摘要：目的 探討山萘酚（KAE）對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu功能的影響。方法 采用KAE處理Bel-7402/5-Fu細(xì)胞，將細(xì)胞分為對(duì)照組和藥物組（0.064、0.320、1.600、8、40、200 μmol/L KAE）；根據(jù)干擾DNA依賴性激酶催化亞基（DNA-PKcs）、加入蛋白酶體抑制劑MG132或加入自噬抑制劑CQ，將細(xì)胞分為si-NC組和DNA-PKcs干擾（siRNA-1664、siRNA-2142、siRNA-3785）組，對(duì)照組、KAE組和KAE+si-DNA-PKcs組，對(duì)照組、KAE+DMSO組、KAE+MG132組和KAE+CQ組。采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot檢測組蛋白H2AX磷酸化（γ-H2AX）、DNA-PKcs、DNA雙鏈斷裂修復(fù)/V（D）J重組蛋白（Artemis）和藥泵基因（P-gp）mRNA和蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測DNA-PKcs蛋白穩(wěn)定性，免疫共沉淀檢測DNA-PKcs蛋白泛素化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，8 μmol/L KAE處理細(xì)胞24 h可抑制約50%的細(xì)胞增殖能力，選擇此時(shí)間和濃度進(jìn)行后續(xù)研究。與對(duì)照組相比，KAE組γ-H2AX mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，DNA-PKcs、Artemis和P-gp mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，KAE促進(jìn)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，增加細(xì)胞凋亡；與si-NC組相比，siRNA-1664能顯著下調(diào)DNA-PKcs mRNA和蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）；與KAE組相比，KAE+si-DNA-PKcs組進(jìn)一步促進(jìn)了KAE對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)；與對(duì)照組相比，KAE+DMSO組DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與KAE+DMSO組相比，KAE+MG132組DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而KAE+CQ組DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，KAE+DMSO組促進(jìn)DNA-PKcs蛋白的泛素化，而KAE+MG132組則可抑制其泛素化（P＜0.05）。結(jié)論 KAE能夠誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。

關(guān)鍵詞：癌，肝細(xì)胞；山萘酚；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；Bel-7402/5-Fu；DNA-PKcs

中圖分類號(hào)：R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231828

Study on the effect and mechanism of kaempferol in reversing drug-resistant

Bel-7402/5-Fu cells

LIANG Damin， YANG Zhengjiu， ZHANG Ziping， QIAN Jing， MAO Chaokun

Department of Medical Technology， Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi 563003， China

Abstract： Objective To investigate the effect of kaempferol （KAE） on the function of drug-resistant Bel-7402/5-Fu cells. Methods Bel-7402/5-Fu cells were treated with KAE， and cells were divided into the control group and the drug group （0.064， 0.320， 1.600， 8， 40， 200 μmol/L KAE）. Cells were divided into the si-NC group and the DNA-PKcs interference group， or the control group， the KAE group， the KAE+si-DNA-PKcs group or the KAE+DMSO group， the KAE+MG132 group and the KAE+CQ group based on interfering DNA dependent kinase catalytic subunits （DNA-PKcs） or addition of proteasome inhibitor MG132 or autophagy inhibitor CQ. Cell proliferation was detected using CCK-8. The expression level of histone H2AX phosphorylation （γ-H2AX）， DNA-PKcs， DNA double strand break repair/V（D）J recombinant protein （Artemis） and drug pump gene （P-gp） were analyzed using real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blot assay. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The stability of DNA-PKcs proteins was analyzed by protein stability experiments. Ubiquitination of DNA-PKcs protein was evaluated by immunoprecipitation assay. Results Compared to the control group， treating cells with 8 μmol/L KAE" for 24 h inhibited about 50% of cell proliferation ability. Therefore， this time and concentration were chosen for subsequent research. Compared to the control group， the expression level of γ-H2AX mRNA and protein significantly increased， while expression levels of DNA-PKcs， Artemis and P-gp mRNA and proteins significantly decreased in the KAE group （P＜0.05）. Compared to the control group， KAE promoted cell cycle arrest in the G2/M phase of Bel-7402/5-Fu cells and increased cell apoptosis. Compared to the si-NC group， siRNA-1664 significantly downregulated the mRNA and protein expression levels of DNA-PKcs （P＜0.05）. Compared with the KAE group， the effect of KAE was further promoted in the KAE+si-DNA-PKcs group of Bel-7402/5-Fu cells. Compared with the control group， the protein expression level of DNA-PKcs decreased in the KAE+DMSO group （P＜0.05）. Compared with the KAE+DMSO group， the protein expression level of DNA-PKcs increased in the KAE+MG132 group （P＜0.05）， while there was no significant change in the protein expression level of DNA-PKcs in the KAE+CQ group （P＞0.05）. Compared to the control group， there was promoted ubiquitination of DNA-PKcs in the KAE+DMSO group， and the inhibited ubiquitination in the KAE+MG132 group （P＜0.05）. Conclusion KAE may induce cell apoptosis and cell cycle arrest in drug-resistant Bel-7402/5-Fu cells.

Key words： carcinoma， hepatocellular; kaempferol; apoptosis; cell cycle; Bel-7402/5-Fu; DNA-PKcs

耐藥是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）化療失敗的主要原因［1］。DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)是腫瘤耐藥的分子機(jī)制之一。DNA依賴性激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）是DNA-PK的催化亞單位，參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能［2-3］。DNA-PKcs靶向小分子抑制劑（如NU7441［4］、AZD7648［5］）是一種有效的放射增敏劑，已成為化療耐藥腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。由于DNA-PKcs小分子抑制劑在體內(nèi)代謝不穩(wěn)定，如血清半衰期短、溶解性差等限制了其應(yīng)用。因此，研發(fā)更好的DNA-PKcs抑制劑是獲得有效抗腫瘤耐藥性藥物的關(guān)鍵。山萘酚（Kaempferol，KAE）是一種天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用［6］，是一種潛在的DNA-PKcs抑制劑。研究顯示，KAE可降低HL-60細(xì)胞中DNA修復(fù)相關(guān)蛋白（14-3-3σ、DNA-PK等）的表達(dá)，誘導(dǎo)DNA損傷，進(jìn)而影響早幼粒細(xì)胞白血病的進(jìn)展［7］。KAE增加肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的化學(xué)敏感性，并具有一定的化學(xué)致敏作用［8］。但目前在HCC中KAE與DNA-PKcs之間的關(guān)系及分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討KAE是否通過調(diào)控DNA-PKcs表達(dá)抑制肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu的功能，為臨床治療HCC化療耐藥提供新的策略和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 Bel-7402/5-Fu細(xì)胞由遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院范芳教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（FBS）和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；二甲亞砜（DMSO）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）和KAE購自Solarbio公司；環(huán)己酰胺（CHX）、蛋白酶體抑制劑（MG132）和氯喹（CQ）購自美國MedChemExpress；一抗組蛋白H2AX磷酸化（γ-H2AX）、DNA-PKcs、DNA雙鏈斷裂修復(fù)/V（D）J重組蛋白（Artemis）、藥泵基因（P-gp）、GAPDH、Ub以及羊抗兔二抗IgG（HRP）和羊抗鼠IgG（HRP）購自英國Abcam公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和beyoECL超敏發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磁珠A/G購自美國Bimake公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司；siRNA合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。CO2培養(yǎng)箱（MCO-175）購自日本Panasonic；連續(xù)波長酶標(biāo)儀（Synergy HTX S1LFA）購自美國Bio-Tek；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）儀（CFX96）購自美國Biorad；電泳儀（EPS300）購自上海天能科技有限公司；核酸定量儀（Nanodrop Lite）購自美國Thermo；低溫離心機(jī)（Allegrax-X30R）購自美國Beckman；超聲破碎儀（VCX150）購自美國Sonics；流式細(xì)胞儀（BD FACSVerse）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Bel-7402/5-Fu細(xì)胞于含10%胎牛血清、2 mg/L 5-Fu的RPMI 1640培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每天換液1次，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用DMSO將KAE溶解為10 mmol/L的工作液，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至終濃度為0.064、0.320、1.600、8、40、200 μmol/L，將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同藥物濃度處理組，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，篩選確定KAE最佳作用濃度和時(shí)間，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將Bel-7402/5-Fu細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，用無血清的新鮮培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞3 h，以使細(xì)胞饑餓。對(duì)于DNA-PKcs基因敲除，將細(xì)胞分為si-NC組和3個(gè)DNA-PKcs干擾（siRNA-1664、siRNA-2142和siRNA-3785）組。參照LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，干擾序列見表1。采用RT-qPCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，確定最佳DNA-PKcs干擾序列。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期Bel-7402/5-Fu細(xì)胞制成密度為1×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)16 h。待細(xì)胞貼壁后，各實(shí)驗(yàn)組分別加入0.064、0.320、1.600、8、40、200 μmol/L KAE，每種濃度設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，以不加藥物為對(duì)照組，無細(xì)胞為空白組。分別培養(yǎng)0、24、48或72 h后，用酶標(biāo)儀測定各孔在波長450 nm處的光密度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞分成對(duì)照組和KAE組，si-NC組和DNA-PKcs干擾組，對(duì)照組、KAE組和KAE+siDNA-PKcs組，分別預(yù)處理后，收集細(xì)胞并重懸。4×103個(gè)/mL細(xì)胞鋪在96孔板（200 μL/孔）中，12 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入胰蛋白酶（無EDTA）消化細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次。按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作：加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，加入10 μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞分組同1.2.4，分別預(yù)處理細(xì)胞后，制備成5×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作：細(xì)胞懸液中加入1 mL預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定30 min，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，1 000×g離心5 min。加入500 μL PI混合染色液，重懸細(xì)胞沉淀，于37 ℃避光溫浴30 min。流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測細(xì)胞周期。

1.2.6 RT-qPCR檢測細(xì)胞中DNA-PKcs、Artemis、γ-H2AX和P-gp mRNA的表達(dá) 將Bel-7402/5-Fu細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，分組同1.2.4，分別預(yù)處理細(xì)胞后，使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系（總體積20 μL）：上、下游引物各1 μL，2×SYBR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase free water 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表2。

1.2.7 Western blot檢測DNA-PKcs、Artemis、γ-H2AX和P-gp蛋白的表達(dá) 將Bel-7402/5-Fu細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，除同1.2.4分組外，另設(shè)對(duì)照組、KAE+DMSO組、KAE+CQ組和KAE+MG132組。KAE預(yù)處理細(xì)胞18 h后，使用10 μmol/L MG132或50 μmol/L CQ繼續(xù)處理6 h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷無菌PBS洗滌3次，直接加入500 μL預(yù)冷RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，并根據(jù)BCA定量試劑盒進(jìn)行定量，加入蛋白上樣緩沖液100 ℃變性10 min，于-80 ℃保存。利用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫下?lián)u床封閉1.5 h，加入一抗γ-H2AX（1∶1 000），DNA-PKcs（1∶1 000），Artemis（1∶800），P-gp（1∶1 000），GAPDH（1∶10 000），于4 ℃過夜孵育，TBST洗滌3次后，PVDF膜加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）和羊抗兔IgG（1∶10 000）于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次。隨后使用beyoECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行底物顯色，使用Image J分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測定DNA-PKcs蛋白的翻譯情況 將Bel-7402/5-Fu細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)對(duì)照組和KAE組，處理細(xì)胞24 h后，加入100 mg/L的環(huán)己酰亞胺（CHX）分別處理0、2、4 h，采用Western blot檢測DNA-PKcs蛋白表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測DNA-PKcs蛋白的泛素化 將Bel-7402/5-Fu細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)對(duì)照組、KAE+DMSO組和KAE+MG132組。KAE預(yù)處理細(xì)胞18 h后，使用10 μmol/L MG132繼續(xù)處理6 h，收集細(xì)胞。用預(yù)冷無菌PBS洗滌細(xì)胞3次，各組中加入500 μL預(yù)冷IP裂解液，在冰上裂解30 min，12 000×g離心5 min，收集各組細(xì)胞裂解上清液，與DNA-PKcs抗體在4 ℃下溫和旋轉(zhuǎn)過夜孵育。然后將40 μL磁珠A/G加入混合物中，在4 ℃溫和旋轉(zhuǎn)孵育4 h。隨后，置于磁力架，留磁珠，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入蛋白上樣緩沖液100 ℃變性10 min，于-80 ℃保存。通過SDS-PAGE分離蛋白，利用一抗Ub抗體（1∶1 000）和二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）進(jìn)行Western blot檢測DNA-PKcs泛素化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差[（[x] ±s）]表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KAE對(duì)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞DNA損傷修復(fù)和耐藥基因的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，KAE濃度不高于1.600 μmol/L時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞無明顯毒性作用；8、40和200 μmol/L組培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)細(xì)胞存活率均低于培養(yǎng)0 h時(shí)；KAE濃度為8 μmol/L培養(yǎng)24 h時(shí)，細(xì)胞存活率約為50%，選擇此條件進(jìn)行后續(xù)研究，見表3。RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KAE組γ-H2AX mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，DNA-PKcs、Artemis和P-gp mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，見圖1、表4。

2.2 KAE對(duì)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比，KAE組細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞周期G0/G1期比例降低，G2/M期升高（P＜0.05），S期無明顯變化（P＞0.05），見圖2、3，表5。

2.3 干擾DNA-PKcs對(duì)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 與si-NC組相比，siRNA-1664、siRNA-2142和siRNA-3785組DNA-PKcs mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，以siRNA-1664組變化較為顯著，選擇siRNA-1664用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見表6、圖4。與si-NC組相比，DNA-PKcs干擾組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；細(xì)胞周期G0/G1期比例無明顯變化（P＞0.05），S期比例升高，G2/M期比例降低（P＜0.05），見表7，圖5、6。

2.4 KAE與DNA-PKcs對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比，KAE組γ-H2AX mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，P-gp、DNA-PKcs和Artemis mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與KAE組相比，KAE+siDNA-PKcs組P-gp、DNA-PKcs和Artemis mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，而γ-H2AX表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖7、表8。

2.5 KAE通過促進(jìn)DNA-PKcs的泛素化降解下調(diào)DNA-PKcs蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KAE組DNA-PKcs蛋白的穩(wěn)定性降低（P＜0.05），見表9。與對(duì)照組相比，KAE+DMSO組DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與KAE+DMSO組相比，KAE+MG132組DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），KAE+CQ組DNA-PKcs蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），見表10、圖8。免疫共沉淀結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，KAE+DMSO組DNA-PKcs泛素化（Ub）水平升高；與KAE+DMSO組相比，KAE+MG132組Ub蛋白表達(dá)水平降低，見表10、圖9。

3 討論

HCC是致命的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，放化療是其首選治療策略，但后期治療極易發(fā)生耐藥，導(dǎo)致治療效果不佳。KAE是一種四羥基類黃酮，存在于許多水果、蔬菜和藥用植物中［9］，具有抗氧化、抗腫瘤和心臟保護(hù)等功能。研究發(fā)現(xiàn)KAE與其他化療藥物聯(lián)合使用可提高腫瘤的化療療效，預(yù)防腫瘤多藥耐藥。例如，KAE聯(lián)合5-Fu可誘導(dǎo)5-Fu抗性結(jié)腸癌細(xì)胞LS174的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，減少細(xì)胞遷移和侵襲［10］。由此筆者推測KAE可能具有誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞的功能。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KAE顯著上調(diào)DNA損傷標(biāo)志基因γ-H2AX水平，下調(diào)DNA損傷修復(fù)基因DNA-PKcs、Artemis和耐藥泵基因P-gp水平。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)KAE可誘導(dǎo)肝癌Bel-7402/5-Fu細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，提示KAE可能通過抑制DNA損傷修復(fù)基因DNA-PKcs和Artemis的表達(dá)而促進(jìn)DNA損傷，或通過抑制Bel-7402/5-Fu細(xì)胞中藥泵基因P-gp的水平來提高細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性；KAE可能是肝癌耐藥患者治療的增敏劑，因此可作為潛在候選藥物。

DNA-PKcs是輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是癌癥治療的新干預(yù)靶點(diǎn)。敲除DNA-PKcs可顯著增加小鼠模型中的腫瘤易感性［11］。此外，用各種抑制劑靶向DNA-PKcs也可以有效增強(qiáng)放療效果，也是改善癌癥患者預(yù)后的有效策略［12］。然而，抑制DNA-PKcs是否會(huì)影響耐藥肝癌細(xì)胞的生長仍不清楚。因此，本研究利用小干擾RNA干擾DNA-PKcs，探討DNA-PKcs對(duì)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。本研究結(jié)果表明，與si-NC組相比，干擾DNA-PKcs可以促進(jìn)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞的DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，因此抑制或干擾DNA-PKcs可能是耐藥腫瘤的一種潛在的化療策略。本研究還發(fā)現(xiàn)， KAE也能誘導(dǎo)細(xì)胞的DNA損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，筆者推測KAE可能通過調(diào)控DNA-PKcs途徑而影響B(tài)el-7402/5-Fu細(xì)胞功能。本研究顯示，KAE顯著上調(diào)γ-H2AX水平，下調(diào)P-gp、DNA-PKcs和Artemis水平；而干擾DNA-PKcs會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)KAE對(duì)Bel-7402/5-Fu細(xì)胞的作用。這些結(jié)果提示KAE可能通過下調(diào)DNA-PKcs水平來促進(jìn)DNA損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)通過自噬-溶酶體和泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解［13］。DNA-PKcs可以高度泛素化，降解細(xì)胞質(zhì)DNA-PKcs，降低細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核DNA-PKcs的含量，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等先天免疫功能［14］。阿霉素處理可上調(diào)RNF144A的表達(dá)，上調(diào)的RNF144A則進(jìn)一步促進(jìn)DNA-PKcs發(fā)生泛素化，并降低DNA-PKcs水平，從而誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的凋亡［15］。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（MTA1）通過蛋白酶體介導(dǎo)DNA-PK降解，并抑制H1.2磷酸化，從而促進(jìn)HuH6細(xì)胞中的HCC進(jìn)展［16］?；诖?，筆者推測KAE也可能通過Bel-7402/5-Fu細(xì)胞中的蛋白酶體介導(dǎo)DNA-PKcs的降解。

綜上所述，KAE可以顯著增加DNA-PKcs的泛素化，下調(diào)DNA-PKcs蛋白水平。此外，KAE可顯著上調(diào)γ-H2AX水平，下調(diào)Artemis和P-gp水平，最終共同促進(jìn)耐藥Bel-7402/5-Fu細(xì)胞的DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而影響細(xì)胞生長。

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（2023-12-22收稿 2024-04-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）