摘要：目的 探究肝細胞癌（HCC）中抗氧化劑1銅伴侶蛋白（ATOX1）表達的臨床意義及其與腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)系。方法 分析人類基因組圖譜數(shù)據(jù)庫HCC癌組織和正常肝組織ATOX1 mRNA的表達。采用免疫組織化學(xué)染色檢測15例HCC癌和癌旁組織中ATOX1的表達。人肝癌細胞株Hep3B和HepG2分為對照組（NC組）、ATOX1敲低1組（si-ATOX1#1組）和ATOX1敲低2組（si-ATOX1#2組）。通過CCK-8細胞增殖實驗、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗觀察敲低ATOX1對癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響。構(gòu)建裸鼠異種皮下移植瘤模型，分析敲低ATOX1表達對移植瘤質(zhì)量和體積的影響。Western blot檢測移植瘤中Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）通路蛋白表達水平。結(jié)果 生物信息學(xué)分析顯示HCC癌組織中ATOX1 mRNA表達高于癌旁組織（P＜0.05）。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)HCC癌組織中ATOX1蛋白陽性率高于癌旁組織（93.33% vs. 13.33%，P＜0.01）。體外實驗結(jié)果顯示，siRNA敲低Hep3B、HepG2細胞中ATOX1蛋白表達后，癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力均顯著降低（均P＜0.05）。小鼠體內(nèi)實驗中，sh-ATOX1敲低組裸鼠皮下移植瘤的體積和質(zhì)量均顯著小于sh-con組，JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白p-JAK2、p-STAT3、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）及基質(zhì)金屬蛋白酶2表達均下降。結(jié)論 ATOX1能夠通過JAK2/STAT3通路促進HCC的增殖、遷移和侵襲，可能成為潛在的腫瘤標志物和治療靶點。

關(guān)鍵詞：癌，肝細胞；細胞運動；生物標記，腫瘤；抗氧化劑1銅伴侶蛋白；JAK2/STAT3通路

中圖分類號：R735.7 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240221

Mechanism study of ATOX1 promoting biological behavior of hepatocellular carcinoma cells through JAK2/STAT3 pathway

MA Jiajia1， 2， 3， ZHANG Yaping1， 2， 3， YANG Bin2， 3， ZHAO Meiqi2， 4， JIANG Lu5， 6， HUANG Xiaoyu2， 4，"FAN Luchang1， 2， 3， WANG Fengmei5， 6△

1 The Third Central Clinical College of Tianjin Medical University， Tianjin 300170， China; 2 Tianjin Key Laboratory of Extracorporeal Life Support for Critical Diseases; 3 Tianjin Institute of Hepatobiliary Disease; 4 School of Medicine， Nankai University; 5 Tianjin First Central Hospital， the First Central Clinical College of Tianjin Medical University; 6 Tianjin Key Laboratory of Molecular Diagnosis and Treatment of Liver Cancer

△Corresponding Author E-mail： wangfengmeitj@126.com

Abstract： Objective To investigate the clinical significance of the expression of antioxidant 1 copper chaperone protein （ATOX1） in hepatocellular carcinoma （HCC） and its relationship with tumor proliferation， migration and invasion. Methods The expression of ATOX1 mRNA in HCC cancer tissue and normal liver tissue was analyzed using the Human Genome Atlas database. Immunohistochemical experiment was used to detect the expression of ATOX1 in 15 cases of HCC cancer tissue and adjacent tissue. Human HCC cell lines Hep3B and HepG2 were divided into the control group （NC）， the ATOX1 knockdown group 1 （si-ATOX1#1） and the ATOX1 knockdown group 2 （si-ATOX1#2）. The effects of ATOX1 knockdown on the malignant biological behavior of HCC cells were observed through CCK-8 cell proliferation experiment， scratch experiment and Transwell invasion experiments. A nude mouse xenograft tumor model was constructed to analyze the effect of ATOX1 knockdown on the quality and volume of transplanted tumors. Western blot assay was used to detect the relationship between ATOX1 and JAK2/STAT3 pathway protein expression. Results Bioinformatics analysis showed that expression of ATOX1 mRNA in HCC cancer tissue was higher than that in adjacent normal tissue （P＜0.05）. The immunohistochemical staining results showed that the positive rate of ATOX1 protein was higher in HCC cancer tissue than that in adjacent tissue （93.33% vs. 13.33%， P＜0.01）. In vitro experimental results showed that siRNA knockdown of ATOX1 protein expression in Hep3B and HepG2 cells significantly reduced the proliferation， migration and invasion abilities of cancer cells （P＜0.05）. In vivo experiments in mice showed that the volume and weight of subcutaneous xenograft tumors were significantly smaller in the sh-ATOX1 group than those in the sh-con group （P＜0.05）. The expression levels of JAK2/STAT3 pathway-related proteins p-JAK2， p-STAT3， CyclinD1 and MMP2 were significantly lower in the subcutaneous transplanted tumor tissue of the sh-ATOX1 group than that of the sh-con group （P＜0.05）. Conclusion ATOX1 can promote the proliferation， migration and invasion of HCC through JAK2/STAT3 pathway， which can potentially become a potential tumor marker and therapeutic target.

Key words： carcinoma， hepatocellular; cell movement; biomarkers， tumor; antioxidant 1 copper chaperone protein; JAK2/STAT3 pathway

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人類常見惡性腫瘤，全球死亡率第2位，嚴重威脅人類健康［1］。目前HCC的治療以手術(shù)、化療等為主，但中晚期患者預(yù)后仍然較差［2］。研究HCC發(fā)病機制及腫瘤標志物對指導(dǎo)臨床診治至關(guān)重要?？寡趸瘎?銅伴侶蛋白（antioxidant 1 copper chaperone protein，ATOX1）是一種在細胞內(nèi)廣泛表達的銅伴侶蛋白，通過將胞質(zhì)銅結(jié)合并轉(zhuǎn)運到反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的腺苷三磷酸（ATP）酶蛋白上，在銅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［3］。研究表明，乳腺癌［4］、直腸癌［5］等惡性腫瘤中ATOX1均表達上調(diào)，其能夠減少癌細胞中活性氧產(chǎn)生，促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和NADPH氧化酶亞基p47的表達，促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。Jacus相關(guān)激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路激活是影響HCC發(fā)生發(fā)展的重要機制，該通路能夠促進肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及惡性增殖和轉(zhuǎn)移［6-7］。目前HCC中ATOX1的表達及其與臨床病理特征、預(yù)后及發(fā)生機制的關(guān)系仍不明確。本研究通過檢測HCC中ATOX1的表達，分析其與HCC患者臨床病理特征、預(yù)后及JAK2/STAT3通路的關(guān)系，為HCC的早期診斷和治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系、實驗動物及人體標本 人肝癌細胞株Hep3B和HepG2購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司；4周齡SPF級BALB/c裸鼠12只，體質(zhì)量13.1～17.6 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度60%±5%，光照條件為明暗各12 h循環(huán)交替，自由攝食飲水，實驗動物使用許可證號：SYXK（津）2020-0008。本研究動物實驗已獲南開大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會批準（編號2023-SYDWLL-000204）。HCC癌及癌旁組織（距離腫瘤邊緣2 cm以上）樣本來源于2022年1月—2023年10月在天津市第三中心醫(yī)院就診的15例HCC患者，男10例，女5例；年齡33～76歲，平均（56.12±6.89）歲；腫瘤TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期6例，Ⅲ期3例；病理分化程度：高分化4例，中分化6例，低分化5例。人體標本使用經(jīng)天津市第三中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準［編號SZX-IRB-SOP-016（F）-001-03］。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清（FBS）購自美國Gibco；Lipofectamine 2000、兔源ATOX1抗體購自美國Invitrogen；RIPA緩沖液和磷酸酶抑制劑均購自北京康為世紀生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；Bis-Tris PAGE試劑購自賽默飛世爾科技有限公司（上海）；PVDF膜購自美國Millipore；兔源Cyclin D1、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、β-actin抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗體購自美國Cell Signaling Technology；CCK-8試劑、4%多聚甲醛和1%結(jié)晶紫染色液均購自北京索萊寶科技有限公司；基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences；Transwell小室購自美國Corning公司；二步法免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。BX51型Leica顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 采用R語言（4.2.1版）分析美國癌癥和腫瘤基因圖譜（TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫中374例HCC癌組織和50例正常肝組織中ATOX1 mRNA表達差異。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 15例HCC癌及癌旁組織樣本經(jīng)固定、包埋后，制成切片，經(jīng)脫蠟、水化后，進行抗原修復(fù)并封閉，4 ℃下與ATOX1一抗（稀釋比1∶4 000）孵育過夜，37 ℃下與酶標二抗孵育45 min。DAB顯色20 s后脫水封片。采用Leica顯微鏡進行圖像的采集。采用半定量免疫組化評分評估組織ATOX1的染色情況，染色強度評分：0為無染色，1為淡黃色，2為深黃色，3為黃褐色；染色面積評分：＜10%為1分，10%～24%為2分，25%～49%為3分，≥50%為4分。上述評分乘積＞2分為陽性，≤2分為陰性。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Hep3B和HepG2細胞株在含有10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L）的MEM培養(yǎng)基，37 ℃和5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合率達70%～80%時采用0.25%胰酶進行消化傳代。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說明進行。委托蘇州吉瑪基因生物科技公司設(shè)計合成2條人ATOX1基因siRNA序列。si-ATOX1#1正義鏈為GCACGAGUUCUCUGUGGACTT，反義鏈為GUCCACAGAGAACUCGUGCTT；si-ATOX1#2正義鏈為CCAACAAGAAGGUCUGCAUTT，反義鏈為AUGCAGACCUUCUUGUUGGTT。將Hep3B和HepG2細胞分別分為3組：對照組（NC組）、ATOX1敲低1組（si-ATOX1#1組）和ATOX1敲低2組（si-ATOX1#2組）。siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blot檢測ATOX1表達 RIPA裂解液裂解細胞后，BCA法測定樣品蛋白濃度，加入Loading Buffer后金屬浴100 ℃ 5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，ATOX1一抗（1∶1 000）在4 ℃條件下孵育過夜，加入HRP標記的二抗（1∶10 000）并室溫孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑后，利用FluorChem HD2系統(tǒng)對條帶曝光，Image J軟件進行灰度值分析，β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白表達量。目的蛋白表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8增殖及劃痕實驗 收集轉(zhuǎn)染si-ATOX1#1、#2的Hep3B和HepG2細胞，按每孔3×103個細胞的密度接種至96孔板中，在孵育不同時間點（0、12、24、36、48 h），每孔加入10 μL CCK-8溶液，2 h后用酶標儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值。各組實驗均設(shè)置4個復(fù)孔，整個實驗過程重復(fù)3次。劃痕實驗：將細胞接種于6孔板，細胞密度達90%時用200 μL移液管尖端劃痕，0、24 h拍照并記錄劃痕寬度，計算劃痕愈合率。細胞劃痕愈合率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell侵襲實驗 將基質(zhì)膠與培養(yǎng)基按1∶8比例混合，4 ℃靜置2 h，以每孔50 μL鋪到Transwell小室上室，37 ℃孵育2 h，將1×105的無血清細胞懸液注入Transwell小室上室中，下室加含20 %胎牛血清的培養(yǎng)基0.5 mL，24 h后用4%多聚甲醛固定20 min，用1%結(jié)晶紫染色5 min，鏡下拍照。

1.2.7 慢病毒感染 sh-ATOX1慢病毒由蘇州吉瑪基因生物科技公司設(shè)計并包裝。ATOX1 shRNA序列正義鏈：CCGGT GGAGGAGTTAAGTATGACATCTCGAGATGTCATACTTAACTCCTCCATTTTTG；反義鏈：AATTCAAAAATGGAGGA GTTAAGTATGACATCTCGAGATGTCATACTTAACTCCTCCA。將sh-con和sh-ATOX1病毒加入HepG2細胞中，6 h后換液，加入2 000 μg/L的嘌呤霉素篩選48 h，構(gòu)建HepG2細胞的sh-con和sh-ATOX1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，分為對照組（sh-con組）和ATOX1敲低組（sh-ATOX1組）。4 d后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.8 裸鼠皮下成瘤模型 將裸鼠分為對照組（sh-con組）和ATOX1敲低組（sh-ATOX1組），每組6只。收集生長狀態(tài)良好、匯合度約90%的sh-con和sh-ATOX1 HepG2細胞，每只腋下皮下注射5×106個細胞懸液。皮下成瘤9 d可觸及皮下瘤塊時，每3 d測量1次腫瘤體積，成瘤24 d時，脫臼法處死動物，留取瘤塊，稱質(zhì)量并拍照。

1.2.9 Western blot檢測裸鼠移植瘤中JAK2/STAT3通路蛋白表達 參照1.2.4中的步驟檢測sh-con組和sh-ATOX1組中ATOX1、Cyclin D1、MMP2、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPadPrism 8.0和R（4.2.1版）進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（[x]±s）表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC癌和癌旁組織中ATOX1 mRNA和蛋白表達 TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，HCC癌組織中ATOX1 mRNA表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（5.98±0.81 vs. 4.85±0.49，U＝2 066.126，P＜0.01）。免疫組化染色結(jié)果顯示，ATOX1蛋白陽性染色位于細胞漿和細胞膜，見圖1。HCC癌組織中ATOX1蛋白陽性率為93.33%（14/15），高于癌旁組織13.33%（2/15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

ATOX1蛋白表達（×400）]2.2 敲低ATOX1表達抑制HCC癌細胞的增殖、遷移能力 與NC組比較，敲低Atox1基因后ATOX1蛋白表達量下降，HepG2和Hep3B細胞的增殖和遷移能力均顯著降低（P＜0.05）。見圖2—4，表1、2。

2.3 敲低ATOX1表達抑制HCC癌細胞的侵襲能力 Transwell實驗結(jié)果顯示，敲低ATOX1表達后，癌細胞的侵襲能力均顯著降低（P＜0.05），見表2、圖5。

2.4 敲低ATOX1抑制小鼠皮下移植瘤形成 在HepG2細胞系中，與sh-con組比較，敲低Atox1基因的細胞中ATOX1蛋白表達量降低（0.83±0.06 vs. 0.33±0.03，t=18.257，P＜0.05），見圖6。構(gòu)建裸鼠HCC異種皮下移植瘤模型6周后，sh-ATOX1敲低組皮下移植瘤的體積、質(zhì)量均小于sh-con組（P＜0.05）。見圖7、8腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積比較][A][B]2.5 敲低ATOX1表達對JAK2/STAT3通路的抑制作用 Western blot結(jié)果顯示，相比于sh-con組，sh-ATOX1組皮下移植瘤組織中ATOX1、CyclinD1、MMP2、p-JAK2及p-STAT3蛋白的相對表達水平均下降（P＜0.01）。見圖9、表3。

3 討論

我國HCC防治形勢嚴峻，中國人群肝癌發(fā)病率為14.80/10萬，死亡率為14.80/10萬［8］。目前傳統(tǒng)臨床檢測手段主要為影像學(xué)、血清學(xué)以及病理學(xué)的判斷，但這些手段特異度不高、敏感度較差，難以實現(xiàn)實時動態(tài)評估［9］。因此亟待開發(fā)新型肝癌標志物用于肝癌診斷、預(yù)后預(yù)測及治療效果監(jiān)測。

銅死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的新的細胞死亡機制。ATOX1具有銅結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其能將與胞質(zhì)銅離子特異性結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運蛋白1轉(zhuǎn)運到高爾基體中，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)銅濃度，維持細胞銅穩(wěn)態(tài)，減少銅離子的細胞毒性［10］。有研究表明，ATOX1在人類多種惡性腫瘤中高度表達，并作為一種銅依賴性轉(zhuǎn)錄因子促進Cyclin D1和NADPH氧化酶p47phox的表達及癌細胞增殖和活性氧的產(chǎn)生［11］。本研究中，HCC患者癌組織中ATOX1在mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)，提示ATOX1的表達與HCC的腫瘤發(fā)生有關(guān)。分析其原因，p53基因突變會導(dǎo)致癌細胞中ATOX1的表達上調(diào)，癌細胞凋亡顯著減少，促進腫瘤的發(fā)生；而在外源性過表達P53蛋白后，ATOX1的表達顯著下調(diào)，癌細胞的增殖能力減弱，同時對放化療介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能力減弱，導(dǎo)致腫瘤惡性進展［12］。本研究在HCC體外實驗中提示，HCC中ATOX1的表達上調(diào)能夠促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移，促進HCC癌細胞的惡性生物學(xué)行為。有研究表明，ATOX1的表達上調(diào)能夠促進乳腺癌細胞系MDA-MB-231中銅轉(zhuǎn)運蛋白α鏈和賴氨酰氧化酶的表達，促進癌細胞的侵襲和遷移，導(dǎo)致腫瘤惡性進展；而在沉默癌細胞中ATOX1的表達后，癌細胞的遷移和侵襲能力顯著降低［13］。此外，還有一些研究報道，癌細胞中高水平的銅離子可誘導(dǎo)ATOX1表達，ATOX1進入細胞核后靶向結(jié)合DNA，損傷檢查點蛋白調(diào)節(jié)子1的啟動子，以銅依賴的方式促進DNA損傷檢查點蛋白調(diào)節(jié)子1的轉(zhuǎn)錄，增強放化療過程中癌細胞的DNA雙鏈損傷修復(fù)，促進癌細胞對放化療的抵抗性，降低術(shù)后輔助放化療效果，導(dǎo)致不良預(yù)后［14-15］。由此可知，HCC中ATOX1是一種癌基因，其異常表達上調(diào)促進HCC腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可作為評估患者預(yù)后的潛在腫瘤標志物。

HCC癌細胞的分化、增殖和遷移、侵襲等生物學(xué)過程受JAK2/STAT3等多種細胞信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控［16］。本研究中，在敲低HepG2細胞中ATOX1的表達后，小鼠皮下移植瘤生長顯著受到抑制，且JAK2/STAT3信號通路的關(guān)鍵蛋白p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1及MMP2明顯下調(diào)，提示ATOX1可能通過激活HCC中JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮促進HCC腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)效應(yīng)。有研究報道，ATOX1的表達上調(diào)促進癌細胞中銅轉(zhuǎn)運功能，賴氨酰氧化酶活性升高，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Suv39h1和核因子-κB的負調(diào)控因子腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3表達上調(diào)，引起白細胞介素（IL）-6等促炎細胞因子表達增加，IL-6等結(jié)合并激活其受體，導(dǎo)致JAK2/STAT3信號通路的過度激活，促進癌細胞的增殖和侵襲［17-18］。另外，JAK2的磷酸化激活能夠促進STAT3以二聚體的形式結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，增殖分子細胞核糖體S6蛋白激酶和遷移分子MMP2、MMP9表達上調(diào)，促凋亡分子胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的蛋白水平表達下調(diào)，進一步促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡［19］。有研究者發(fā)現(xiàn)，銅螯合劑或敲低ATOX1可降低細胞銅離子的生物可利用水平，轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達上調(diào)，干擾鉑類化療藥物（如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑）的細胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運過程，增強癌細胞對鉑類化療藥物的敏感性，是潛在的腫瘤治療的標志物［20］。因此，ATOX1有可能成為HCC的潛在治療靶點。

綜上所述，HCC中ATOX1表達上調(diào)且通過激活JAK2/STAT3通路促進HCC的增殖、遷移和侵襲，可能成為潛在的腫瘤標志物和治療靶點。但本研究納入的臨床樣本量較少以及ATOX1在調(diào)控HCC中JAK2/STAT3通路的具體作用機制尚不清楚。因此，今后需開展大樣本、前瞻性的臨床研究進一步探索ATOX1的臨床預(yù)后意義并為HCC的治療和開發(fā)新的治療策略提供更為堅實的理論基礎(chǔ)。

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（2024-02-21收稿 2024-04-17修回）

（本文編輯 胡小寧）