關(guān)鍵詞：蘋果綿蚜；高溫：16SrDNA;共生細(xì)菌；多樣性；適合度

蘋果綿蚜（Eriosoma lanigerum）隸屬半翅目（Hemiptera）癭綿蚜科（Pemphigidae），為害蘋果、海棠、山荊子、花紅、沙果、山楂、梨等植物，主要以成蚜和2～4齡若蚜在傷疤、剪鋸口及新生葉腋等部位刺吸為害，導(dǎo)致樹勢削弱，影響成花、結(jié)果，甚至造成整株果樹死亡。蘋果綿蚜最先在北美洲東部發(fā)生，近年來已傳播擴(kuò)散至全球70多個國家和地區(qū)以及我國山東、甘肅和新疆等地，據(jù)報道，該蟲在煙臺蘋果產(chǎn)區(qū)造成的年產(chǎn)量損失達(dá)10000t以上，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的影響。

昆蟲體內(nèi)有多種共生細(xì)菌，與宿主多種生物學(xué)特性密切相關(guān)，有研究表明，共生細(xì)菌可提高宿主消化、解毒和免疫能力，還會影響宿主的生殖方式、適合度、運(yùn)動行為和抗藥性等。對豌豆蚜（Acyrthosiphon pi-sum）的研究發(fā)現(xiàn)，共生沙雷氏菌（Serratia symbiot-ica）可降解吡蟲啉、毒死蜱、氟蟲腈等多種殺蟲劑，以幫助宿主提高解毒代謝能力．體內(nèi)的其他共生菌還會在宿主轉(zhuǎn)移至新寄主的過程中促使新生物型的形成，以快速適應(yīng)新的環(huán)境：在桔小實(shí)蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，密歇根克雷伯氏菌BD177可激活精氨酸和脯氨酸代謝途徑，提高宿主抵抗低溫脅迫的能力，以適應(yīng)多種環(huán)境。

蘋果綿蚜在田間一年有兩個發(fā)生高峰，5月上旬-7月上旬為全年最高峰，8月為發(fā)生低谷期，9月初-10月底為第2個小高峰。本課題組多年的調(diào)查顯示，該蟲的發(fā)生規(guī)律與溫度密切相關(guān)，在較為涼爽的4-5月繁殖速度快，5-7月種群數(shù)量達(dá)到最高峰，8月田間溫度過高，種群數(shù)量降低，9月后溫度逐漸下降，出現(xiàn)第2個小高峰：室內(nèi)研究也驗(yàn)證了這一結(jié)果，蘋果綿蚜在25℃時有最高的內(nèi)稟增長率（0.30+0.01）和凈增殖率（127.3+13.3），而溫度達(dá)到35℃時，會在7d內(nèi)全部死亡。當(dāng)前研究僅表明高溫不利于蘋果綿蚜的生長發(fā)育，而造成這一現(xiàn)象的原因鮮有報道。

基于文獻(xiàn)報道和前期研究，我們推測蘋果綿蚜體內(nèi)的某些共生細(xì)菌參與高溫降低其適合度。為驗(yàn)證這一推測，本研究利用基于Illumina MiSeq平臺的細(xì)菌16SrDNA高通量測序技術(shù)，研究23、28℃和30℃處理后蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌的物種組成和變化，旨在揭示高溫對蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌的影響，為解析共生細(xì)菌在宿主抵御環(huán)境脅迫時的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx的飼養(yǎng)、處理及取樣

蘋果綿蚜于2018年采自煙臺蘋果園，接種在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)栽培的一年生紅富士蘋果苗木上，在人工氣候室里飼養(yǎng)，溫度（23+2）℃、光周期14L：8D、相對濕度60%～80%。選取一頭蘋果綿蚜轉(zhuǎn)接到另一株蘋果苗上，將單頭轉(zhuǎn)接成功的苗木分別置于23、28℃和30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。

取樣時用滅菌小毛筆將各齡期蘋果綿蚜從蘋果苗上掃下，清除蟲體表面的棉絮狀物后，用75%酒精浸泡20s，用無菌水沖洗3次，將蟲體轉(zhuǎn)移到1.5mL的滅菌PCR管中，同溫度下齡期一致的放在同一管內(nèi)，每管30頭，各處理每個齡期取3個重復(fù)。因成蚜在30℃條件下難以存活，故30℃條件下的成蚜未取樣成功，共取42個樣本。

1.2DNA提取、擴(kuò)增和測序

利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒提取蘋果綿蚜的總DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，微量核酸蛋白測定儀（NanoDrop 2000，USA）測定總DNA濃度及OD260/OD280值。以DNA為模板，利用16S rDNAV3-V4區(qū)保守區(qū)域的特異性引物338F，并添加樣本特異性Barcode序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃延長5min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對目標(biāo)片段切膠回收，回收后產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測，熒光試劑為Quant_iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate

reader（ BioTek，F(xiàn)Lx800）。按照TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（Illumina公司，美國）的使用說明制備測序文庫，并用Agi-lent High Sensitivity DNA Kit對文庫進(jìn)行質(zhì)檢，然后使用MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）試劑、MiSeq測序儀進(jìn)行2x300 bp的雙端測序。測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)項(xiàng)目采用Illumina MiSeq平臺對群落DNA片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測序，首先用QI-IME軟件（v1.8.0，http：//qiime. org/）識別并剔除5'端引物錯配堿基數(shù)gt;1的和含有連續(xù)相同堿基數(shù)gt;8的序列，然后通過USEARCH（v5.2.236，http：//www. drive5.

com/usearch/）檢查并剔除嵌合體序列。再調(diào)用UCLUST工具，對獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，然后選取每個OTU中豐度最高的序列作為代表序列，使用QIIME軟件中的默認(rèn)參數(shù)，將代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫（Release132，http：//www. arb-silva. de）中的模板序列進(jìn)行比對，獲取每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。

用QIIME軟件計(jì)算每個樣本的Cha01、ACE和Shannon指數(shù)，評價共生細(xì)菌的豐富度和均勻度。用R軟件（v3.5.1，ht-tps：//cran. r-proj ect. org/src/base/R-3/）繪制菌群分類組成和分布圖，直觀地反映各分類水平（組或樣本）的共生細(xì)菌分類組成；使用R軟件對Un-weighted的UniFrac距離矩陣進(jìn)行非度量多維尺度分析（non-metric

multidimensional

scaling，NMDS），用二維排序圖評價樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似程度。

2結(jié)果與分析

2.1測序數(shù)據(jù)概況

通過Illumina MiSeq平臺測序，共獲得823258條高質(zhì)量序列，按照97%的相似度進(jìn)行OTU劃分，共得到5139個OTUs。其中，3個處理共有OTU最多，有1536個；獨(dú)有OTU在23℃培養(yǎng)下最多，有477個，其次是30℃，有332個，28℃培養(yǎng)下最少，僅有296個（圖1）。

2.2蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌各分類水平的物種組成

2.2.1門水平上的物種組成基于物種注釋，蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌主要注釋到6個門（相對豐度gt;1%），其中變形菌門（Proteobacteria）是優(yōu)勢菌門，相對豐度高達(dá)52.21%，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes， 26.48%）、異常球菌一棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，11.31%）、放線菌門（Acti-nobacteria，3.70%）、厚壁菌門（Firmicutes，3.70%）和疣微菌門（Verrucomicrobia，1.32%），其他門總相對豐度僅為1.28%（圖2A）。變形菌門主要由y一變形菌綱（Gammaproteobacteria）、a-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和變形菌綱（Deltapro-teobacteria）組成，相對豐度分別為36.94%、15.11%、0.16%（圖2B）.

2.2.2綱水平上的物種組成蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌主要有8個綱（相對豐度gt;1%），總相對豐度可達(dá)98.19%，其中屬于變形菌門的Y-變形菌綱和a-變形菌綱分別占36.94%和15.11%，屬于擬桿菌門的擬桿菌綱（Bacteroidia）占26.48%，屬于異常球菌一棲熱菌門的異常球菌綱（Deino-cocci）占11.31%，屬于放線菌門的放線菌綱（Ac-tinobacteria）占3.51%，屬于厚壁菌門的梭菌綱（Clostridia）和芽孢桿菌綱（Bacilli）分別占1.79%和1.73%，屬于疣微菌門的疣微菌綱（Verrucoml-crobiae）占1.32%（圖3A）。Y-變形菌綱是優(yōu)勢菌綱，主要由變形桿菌目（Betaproteobacteriales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）組成，相對豐度分別為15.67%、12.37%和8.34%圖3B）。

2.2.3目水平上的物種組成蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌主要注釋到13個目（相對豐度gt;1%），擬桿菌目（Bacteroidales）是優(yōu)勢菌目，相對豐度為25.05%，其次是變形菌目（Betaproteobacteria-les，15.67%）、腸桿菌目（12.37%）、棲熱菌目（Thermales，11.07%）、假單胞菌目（8.34%）、根瘤菌目（Rhizobiales，8.34%）、鞘脂單胞菌目（Sphin-gomonadales，8.34%）、梭菌目（Clostridiales，1.79%）、柄桿菌目（Caulobacterales，1.59%）、疣微菌目（Verru-comicrobiales，1.32%）、噬幾丁質(zhì)菌目（Chitinopha-gales，1.13%）、芽孢桿菌目（Bacillales，1.11%）、偽諾卡氏菌目（Pseudonocardiales，1.10%）（圖4A）。優(yōu)勢菌目主要由Muribaculaceae、擬桿菌科（Bacte-roidaceae）和坦納菌科（Tannerellaceae）組成，相對豐度分別為20.33%、2.92%和1.62%（圖4B）。

2.2.4科水平上的物種組成蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌主要由15個科組成，其中Muribacula-ceae相對豐度最高，達(dá)20.33%，為優(yōu)勢菌科，其次是伯克氏菌科（Burkholderiaceae，14.96%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae，12.37%）、棲熱菌科（Thermaceae，11.07%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，6.52%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，5.50%）、莫拉菌科（Moraxellaceae．4.71%）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae，3.63%）、擬桿菌科（2.92%）、坦納菌科（1.62%）、柄桿菌科（Cau-lobacteraceae，1.58%）、疣微菌門第Ⅱ科（Akker-mansiaceae，1.31%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，1.23%）、噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae，1.13%）、偽諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae，1.10%）（圖5A）。優(yōu)勢菌科主要由Muribaculace-ae的uncultured

bacterium組成，相對豐度為20.22%（圖5B）。

2.2.5屬水平上的物種組成如圖6所示，蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌相對豐度gt;1%的屬有13個，總相對豐度為58.18%，分別為棲熱菌屬（Thermus，10.84%）、果膠桿菌屬（Pectobacteriu，m，9.58%）、貪銅菌屬（Cupriavidus，7.61%）、蒼白桿菌屬（Ochro-bac-trum，5.56%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，5.16%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，4.47%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，3.97%）、嗜糖假單胞菌屬（Pe-lomonas，3.41%）、擬桿菌屬（Bacteroides，2.73%）、副桿菌屬（Parabacteroides，1.54%）、阿克曼氏菌屬（Akker-mansLa，1.18%）、Limnobacter（1.07%）、鏈霉菌屬（Am-vcolatopsis，1.06%）。

2.3蘋果綿蚜內(nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)通常用于衡量某一類群的群落多樣性，其中，Chaol和ACE指數(shù)用來估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，值越大群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)評價群落多樣性，值越大群落多樣性越高。如表1所示，蘋果綿蚜23℃培養(yǎng)下Chaol（F=2.343，df=2，P=0.043）和ACE（F=2.823，df=2，P=0.023）指數(shù)均顯著高于28℃ ，23℃（F=4.674， df=2，P=0.005）和28℃（F=4.674，df=2，P=0.039）培養(yǎng)下的Simpson指數(shù)均顯著高于30℃，而Shannon指數(shù)各處理間無顯著差異。表明蘋果綿蚜在23℃時體內(nèi)的共生細(xì)菌豐富度和均勻度最高，隨著溫度的升高多樣性逐漸下降。

2.4齡期對蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌的影響

2.4.1NMDS分析基于樣本距離矩陣的NMDS分析結(jié)果（圖7）顯示，3個處理的樣本出現(xiàn)了局部聚類和一般重疊，表明各處理間有一定差異。其中，23℃培養(yǎng)的蘋果綿蚜樣本主要分布在NMDSI -1.0～0和NMDS2 0.5附近，28℃培養(yǎng)的樣本主要分布在NMDSI-1.0～0和NMDS2 0～0.5，而30℃培養(yǎng)的樣本主要分布在NMDSl-1—0和NMDS2 -1.0—0附近。此外，23℃、28℃培養(yǎng)下的成蚜和28℃培養(yǎng)下的3齡若蚜與同組的其他樣本分離，這表明成蚜與若蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌有所差異．3齡若蟲體內(nèi)共生細(xì)菌在28℃培養(yǎng)下發(fā)生較大變化。

2.4.2屬水平變化分析基于NMDS分析結(jié)果，我們又分析了不同齡期蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌在屬水平的變化情況，結(jié)果（圖8）發(fā)現(xiàn)，各齡期若蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌基本一致，與成蚜有較大差異，其中，成蚜體內(nèi)果膠桿菌屬（29.76%）和蒼白桿菌屬（13.68%）相對豐度高于若蚜（果膠桿菌屬：0.77%、4.16%、11.39%、7.00%；蒼白桿菌屬：4.90%、4.42%、4.10%、4.72%），而棲熱菌屬（2.72%）和貪銅菌屬（1.42%）相對豐度低于若蚜（棲熱菌屬：12.43%、13.40%、9.58%、12.95%；貪銅菌屬：7.85%、9.64%、6.14%、10.69%）.

2.5高溫對蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌的影響

2.5.1科水平上的變化如圖9所示，在3個溫度條件下蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌主要有Muri-baculaceae、伯克氏菌科、腸桿菌科、棲熱菌科、根瘤菌科、鞘脂單胞菌科、莫拉菌科、假單胞菌科、擬桿菌科和柄桿菌科（相對豐度前10位）。其中，隨著溫度升高相對豐度逐漸增加的有Muribacu-laceae和假單胞菌科，在23、28℃和30℃分別占13.35%、14.72%和32.09%，3.08%、3.45%和5.75%：隨著溫度升高相對豐度逐漸減少的有腸桿菌科、棲熱菌科和莫拉菌科，在23、28℃和30℃分別占24.92%、8.13%、6.17%，13.81%、10.11%、8.03%和5.56%、5.15%、2.95%.

2.5.2屬水平上的變化如圖10所示，果膠桿菌屬、棲熱菌屬和不動桿菌屬隨著溫度升高相對豐度逐漸降低，在23、28℃和30℃條件下分別為20.37%、4.75%、2.44%， 13.73%、10.06%、8.02%和5.29%、4.96%、2.81%。假單胞菌屬隨著溫度升高相對豐度逐漸升高，分別占3.07%、3.46%和5.76%。

3討論與結(jié)論

昆蟲體內(nèi)的共生細(xì)菌經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化，與宿主形成互惠共生的關(guān)系，常參與宿主的解毒代謝、抗逆反應(yīng)等。為明確共生細(xì)菌是否介導(dǎo)高溫影響蘋果綿蚜的適合度，本研究采用16SrDNA高通量測序技術(shù)探討了不同溫度條件下蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和變化。結(jié)果表明，變形菌門為蘋果綿蚜體內(nèi)的優(yōu)勢細(xì)菌門，其次是擬桿菌門和異常球菌一棲熱菌門：變形菌門的y-變形菌綱和a-變形菌綱，以及擬桿菌門的擬桿菌綱為優(yōu)勢細(xì)菌綱；擬桿菌目、變形桿菌目和腸桿菌目為優(yōu)勢細(xì)菌目。有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門是昆蟲體內(nèi)的一類常駐性細(xì)菌，大都分布在腸道內(nèi)，如蠟蚧、家蠶等昆蟲中腸內(nèi)的優(yōu)勢菌主要是變形菌門，本研究結(jié)果證實(shí)，蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌主要來源于腸道。

進(jìn)一步通過Alpha多樣性指數(shù)分析了高溫對蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌多樣性的影響，結(jié)果表明，在23℃時蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌豐富度和均勻度最高，隨著溫度的不斷升高其多樣性逐漸下降。在茄二十八星瓢蟲（Henosepilachna vigintioc-topunctata）的研究中發(fā)現(xiàn)，取食茄子和龍葵的個體體內(nèi)共生細(xì)菌多樣性顯著高于取食飼料的：當(dāng)小菜蛾（Plutella xylostella）從嗜食寄主蘿卜轉(zhuǎn)移到非嗜食寄主豌豆上17代后，其腸道細(xì)菌多樣性顯著下降；梨小食心蟲（Grapholita molesta）在取食李子后，腸道細(xì)菌多樣性和豐富度均顯著高于取食蘋果的。本研究中蘋果綿蚜與以上幾種昆蟲類似，當(dāng)處于不利環(huán)境時，其體內(nèi)共生細(xì)菌多樣性會顯著下降，這也證實(shí)高溫會對蘋果綿蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌菌群產(chǎn)生影響。

對不同溫度培養(yǎng)下蘋果綿芽的共生細(xì)菌在科水平和屬水平上進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，假單胞菌科的假單胞菌屬隨溫度升高相對豐度逐漸升高：腸桿菌科的果膠桿菌、莫拉菌科的不動桿菌屬和棲熱菌科的棲熱菌屬隨溫度升高相對豐度逐漸降低。Lu等研究表明，假單胞菌可以產(chǎn)生具有殺蟲活性的AaHIT1，從而有長效的殺蟲效果：Teoh等的報道也顯示，假單胞菌屬對鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、半翅目等多個目的昆蟲具有較高的致病性。居竹偽角蚜（Pseudoregma bambucicola）的果膠桿菌會幫助宿主取食竹莖，以獲取更全面的營養(yǎng)物質(zhì)。敲除大蠟螟（Galleria mellonella）體內(nèi)不動桿菌屬表面的抗原蛋白1（SurAl）后，其存活率顯著下降，這表明不動桿菌屬在昆蟲維持存活方面有著至關(guān)重要的作用。而對越冬條件下華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）腸道細(xì)菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，溫度最低日寸腸道內(nèi)未發(fā)現(xiàn)棲熱菌屬，這與本研究結(jié)果不一致，推測可能是由于物種差異所導(dǎo)致的。結(jié)合前期報道，我們推測，高溫導(dǎo)致蘋果綿蚜體內(nèi)假單胞菌屬相對豐度升高，果膠桿菌屬和不動桿菌屬相對豐度降低，從而降低該蟲的適合度。

本研究還發(fā)現(xiàn)成蚜與若蚜體內(nèi)的共生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)有所差異，成蚜體內(nèi)果膠桿菌屬和蒼白桿菌屬相對豐度高于若蚜，而棲熱菌屬和貪銅菌屬低于若蚜，因此，在后續(xù)的研究中需將齡期間的差異考慮在內(nèi)。本結(jié)果為深入了解蘋果綿蚜體內(nèi)共生細(xì)菌物種組成、多樣性變化等方面提供了理論依據(jù)，為解析高溫降低蘋果綿蚜適合度機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。