關(guān)鍵詞：家蠶；RNA-seq；可變剪接；功能基因；物質(zhì)合成

家蠶（Bombyxmori）屬鱗翅目家蠶蛾屬Bom-byx泌絲昆蟲，蠶絲是主要的紡織原料。家蠶經(jīng)歷長(zhǎng)期馴養(yǎng)和不斷人工選育，品種多樣、形態(tài)各異、遺傳變異豐富，具備易于在室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖、世代間隔短、子代群體大、遺傳背景清楚、便于實(shí)驗(yàn)操作、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、基礎(chǔ)研究積累豐富等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的模式動(dòng)物，2002年，被國(guó)際無(wú)脊椎動(dòng)物協(xié)會(huì)正式確定為鱗翅目模式昆蟲。在我國(guó)蠶業(yè)科學(xué)家的努力下，家蠶成為繼果蠅（Drosophi-la）和按蚊（Anopheles）后第三個(gè)完成基因組計(jì)劃的模式昆蟲，從2003年到2022年，依次完成了家蠶全基因組DNA序列測(cè)定以及基因組構(gòu)架圖、精細(xì)圖、高精度單堿基遺傳變異圖譜和家蠶超級(jí)泛基因組圖譜的構(gòu)建。大量基因組信息的獲得促進(jìn)了蠶業(yè)科學(xué)“后基因組時(shí)代”的到來(lái)，深入解讀家蠶遺傳信息、挖掘家蠶重要功能基因成為現(xiàn)階段蠶業(yè)科學(xué)的主要研究任務(wù)之一。

可變剪接（alternative splicing，AS）是基因轉(zhuǎn)錄后的前體mRNA通過不同的剪接方式切除內(nèi)含子、連接外顯子從而產(chǎn)生多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的過程，是高等真核生物調(diào)節(jié)基因表達(dá)、增加基因復(fù)雜性、豐富蛋白質(zhì)數(shù)量和功能的重要因素。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)開展功能基因篩選、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析、基因表達(dá)模式探索等的強(qiáng)大工具，已在家蠶的抗病性、品種特性形成、馴化和發(fā)育等方面研究中得到廣泛應(yīng)用。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)和AS識(shí)別方法的發(fā)展，在全基因組水平識(shí)別AS位點(diǎn)和AS事件變得更加高通量和經(jīng)濟(jì)?；赗NA-seq數(shù)據(jù)收集和生物信息學(xué)的研究也顯示家蠶基因組中普遍存在AS事件，AS基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期選擇的轉(zhuǎn)錄本和表達(dá)水平不同，使AS事件具有時(shí)空特異性。家蠶的性別決定與分化、病毒抵御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)構(gòu)組成等生物學(xué)過程的功能基因分析已證實(shí)均存在AS事件。AS事件和AS基因的挖掘和分析可以為特定條件下產(chǎn)生特異蛋白的基因生物學(xué)功能研究提供重要參考，是進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和蛋白質(zhì)功能多樣性研究的重要方向。

雖然家蠶各組織RNA-seq研究數(shù)據(jù)大量涌現(xiàn)，但基于RNA-seq結(jié)果的AS研究并不多，AS研究仍集中于單基因。本研究通過RNA-seq技術(shù)獲得了東肥和彩4兩個(gè)品種家蠶預(yù)蛹期中腸、脂肪體和血淋巴組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用AS識(shí)別軟件rMATS、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)3個(gè)組織的AS事件和AS基因的數(shù)量、分布、重疊和功能信息進(jìn)行了分析，為家蠶3個(gè)與物質(zhì)消化和吸收、合成和代謝、貯存和運(yùn)輸相關(guān)的關(guān)鍵組織的基因組AS事件分析提供系統(tǒng)性數(shù)據(jù)，同時(shí)篩選出2個(gè)家蠶品種間同一組織內(nèi)的差異AS事件，并對(duì)差異AS基因進(jìn)行功能注釋，以挖掘2個(gè)品種差異性狀相關(guān)AS基因，為家蠶特定性狀形成機(jī)制的探索提供候選基因。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2019年6-7月同時(shí)飼養(yǎng)東肥（DF，4眠，白色繭）和彩4（C4，4眠，肉粉色繭）兩個(gè)品種的家蠶全齡幼蟲。飼養(yǎng)條件：溫度23～27℃，濕度60%～70%，自然光照。

1.2家蠶組織樣品采集

在家蠶5齡預(yù)蛹期（排空腸道糞便，上蔟前），解剖蠶體并分別采集其中腸、脂肪體和血淋巴組織，-80℃凍存。每種組織3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的樣品由5頭蠶同一組織混合而成。

1.3總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

根據(jù)TRIzol⑩Reagent（15596026， Invitrogen）的說(shuō)明提取家蠶各組織樣品的總RNA，采用Agi-lent RNA 6000 Nano kit（5067-1511， Agilent）在Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，美國(guó)）上檢測(cè)其純度、完整性和總量。

1.4cDNA文庫(kù)構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將質(zhì)量合格的總RNA委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建完成后，經(jīng)初步定量、定量稀釋、in-sert size檢測(cè)和有效濃度準(zhǔn)確定量，以控制文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行IlluminaHiSeq測(cè)序，測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序（se-quencing by synthesis）。測(cè)得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CA-SAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)（reads），對(duì)原始reads進(jìn)行過濾，去除帶接頭的、含無(wú)法確定堿基信息和低質(zhì)量（Qphred≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read長(zhǎng)度的50%以上）的reads．獲得質(zhì)控過濾后數(shù)據(jù)（clean reads），采用HISAT2（http：//ccb.jhu. edu/software/hisat2/faq. shtml）軟件將clean reads在參考基因組上進(jìn)行精確定位（mapping），參考基因組為Bmori_2016 v1.0（2020年，GenBank assemblyaccession： GCA_014905235.2）。

1.5AS事件鑒定與分析

使用rMATS（4.0.2）軟件對(duì)mapping的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行AS事件分析，對(duì)每個(gè)樣品存在的可變剪接類型及相應(yīng)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，可識(shí)別A3SS、A5SS、MXE、RI和SE 5種AS事件，通過計(jì)算P值和錯(cuò)誤發(fā)生率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）進(jìn)行差異顯著性分析，本研究采用FDRlt;0.05為閾值篩選2個(gè)家蠶品種同一組織的差異表達(dá)AS事件。在Mirosoft Excel中對(duì)初步獲取的AS事件和AS基因的組織分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪制表格。利用Novomagic（https：//magic. novo-gene.com/）軟件分析AS基因在不同組織發(fā)生同類AS事件和在同一組織發(fā)生多種類型AS事件的分布和重疊數(shù)據(jù)并繪制韋恩圖。

1.6AS基因的GO與KEGG分析

對(duì)家蠶3個(gè)組織AS基因和2個(gè)品種間3個(gè)組織差異AS基因采用Novomagic軟件進(jìn)行GO和KEGG的注釋和富集分析，以Plt;0.05為顯著性閾值，AS基因富集結(jié)果選取Plt;0.05且無(wú)信息重疊的條目和通路，差異AS基因富集結(jié)果選取Plt;0.05或基因集合數(shù)量大的條目和通路，富集圖采用GraphPad Prism 5.01軟件繪制。

2結(jié)果與分析

2.1家蠶RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量及與參考基因組比對(duì)

RNA-seq原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后，組織樣品均產(chǎn)生不低于6 GB的過濾reads，GC含量在46.83%～51.28%，Q20gt;97.30%，Q30gt;92.82%，數(shù)據(jù)質(zhì)量合格。3個(gè)組織表達(dá)基因總數(shù)為17646個(gè)，除彩4血淋巴3個(gè)樣品的clean reads與參考基因組的比對(duì)率低于70%外，其余15個(gè)樣品比對(duì)率為87.980～94.12%。彩4血淋巴采集3次樣品送測(cè)，比對(duì)率均低于70%，排除采樣污染的原因，可能是彩4血淋巴組織基因的實(shí)際表達(dá)情況與參考基因組信息存在較大差異，選取比對(duì)率最高的一組進(jìn)行測(cè)序和分析。

各樣品clean reads在參考基因組內(nèi)基因外顯子、內(nèi)含子區(qū)域和基因間區(qū)域的分布情況如圖1所示。脂肪體的外顯子比對(duì)率為96.45%～97.97%，高于中腸（89.59%～95.72%）和血淋巴（84.02%～94.67%）；中腸的內(nèi)含子比對(duì)率為2.52%～7.45%，高于血淋巴（1.33%～4.05%）和脂肪體（0.74%～1.63%），中腸內(nèi)含子事件發(fā)生率高可能源于前體mRNA或AS的滯留：血淋巴的基因間區(qū)域的比對(duì)率為3.81%～13.02%，明顯高于中腸（1.76%～4.04%）和脂肪體（1.29%～1.92%），尤其是彩4血淋巴的3個(gè)樣品均不低于9.79%，可能源于非編碼RNA（non coding RNAs，ncRNA）的存在或參考基因組注釋不完善。

2.2家蠶3個(gè)組織的AS事件和AS基因特征信息統(tǒng)計(jì)

利用rMATS軟件識(shí)別5種類型的AS事件，即A3SS、A5SS．MXE、RI和SE。由表1可見，家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織中分別檢測(cè)到13525、7419、6965個(gè)AS事件，對(duì)應(yīng)分布到4118、3109和2975個(gè)AS基因上。AS基因數(shù)量低于AS事件數(shù)量，表明平均每個(gè)AS基因發(fā)生1個(gè)以上的AS事件。SE的發(fā)生比例最高，在3個(gè)組織中均不低于64.95%，RI發(fā)生比例最低，均不高于1.79%。AS事件數(shù)量在脂肪體中排序?yàn)镾Egt;A3SSgt;MXEgt;A5SSgt;RI，在血淋巴中為SEgt;A3SSgt;A5SSgt; MXEgt;RI，在中腸中為SEgt;MXEgt;A3SSgt;A5SSgt;RI。可見，家蠶同一發(fā)育時(shí)期的不同組織間AS事件發(fā)生的數(shù)量和類型差異明顯。3個(gè)組織相同類型AS事件的AS基因數(shù)量總和大于合計(jì)的AS基因數(shù)量，例如A3SS事件在中腸、脂肪體和血淋巴發(fā)生的AS基因數(shù)量分別為825、693、729，總和2247，高于A3SS事件3個(gè)組織的AS基因合計(jì)值936，這源于1個(gè)基因在2個(gè)組織甚至3個(gè)組織發(fā)生同類型AS事件。同理，單個(gè)組織發(fā)生5種類型AS事件的AS基因數(shù)量總和也大于該組織發(fā)生AS事件的AS基因合計(jì)值，這源于同一組織1個(gè)基因發(fā)生了1種以上的AS事件。

AS基因發(fā)生AS事件情況如表2所示，每個(gè)組織中發(fā)生1個(gè)AS事件的基因數(shù)量占比為47.92～88.30%，發(fā)生AS事件數(shù)量≤3個(gè)的基因數(shù)量占比為81.11%～100.00%。單個(gè)基因在每個(gè)組織發(fā)生RI事件的數(shù)量≤4個(gè)，發(fā)生A3SS事件和A5SS事件的數(shù)量≤21個(gè)，發(fā)生MXE事件和SE事件的數(shù)量高于21個(gè)。

測(cè)序結(jié)果顯示，單個(gè)基因發(fā)生1種AS事件數(shù)量最多的均發(fā)生在中腸，分別為L(zhǎng)OC101746904發(fā)生66個(gè)SE事件、LOC101735614發(fā)生64個(gè)MXE事件、LOC101737083（zinc finger protein 2homolog）發(fā)生63個(gè)MXE事件、LOC101746878和LOC101737083發(fā)生59個(gè)SE事件。

在3個(gè)組織中發(fā)生同一類型AS事件的AS基因數(shù)量韋恩圖如圖2所示，A3SS事件在1個(gè)組織獨(dú)有、在2個(gè)或3個(gè)組織共有的AS基因數(shù)量和比例分別為203（21.69%）、155（16.56%）和578（61.75%），A5SS事件依次為134（21.82070）、125（20.36%）和355（57.82%）．MXE事件依次為787（70.96%）、176（15.87%）和146（13.17%），RI事件依次為37（26.24%）、29（20.57%）和75（53.19%），SE事件依次為2070（43.99%）、1185（25.18%）和1451（30.83%）．由此可見，發(fā)生A3SS、A5SS、RI事件的AS基因在預(yù)蛹期家蠶的中腸、脂肪體和血淋巴有高達(dá)53.19%～61.75%和16.56%～20.57%的3組織重疊和2組織重疊比例，而發(fā)生SE、MXE事件的AS基因組織特異性高，在單一組織的比例為43.99%和70.96%。

同一組織內(nèi)發(fā)生1、2、3、4、5個(gè)類型AS事件的AS基因數(shù)量及占比如圖3所示，在中腸中依次為2611（63.40%）、1180（28.65%）、271（6.58%）、54（1.31%）和2（0.05%），在脂肪體中依次為2175（69.96%）、734（23.61%）、178（5.73%）、21（0.68%）和1（0.03%），在血淋巴依次為2061（69.28%）、723（24.30%）、163（5.48%）、26（0.88%）和2（0.07%），由此可見，在家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織的全部AS基因總數(shù)量中，發(fā)生1個(gè)單獨(dú)類型AS事件的基因占比為最高，為63.40%～69.96%，發(fā)生2個(gè)類型AS事件的基因約占23.61%～28.65%，同時(shí)發(fā)生3、4、5個(gè)類型AS事件的基因合計(jì)占比均低于7.00%。證明AS基因在同一組織內(nèi)同時(shí)發(fā)生2種以上類型AS事件的現(xiàn)象少，普遍發(fā)生單一類型的AS事件。

2.3家蠶3個(gè)組織AS基因的功能富集分析

3個(gè)組織AS基因GO富集分析結(jié)果如圖4所示，基因功能主要富集到生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面。保留Plt;0.05的前15個(gè)和富集基因數(shù)量最多的前15個(gè)基因功能集合，在生物過程方面富集到基因數(shù)量較多的過程可歸納為5類，①磷代謝和磷酸化類：磷代謝過程、含磷化合物代謝過程、磷酸化和蛋白質(zhì)磷酸化；②分子修飾類：大分子修飾、細(xì)胞蛋白和蛋白質(zhì)修飾過程；③信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類：細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)、信號(hào)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊；④大分子的生物合成類：大分子、細(xì)胞大分子、雜環(huán)、有機(jī)循環(huán)化合物、芳香族化合物和含堿基化合物生物合成：⑤遺傳物質(zhì)的代謝和表達(dá)調(diào)控類：基因表達(dá)、RNA代謝過程和RNA生物合成過程。在細(xì)胞組分方面，有膜細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)有膜細(xì)胞器、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、含蛋白質(zhì)復(fù)合物富集到的基因數(shù)量明顯多于其他組分。在分子功能方面，腺苷酸、腺苷酸核苷酸和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）綁定、鋅離子綁定、轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶和蛋白激酶活性富集到的基因數(shù)量明顯高于其他分子功能集合。

KEGG富集到的通路可主要?dú)w納為5類（圖5）：①物質(zhì)合成和代謝相關(guān)通路：輔助因子的生物合成、碳代謝、甘油磷脂代謝、嘌呤代謝、磷酸肌醇代謝、氨基酸的生物合成、氨基酸降解、脂肪酸降解、RNA降解、丙酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝、煙酸和煙酰胺代謝、泛酸和輔酶A生物合成；②物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路：內(nèi)吞作用、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；③信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：mTOR、MAPK、Wnt、Fox0和磷脂酰肌醇信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路一果蠅、ECM-受體互作；④RNA和蛋白質(zhì)調(diào)控相關(guān)通路：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA監(jiān)控通路、剪接體、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子：⑤細(xì)胞組成和其他生物過程：溶酶體、自噬一動(dòng)物、過氧化物酶體、氧化磷酸化、凋亡一果蠅、范科尼貧血通路、晝夜節(jié)律一果蠅。

2.4兩個(gè)家蠶品種間3個(gè)組織差異AS事件統(tǒng)計(jì)

以FDRlt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異AS事件篩選，結(jié)果（表3）表明，2個(gè)品種家蠶同一組織中差異AS事件數(shù)量排序?yàn)橹心c（302）gt;血淋巴（244）gt;脂肪體（176），在中腸中差異表達(dá)AS事件數(shù)量排序?yàn)镸XEgt;SEgt;A5SSgt;A3SSgt;RI，在脂肪體和血淋巴中差異表達(dá)AS事件數(shù)量排序?yàn)镾Egt;MXEgt;A3SSgt;A5SSgt;RI。中腸組織的差異MXE、SE事件數(shù)量遠(yuǎn)高于脂肪體和血淋巴，血淋巴的差異A3SS事件數(shù)量明顯高于中腸和脂肪體。

2.5兩個(gè)家蠶品種間差異AS基因的功能富集分析

兩個(gè)家蠶品種間3個(gè)組織內(nèi)差異AS基因的GO富集結(jié)果如圖6所示。生物過程方面富集到的主要過程有：蛋白質(zhì)修飾過程，大分子修飾，碳水化合物代謝過程，含核堿基的化合物、芳香族化合物、雜環(huán)、有機(jī)環(huán)狀化合物、大分子的生物合成過程，含磷化合物和磷代謝過程，磷酸化和蛋白質(zhì)磷酸化，跨膜運(yùn)輸，蛋白質(zhì)水解，基因表達(dá)，細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，氧化一還原過程。細(xì)胞組分方面，有膜細(xì)胞器和細(xì)胞核注釋到的基因數(shù)量遠(yuǎn)高于其他組分。分子功能方面則主要富集到轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性醇基作為受體、激酶活性、蛋白激酶活性、ATP綁定、腺苷酸核糖核苷酸綁定、腺苷酸核苷酸結(jié)合、鋅離子綁定、DNA綁定、肽酶活性等過程。雖然品種間富集到的條目在3個(gè)組織均有分布，但不同組織間注釋到的基因數(shù)量差別明顯。

兩個(gè)品種在不同組織間差異AS基因的KEGG富集結(jié)果如圖7所示，共注釋到16個(gè)通路，其中胞吞作用、溶酶體、Hippo信號(hào)通路一果蠅、輔因子的生物合成、過氧化物酶體、嘌呤代謝、果糖和甘露糖代謝7個(gè)通路在3個(gè)組織中均有分布。中腸富集差異AS基因數(shù)量最多的3個(gè)通路為胞吞作用、溶酶體和Hippo信號(hào)通路一果蠅，脂肪體富集差異AS基因數(shù)量最多的3個(gè)通路為輔因子的生物合成、嘌呤代謝和碳代謝，血淋巴富集差異AS基因數(shù)量最多的3個(gè)通路為胞吞作用、剪接體和MAPK信號(hào)通路一果蠅。各組織間富集到的KEGG通路和其中注釋到的基因數(shù)量明顯不同。

2.6兩個(gè)家蠶品種間體內(nèi)抗氧化水平形成的功能候選AS基因分析

芳香族化合物的生物合成差異是家蠶品種間抗氧化水平差異形成機(jī)制研究的重點(diǎn)，在本研究中，富集到含核堿基的化合物、雜環(huán)、有機(jī)環(huán)狀化合物、大分子生物合成過程差異AS基因27個(gè)，包括：死亡誘導(dǎo)終結(jié)因子1（LOC101735661）、成對(duì)的兩親性螺旋蛋白基因Sin3a（LOC101745746）、轉(zhuǎn)錄因子cwo（LOC101746519）、核受體基因（E75）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物13（LOC101747187）、轉(zhuǎn)錄抑制因子TFI-ID亞基6（LOC101744550）、雙功能嘌呤生物合成蛋白ATIC（LOC101741082）、熱擊因子d（HSFd）、NAD激酶（LOC101739592）、多萜長(zhǎng)醇二磷酸寡糖蛋白環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3B（LOC101742247）、a-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶C樣（LOC119629781）、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞壁蛋白gpl（LOC10174C855）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子Foxl2（LOC10174L018）、周期蛋白Per（Per）、RXR型激素受體（USP）、LOC101743494．ATP依賴型6-磷酸果糖激酶（LOC101745490）、鈣離子／鈣調(diào)素反應(yīng)性腺苷酸環(huán)化酶（LOC101741402）、磷脂酰肌醇一聚糖生物合成x類蛋白（LOC101736799）、剪接體相關(guān)蛋白CWC27同源物（LOC101744679）、DNA結(jié)合蛋白Ets97D（LOC101742 733）、DNA介導(dǎo)RNA聚合酶Ⅲ亞基RPC3（LOCl01 741060）、果糖1，6-_磷酸醛縮酶（LOC778467）、LOC692932、激素受體3（Hr3）、核糖體蛋白S1（RpS1）。富集到氧化一還原過程8個(gè)差異AS基因：Cyp9a19、肌醇加氧酶（ LOC100101177）、Cyp12a2、硫醇過氧化物酶（Jafracl）、醛脫氫酶1（LOC101740694）、賴氨酸特異性脫甲基酶lid（LOC101746976）、糞卟啉原氧化酶（LOC692932）和C1 -四氫葉酸合酶（LOC101743494。以上AS基因參與家蠶體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和代謝調(diào)控，是研究家蠶品種間抗氧化水平差異機(jī)制的功能候選基因。

3討論

3.1家蠶預(yù)蛹期中腸、脂肪體和血淋巴中AS事件和AS基因的特征

預(yù)蛹期家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織中分別檢測(cè)到13525、7419、6965個(gè)AS事件，AS基因數(shù)量依次為4118、3109和2975個(gè)，各組織AS基因數(shù)量分別占表達(dá)基因總數(shù)（17646個(gè)）的23.34%、17.62%和16.86%，證明家蠶3個(gè)組織內(nèi)AS基因普遍存在。5種AS事件類型中，SE事件發(fā)生比例最高、RI事件最低，這種不同類型AS事件數(shù)量差異的結(jié)果與家蠶和人類的AS事件分布規(guī)律一致。中腸的AS事件和AS基因數(shù)量遠(yuǎn)高于脂肪體和血淋巴，其中，SE和MXE事件數(shù)量分別為9479和1963個(gè)：中腸單個(gè)AS基因發(fā)生MXE和SE事件的平均數(shù)量明顯高于脂肪體和血淋巴的：3個(gè)組織中發(fā)生1種類型AS事件的數(shù)量gt;20個(gè)的AS基因共有32個(gè)，中腸的上述AS基因高達(dá)25個(gè)，均為MXE事件和SE事件。生物信息學(xué)分析顯示，家蠶的DSCAM基因通過選擇性剪接外顯子產(chǎn)生374個(gè)轉(zhuǎn)錄本，而果蠅DSCAM基因潛在的AS事件高達(dá)38016個(gè)。DSCAM基因是RNA可變剪接極大增加RNA和蛋白質(zhì)多樣性的典型例子，其同源基因LOC101735614在本研究的家蠶中腸內(nèi)發(fā)生64個(gè)MXE事件。可變剪接是生物體響應(yīng)內(nèi)、外環(huán)境的重要機(jī)制，中腸是蠶體直接與外界接觸的器官之一，同時(shí)參與機(jī)體對(duì)內(nèi)、外環(huán)境的反應(yīng)，而脂肪體和血淋巴只處于機(jī)體內(nèi)環(huán)境中，因此，中腸AS事件和AS基因的數(shù)量、類型和特征與脂肪體和血淋巴的差異明顯，本研究中的家蠶中腸主要通過增加AS基因發(fā)生MXE和SE事件的轉(zhuǎn)錄組多樣性來(lái)應(yīng)對(duì)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境變化。

3.2家蠶預(yù)蛹期中腸、脂肪體和血淋巴中AS基因的功能分析

預(yù)蛹期是家蠶幼蟲物質(zhì)累積過程的終點(diǎn)，也是蟲體從幼蟲轉(zhuǎn)變?yōu)橛嫉淖儜B(tài)發(fā)育過程的起點(diǎn)，是研究家蠶物質(zhì)合成代謝和功能基因組的重要節(jié)點(diǎn)。本研究中GO和KEGG富集結(jié)果顯示，AS基因參與最多的生物學(xué)過程和通路歸納為：糖、脂類、蛋白質(zhì)、氨基酸、遺傳物質(zhì)、輔助因子、大分子等各類物質(zhì)的合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，與ATP綁定相關(guān)的能量代謝，細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)和翻譯的調(diào)控，蛋白質(zhì)的加工、修飾和水解，磷酸轉(zhuǎn)移酶和激酶活性。3個(gè)組織中AS基因GO富集到的基因功能，在生物過程方面P值最低的GO條目為大分子修飾、細(xì)胞蛋白修飾過程、蛋白質(zhì)修飾過程、磷代謝過程和含磷化合物代謝過程，此外，磷酸化、蛋白質(zhì)磷酸化、含磷基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性和蛋白激酶活性等與磷酸化相關(guān)的生物學(xué)過程和分子功能AS基因也被富集。磷酸化是生物體對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式之一，通過蛋白激酶／磷酸酶調(diào)控蛋白磷酸化和去磷酸化，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，是機(jī)體響應(yīng)環(huán)境變化的主要機(jī)制。AS基因通過KEGG富集到mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Fox0信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路和Hippo信號(hào)通路一果蠅，這些通路都是以磷酸化修飾為核心或是以激酶級(jí)聯(lián)的磷酸化過程，通過動(dòng)態(tài)的磷酸化水平調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和代謝等生命活動(dòng)。綜上所述，可變剪接在家蠶中腸、脂肪體和血淋巴細(xì)胞的磷酸化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，并對(duì)蠶體的物質(zhì)代謝、能量利用和應(yīng)激反應(yīng)等生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。

3.3兩個(gè)家蠶品種3個(gè)組織間差異AS基因的功能分析

全蠶體提取物有顯著的抗氧化和緩解氧化應(yīng)激損傷的功能，是富含天然抗氧化活性物質(zhì)的昆蟲資源。本研究根據(jù)前期檢測(cè)結(jié)果，選定東肥和彩4兩個(gè)抗氧化水平差異顯著的品種進(jìn)行研究，通過對(duì)預(yù)蛹期中腸、脂肪體和血淋巴3個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組比較，分析探索家蠶品種間抗氧化水平差異的分子機(jī)制。家蠶的繭色與蠶體黃酮類和酚類物質(zhì)組成相關(guān)，黃酮類和酚類物質(zhì)是含苯環(huán)的芳香族天然化合物，蠶體含這兩類物質(zhì)的種類和含量影響其抗氧化水平。本研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)品種間的差異AS基因GO富集到氧化一還原過程和含核堿基的化合物、芳香族化合物、雜環(huán)、有機(jī)環(huán)狀化合物、大分子的生物合成過程。其中Cyp9a19和Cyp12a2屬于細(xì)胞色素P450基因家族，該家族蛋白在昆蟲對(duì)殺蟲劑和植物次生代謝物質(zhì)的抗性代謝中起重要作用，Jafracl也是昆蟲對(duì)抗氧化應(yīng)激和藥物的關(guān)鍵酶。研究表明，芳香族化合物的生物合成相關(guān)基因參與調(diào)控金銀花不同花期顏色變化關(guān)聯(lián)物質(zhì)類胡蘿卜素的含量變化，該生物過程在本研究中與含核堿基的化合物、雜環(huán)、有機(jī)環(huán)狀化合物、大分子的生物合成過程有較多的差異AS基因重疊。上述AS基因參與家蠶體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和代謝調(diào)控，通過對(duì)品種間組織特異性AS基因特征進(jìn)一步探索，可為闡述家蠶特定物質(zhì)含量的差異而導(dǎo)致不同品種間全蠶體提取物抗氧化水平變化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4結(jié)論

預(yù)蛹期東肥和彩4的中腸、脂肪體和血淋巴組織分別檢測(cè)和鑒定到13525、7419、6965個(gè)AS事件，4118、3109、2975個(gè)AS基因，5個(gè)AS事件類型中，SE占比最高，RI最低。中腸AS事件類型主要為SE和MXE，并且在數(shù)量上遠(yuǎn)高于脂肪體和血淋巴。各組織AS事件和AS基因分析顯示：?jiǎn)蝹€(gè)AS基因發(fā)生AS事件數(shù)量通?！?個(gè)，最常見的為1個(gè)；AS基因的組織表達(dá)特異性與AS事件類型有關(guān)，3個(gè)組織發(fā)生SE、MXE事件的AS基因組織特異性明顯高于A3SS、A5SS和RI事件：同一個(gè)組織內(nèi)AS基因發(fā)生1個(gè)單獨(dú)類型AS事件的比例最高，發(fā)生3、4、5個(gè)類型共有AS事件的AS基因很少：3個(gè)組織中AS基因功能主要富集在物質(zhì)的合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，能量代謝，細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)和翻譯的調(diào)控，蛋白質(zhì)的加工、修飾和水解，磷酸轉(zhuǎn)移酶和激酶活性等方面。以上結(jié)果表明，家蠶體內(nèi)與物質(zhì)消化、吸收、合成和代謝相關(guān)的AS事件和AS基因數(shù)量可觀且具有組織特異性，可為研究特定物質(zhì)對(duì)蠶體的影響提供功能候選基因。另外，兩個(gè)家蠶品種間差異表達(dá)AS事件數(shù)量在中腸、脂肪體和血淋巴中分別為302、176、244個(gè)，差異AS基因數(shù)量為266、137、186個(gè)。部分差異AS基因可富集到氧化一還原過程和含核堿基的化合物、芳香族化合物、雜環(huán)、有機(jī)環(huán)狀化合物、大分子等的生物合成過程，可用于進(jìn)一步闡明蠶體抗氧化活性物質(zhì)的組成差異及形成機(jī)制。