)展。然而，當(dāng)前的治療側(cè)重于緩解癥狀，很少關(guān)注解決腰痛的根本病因和恢復(fù)脊柱的正常生理結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致預(yù)后不佳［15］。PMD的病理機(jī)制在很大程度上仍不清楚。因此，亟需揭示PMD的發(fā)病機(jī)制并開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)，以尋找抑制PMD的新方法。

3.2 PMD與基因差異表達(dá)相關(guān) 基因差異表達(dá)與人類疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，對(duì)調(diào)控復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)至關(guān)重要。研究表明，椎旁肌退變至少部分歸因于基因表達(dá)譜的改變［4］。然而，目前基因介導(dǎo)PMD病理過(guò)程的研究還比較少，缺乏針對(duì)人類椎旁肌組織的RNA-seq研究。在本研究中，筆者通過(guò)RNA-seq鑒定了PMD的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)的基因及其潛在的生物學(xué)功能，為研究PMD的致病機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

3.3 FRGs參與調(diào)控PMD 細(xì)胞是生命的基本組織單位。細(xì)胞死亡，尤其是鐵死亡，是一種鐵依賴的磷脂過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的獨(dú)特細(xì)胞死亡方式，受到多種細(xì)胞代謝的調(diào)控，已被證明與人類多種疾病有關(guān)，在不同的生命形式中均發(fā)揮重要作用［16-17］。王柯等［17］在膝關(guān)節(jié)炎模型大鼠中證實(shí)靶向調(diào)控鐵死亡可以治療骨關(guān)節(jié)炎。然而，鐵死亡在PMD中的研究仍然較少。本研究通過(guò)RNA測(cè)序和生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)14個(gè)FRGs在PMD中差異表達(dá)，其中5個(gè)顯著下調(diào)，9個(gè)顯著上調(diào)。生物信息學(xué)分析揭示鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A是椎旁肌退變過(guò)程中的關(guān)鍵基因，可能參與介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鐵死亡、細(xì)胞凋亡以及骨骼肌組織發(fā)育、分化等。ROC曲線分析也顯示MUC1、ATF3、CDKN1A具有良好的敏感度和特異度，可作為診斷PMD的生物標(biāo)志物。

3.4 MUC1、ATF3、CDKN1A是PMD中的關(guān)鍵FRGs 本研究在PMD中鑒定出關(guān)鍵的鐵死亡基因，但MUC1、ATF3、CDKN1A在PMD中的生物學(xué)功能尚未明確。轉(zhuǎn)錄因子ATF3是一種應(yīng)激反應(yīng)因子，本團(tuán)隊(duì)前期證實(shí)靶向干預(yù)ATF3可通過(guò)抑制鐵死亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡減緩椎間盤(pán)退變［18］。Zhang等［19］報(bào)道ATF3通過(guò)調(diào)節(jié)H2B表達(dá)防止骨骼肌干細(xì)胞過(guò)早激活，進(jìn)而影響肌肉再生。肌肉纖維化是椎旁肌退變的標(biāo)志性病理特點(diǎn)［3］，全基因組關(guān)聯(lián)研究確定CDKN1A是一個(gè)與肌纖維組成相關(guān)的新位點(diǎn)［20］，表明CDKN1A可能參與調(diào)控肌肉纖維化。Chen等［21］在肌少癥患者中發(fā)現(xiàn)11個(gè)鐵死亡相關(guān)的中樞基因，包括CDKN1A，對(duì)肌少癥的診斷顯示出高度的靈敏度和特異度，這與本研究結(jié)果一致。MUC1也被證實(shí)可以有效抑制鐵死亡［22］。綜上所述，MUC1、ATF3、CDKN1A很可能通過(guò)調(diào)控鐵死亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等介導(dǎo)肌肉的再生與修復(fù)，進(jìn)而在PMD中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但是它們?cè)赑MD中的具體功能尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.5 研究局限性 由于本研究測(cè)序的樣本數(shù)量相對(duì)較少可能會(huì)影響結(jié)論的準(zhǔn)確性，因此未來(lái)需要收集更多的臨床樣本來(lái)驗(yàn)證結(jié)論的可推廣性和再現(xiàn)性，同時(shí)還需要通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵鐵死亡基因在PMD中是否差異表達(dá)，以及基因調(diào)控PMD發(fā)生與進(jìn)展的機(jī)制。

綜上所述，本研究收集人椎旁肌組織進(jìn)行RNA測(cè)序，在PMD中共鑒定出292個(gè)差異表達(dá)基因，其中14個(gè)基因與鐵死亡有關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示，鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A是關(guān)鍵的中樞基因，可能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、鐵死亡和骨骼肌組織發(fā)育、分化等。此外，ROC曲線分析顯示它們?cè)谠\斷PMD方面具有良好的特異度和敏感度，可作為診斷PMD的生物標(biāo)志物，從而為解碼PMD的發(fā)病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的藥物提供理論依據(jù)。

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（2024-05-13收稿 2024-05-27修回）

（本文編輯 李鵬）