摘要目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和動物實(shí)驗(yàn)探討活血解毒降糖方治療糖尿病心肌?。―CM）的主要化學(xué)成分及其作用機(jī)制。方法：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具，確定治療DCM的活血解毒方有效成分、核心靶點(diǎn)和信號通路。建立DCM大鼠模型以驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的主要靶點(diǎn)及治療效果。結(jié)果：篩選出活血解毒降糖方158個活性成分，涉及318個DCM靶點(diǎn)及204條相關(guān)信號通路。網(wǎng)絡(luò)分析表明，活血解毒降糖方可能通過磷酸酶基因（PTEN）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、腫瘤蛋白P53（TP53）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGFA）等關(guān)鍵靶點(diǎn)治療DCM。分子對接顯示活血解毒降糖方對活性成分槲皮素、γ-氨基丁酸、腺苷、木犀草素、山柰酚成分與PTEN、mTOR、TP53、STAT3、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合性較好，其中，木犀草素與mTOR的Vina得分最低。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活血解毒降糖方可以減輕心肌纖維化，降低C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6水平，并抑制mTOR蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮治療DCM作用。結(jié)論：活血解毒降糖方通過多成分、多靶點(diǎn)的作用改善DCM，為進(jìn)一步探究活血解毒降糖方治療DCM提供了研究思路。

關(guān)鍵詞糖尿病心肌??；活血解毒降糖方；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；作用機(jī)制

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.002

The Mechanism of Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe for Treating Diabetic Cardiomyopathy Based on Network Pharmacology， Molecular Docking and Experimental Study

CHEN Jiajun， JIANG Xiaofeng， SHEN Yaya， FU Xianzhao

Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533099， Guangxi， China

Corresponding AuthorFU Xianzhao， E-mail： 1620100638@qq.com

AbstractObjective：The main chemical components and mechanism of Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe for treating diabetic cardiomyopathy（DCM） were studied by network pharmacology，molecular docking and animal experiments.Methods：The active ingredients，core targets and signaling pathways of Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe for DCM were determined by means of network pharmacological tools.A DCM rat model was established to verify the main targets predicted by network pharmacology and the therapeutic effect.Results：A total of 158 active ingredients of Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe were screened，involving 318 DCM targets and 204 related signaling pathways.Network analysis showed that Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe could treat DCM by phosphatase gene（PTEN），target protein of rapamycin（mTOR），tumor protein P53（TP53），signal transduction and transcriptional activator 3（STAT3），vascular endothelial cell growth factor（VEGFA），and other key targets.Molecular docking showed that Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe showed better binding ability with quercetin，γ-aminobutyric acid，adenosine，luteolin，kaempferol and PTEN，mTOR，TP53，STAT3，VEGFA，and other key targets.The vina scores of luteolin and mTOR were the lowest.Animal experiments showed that Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe could alleviate myocardial fibrosis，reduce the levels of C-reactive protein（CRP），tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL） -6，and inhibit the expression of mTOR protein，so as to play some role for" the treatment of DCM.Conclusion：Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe could improve DCM by multi-component and multi-target way，which provided valuable research directions for further investigation of its therapeutic effects.

Keywords diabetic cardiomyopathy; Huoxue Jiedu Jiangtang Recipe; network pharmacology; molecular docking; mechanism

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是一種常見的糖尿病心血管疾病并發(fā)癥。在排除高血壓和冠狀動脈疾病等心臟危險因素的情況下，糖尿病病人的心臟結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常，并最終發(fā)展為心力衰竭［1］。DCM會導(dǎo)致心臟肥大、心肌纖維化、心臟的收縮和舒張功能異常等一系列心臟異常［2］，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量甚至威脅生命。目前，西醫(yī)治療DCM沒有特效藥物，主要在控制血糖的基礎(chǔ)上控制血壓、血脂以及抗心力衰竭治療，但存在不良反應(yīng)及易產(chǎn)生藥物依賴性［3］。而中醫(yī)藥治療具有整體觀念、辨證論治和多環(huán)節(jié)干預(yù)的特點(diǎn)，在治療DCM方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

DCM具有復(fù)雜的病因病機(jī)，總體上以氣陰兩虛、心血瘀阻為主，治療通常采用滋陰益氣、活血化瘀的方法［4］。活血解毒降糖方具有滋陰益氣、活血解毒的功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，活血解毒降糖方能夠改善糖脂代謝紊亂，減輕心肌損傷，提高心功能［5］。動物實(shí)驗(yàn)方面，活血解毒降糖方能抑制心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡［6］。然而，由于活血解毒降糖方活性成分和治療靶點(diǎn)的復(fù)雜性，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)和系統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法，用于探究中藥活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系以及中藥潛在的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和作用途徑，為中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供了全新的思路［7］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對活血解毒降糖方的有效活性成分與作用靶點(diǎn)進(jìn)行探討，旨在揭示活血解毒降糖方治療DCM的潛在機(jī)制，為中醫(yī)藥預(yù)防和治療DCM提供新的思路和理論支持。

1資料與方法

1.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

1.1.1活血解毒降糖方有效成分的搜集及靶點(diǎn)預(yù)測

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspe.com/tcmsp.php）依次檢索活血解毒降糖方中的10味中藥（人參、黃芪、山藥、山茱萸、大黃、黃連、桃仁、丹參、丹皮、五味子），篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的有效成分，并收集這些化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)。通過中醫(yī)藥百科全書（ETCM，https：//tcmip.cn/ETCM/）檢索活血解毒降糖方中的麥冬，并篩選出 “Druglinkness Grading”為“Moderate”或“Good”的有效成分和相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，通過中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具數(shù)據(jù)庫（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）篩選出活血解毒降糖方中鱉甲和地黃的有效成分和相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，設(shè)置Score cutoff≥20、P-value cutoff＜0.05。利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的簡稱基因名。

1.1.2DCM靶點(diǎn)搜集

以“diabetic cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞，分別檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）、PhamGKB數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/），獲得DCM相關(guān)靶點(diǎn)。然后利用R x64 4.3.0軟件制作韋恩圖，去掉重復(fù)靶點(diǎn)。

1.1.3藥物與疾病交集靶點(diǎn)的篩選

在獲得所有活血解毒降糖方和DCM的靶點(diǎn)后，使用R x64 4.3.0軟件和“venn”安裝包繪制了活血解毒降糖方有效成分靶點(diǎn)與DCM靶點(diǎn)交集的韋恩圖。

1.1.4活血解毒降糖方復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

獲取藥物有效活性成分靶點(diǎn)和交集靶點(diǎn)后，使用Cytoscape 3.10.0軟件制備“藥物有效活性成分-交集靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，隨后使用Network Analyzer插件功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出活血解毒降糖方的關(guān)鍵活性成分。

1.1.5關(guān)鍵靶蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

將活血解毒降糖方治療DCM的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫（STRING）平臺，設(shè)置物種為“homo sapiens”、置信度（medium_confidence）≥0.7，隱藏游離節(jié)點(diǎn)。獲得文本數(shù)據(jù)后，使用Cytoscape 3.10.0軟件構(gòu)建初始PPI網(wǎng)絡(luò)。使用CytoNCA插件對初始網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、點(diǎn)度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部平均連接度（local average connectivity，LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）等拓?fù)鋵W(xué)屬性的中位數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行2步篩選以簡化網(wǎng)絡(luò)，并用MCODE插件，使用默認(rèn)參數(shù)“degree cutoff≥2，node score cutoff≥0.2，k-score≥2，maximum depth＝100”［8］獲得靶點(diǎn)團(tuán)，選取分?jǐn)?shù)（score）高的靶點(diǎn)團(tuán)作為核心基因團(tuán)。其中，MCODE score可反映單個節(jié)點(diǎn)與其周圍節(jié)點(diǎn)的緊密程度［9］，選取MCODE score排名前5位的基因作為核心基因。

1.1.6基因本體（GO）功能和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析

使用R x64 4.3.0軟件對活血解毒降糖方和DCM的交集靶點(diǎn)的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和KEGG信號通路進(jìn)行富集分析，設(shè)置P-value＜0.05，Q-value＜0.05。

1.2分子對接分析

選取“藥物有效活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵活性成分與最終篩選出來的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。通過PubChem網(wǎng)站下載活血解毒降糖方活性化合物的sdf結(jié)構(gòu)文件，其3D結(jié)構(gòu)通過Chemoffice軟件轉(zhuǎn)化，得出mol2格式文件。核心基因?qū)?yīng)的蛋白名稱通過UniProt翻譯，應(yīng)用PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）找出其三維結(jié)構(gòu)，并以pdb格式保存。使用PyMOL軟件將蛋白三維結(jié)構(gòu)中的小分子配體及水分子刪除，只保存蛋白受體三維結(jié)構(gòu)。使用AutodockTools軟件對蛋白受體進(jìn)行加氫處理，計算電荷，將運(yùn)算后的小分子配體和蛋白受體都以pdbqt格式文件保存，運(yùn)用GridBox設(shè)置蛋白受體的格點(diǎn)參數(shù)及坐標(biāo)軸的大小，尋找蛋白受體和小分子配體的結(jié)合點(diǎn)。運(yùn)用vina軟件，得出對應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合能。應(yīng)用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析，繪制出分子對接構(gòu)象圖。

1.3動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.1實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及動物

1）實(shí)驗(yàn)藥物：活血解毒降糖方購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，符合《中華人民共和國藥典》藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，制成浸膏，1 g等同于原生藥10 g，組方：人參15 g，黃芪15 g，山藥15 g，山茱萸10 g，大黃5 g，黃連8 g，麥冬10 g，地黃15 g，桃仁10 g，丹參10 g，丹皮10 g，五味子10 g，鱉甲15 g。格列喹酮（北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）和貝那普利（北京諾華制藥有限公司）。2）實(shí)驗(yàn)動物：雄性無特定病原體（SPF）級SD大鼠50只，體質(zhì)量（240±10）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證編號SCXK（湘）2019-0014，飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心［溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，每天12 h循環(huán)照明］，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循動物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)準(zhǔn)則，并獲得右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。3）試劑：鏈脲佐菌素、Masson染色試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；C反應(yīng)蛋白（CRP）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素（IL）-6試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白裂解液（RIPA裂解液）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天公司；4%多聚甲醛（杭州澳菌生物技術(shù)有限公司）；兔抗雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、IgG二抗購自北京華越洋生物科技有限公司。4）試驗(yàn)儀器：超凈工作臺（中國蘇州醫(yī)療設(shè)備廠），全自動酶聯(lián)免疫分析儀（德國Berthold公司），光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），切片機(jī)（德國Thermo scientific公司），電子天平（上海天美天平儀器有限公司）等。

1.3.2動物分組和模型構(gòu)建

SD大鼠飼養(yǎng)至完全適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為對照組、模型組、西藥組、活血解毒降糖方1.0 g/kg組、活血解毒降糖方1.5 g/kg組，每組10只。對照組給予等量生理鹽水腹腔注射并以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素并以高脂飼料（江蘇省協(xié)同生物工程有限公司供給）喂養(yǎng)［10］?；钛舛窘堤欠?.0 g/kg組每日給予活血解毒降糖方懸浮液1.0 g/kg灌胃，活血解毒降糖方1.5 g/kg組每日給予活血解毒降糖方懸浮液1.5 g/kg灌胃，西藥組給予等體積格列喹酮7.50 mg/kg和貝那普利2.50 mg/kg溶液灌胃，以上3組繼續(xù)用高脂飼料喂養(yǎng)，模型組只給予高脂飼養(yǎng)喂養(yǎng)，對照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)。連續(xù)干預(yù)8周后腹腔麻醉大鼠并頸靜脈采血7～10 mL，以3 000 r/min離心10 min，提取上清，－20 ℃保存?zhèn)溆?。然后，處死大鼠，在冰上迅速取心臟，取部分心肌組織用4%多聚甲醛固定，其余心臟組織放入液氮－80 ℃冰箱冷藏。

1.3.3心肌組織病理學(xué)檢測

采用Masson三色法染色心肌組織，染色后心肌肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色，則為陽性，在顯微鏡下觀察心肌形態(tài)并選取5個不重疊視野拍照，采用Image-Pro Plus Version 6.0軟件測量膠原纖維的灰度值。

1.3.4酶聯(lián)反應(yīng)法檢測大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量

試驗(yàn)步驟按照試劑盒方法進(jìn)行操作。將樣本、試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25～28 ℃）平衡，配制洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品，后續(xù)嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行操作。

1.3.5mTOR蛋白表達(dá)檢測

采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測mTOR蛋白的表達(dá)水平。取大鼠心肌組織，利用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，并采用BCA法定量測定蛋白濃度。隨后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后使用半干轉(zhuǎn)法將樣本轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。在室溫下使用5%脫脂牛奶封閉孵化2 h，之后加入1∶1 000倍稀釋的一抗，在4 ℃冰箱過夜。洗膜后，使用相應(yīng)的1∶10 000倍稀釋的二抗，在室溫下孵育2 h。顯色采用化學(xué)發(fā)光法，并在暗室中使用X光膠片曝光。最后，采用Image J圖像分析軟件分析條帶的灰度值。

1.3.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1活血解毒降糖方有效成分及靶點(diǎn)

對組方中人參、黃芪、山藥、山茱萸、大黃、黃連、桃仁、丹參、丹皮、五味子、麥冬、地黃、鱉甲每味中藥的成分進(jìn)行篩選后，獲得活性成分251個，其中，人參22個，黃芪20個，山藥16個，山茱萸20個，大黃16個，黃連14個，桃仁23個，丹參65個，丹皮11個，五味子8個，麥冬32個，地黃3個和鱉甲1個。刪除重復(fù)或者無固定信息的成分后，活血解毒降糖方的有效活性成分共158個，中藥有效活性成分靶點(diǎn)共585個。

2.2DCM相關(guān)靶點(diǎn)和藥物有效活性成分靶點(diǎn)的交集

共獲得DCM靶點(diǎn)5 178個（見圖1），通過將585個活血解毒降糖方有效活性成分靶點(diǎn)基因與DCM靶點(diǎn)取交集，獲得318個活血解毒降糖方與DCM的交集靶點(diǎn)（見圖2）。

2.3有效活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用Cytoscape 3.10.0軟件構(gòu)建“有效活性成分-交集-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，涵蓋了13種藥物和158種有效成分，共有318個作用靶點(diǎn)（見圖3）。該網(wǎng)絡(luò)圖包含476個節(jié)點(diǎn)和1 396條邊。其中，圓形節(jié)點(diǎn)表示活性成分，方形節(jié)點(diǎn)表示DCM基因靶點(diǎn)。不同顏色代表不同的化合物來源，包括人參（深綠色）、黃芪（淡粉色）、山藥（深藍(lán)色）、山茱萸（灰色）、大黃（橙色）、黃連（紫色）、桃仁（褐色）、丹參（綠色）、丹皮（黃色）、五味子（白色）、地黃（藍(lán)色）、麥冬（深粉色）和鱉甲（紅色）。通過Network Analyzer進(jìn)行分析，選取Degree前5位作為關(guān)鍵成分。其中，分子MOL000098代表槲皮素（quercetin），其Degree最大，為107；分子MOL000388代表γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid），其Degree為91；分子MOL011099代表腺苷（Adenosine），其Degree為67；分子MOL000006代表木犀草素（luteolin），其Degree為44；分子MOL000422代表山柰酚（kaempferol），其Degree為39。這些成分可能在活血解毒降糖方藥理功能方面發(fā)揮重要作用。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

初始PPI網(wǎng)絡(luò)由391個節(jié)點(diǎn)和2 512條邊組成（見圖4）。經(jīng)CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，得到由98個節(jié)點(diǎn)和1 074條邊組成的簡化網(wǎng)路（見圖5）。經(jīng)MCODE插件分析得到由15個節(jié)點(diǎn)與78條邊組成的核心靶點(diǎn)團(tuán)（score 11.143，見圖6），其中，MCODE score排名前5位的靶點(diǎn)分別為磷酸酶基因（PTEN）、mTOR、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、腫瘤蛋白P53（TP53）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGFA）。

2.5GO功能富集分析

通過R語言對預(yù)測作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，共得到3 486個基因功能信息?；钛舛窘堤欠交钚猿煞种委烡CM的潛在作用靶點(diǎn)在BP中富集了3 020個GO功能，主要涉及對異生物質(zhì)刺激反應(yīng)、營養(yǎng)水平反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)；在CC中富集了156個GO功能，主要涉及膜筏、膜微區(qū)和神經(jīng)元細(xì)胞體；在MF中富集了310個GO功能，主要涉及蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及蛋白絲氨酸激酶活性。排名前10位的功能詳見圖7。

2.6KEGG通路富集分析

通過R語言挖掘分析獲得富集通路，共得到204條參與潛在作用靶點(diǎn)的通路。其中，活血解毒降糖方治療DCM的潛在作用靶點(diǎn)在10條顯著差異性富集通路中發(fā)揮重要作用。這些通路主要包括血脂和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路、化學(xué)致癌-受體激活、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、化學(xué)致癌活性氧、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product，AGE-RAGE）信號通路。詳見圖8。

2.7分子對接驗(yàn)證

將排名前5位的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。通常認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。對接結(jié)果顯示所選蛋白和與之對應(yīng)的小分子結(jié)合能均＜0 kJ/mol，由此化合物和受體二者之間具有較好的結(jié)合活性（見表1）。其中木犀草素與mTOR和VEGFA、槲皮素與STAT3和PTEN對接活性較好。詳見圖9。

2.8動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.8.1活血解毒降糖方對DCM大鼠心肌組織病理學(xué)的影響

Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠的心肌細(xì)胞排列緊密有序，呈鮮紅色，間質(zhì)中纖維組織增生極少。模型組發(fā)現(xiàn)大量膠原纖維彌漫增生，心肌細(xì)胞間隙欠清晰。各給藥組心肌組織Masson染色病理情況得到改善，與西藥組比較，活血解毒降糖方1.5 g/kg組膠原纖維明IOD值顯降低（P＜0.05）。但活血解毒降糖方1.0g/kg組與活血解毒降糖方1.5 g/kg組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2、圖10。

2.8.2活血解毒降糖方對DCM大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量均下降（P＜0.05）；與西藥組比較，活血解毒降糖方1.5 g/kg組降低更明顯（P＜0.05）；盡管活血解毒降糖方隨著劑量的增加顯示出更好的療效，但活血解毒降糖方不同劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

2.8.3活血解毒降糖方對DCM大鼠心肌組織中mTOR蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組心肌組織中mTOR蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組心肌組織中mTOR蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與西藥組比較，活血解毒降糖方1.0 g/kg組和活血解毒降糖方1.5 g/kg組心肌組織mTOR水平下降（P＜0.05）；與活血解毒降糖方1.0 g/kg組比較，活血解毒降糖方1.5 g/kg組心肌組織mTOR水平有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖11、圖12。

3討論

目前，DCM的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但與糖脂代謝紊亂、炎癥、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)［11］。DCM在中醫(yī)古文獻(xiàn)中無相關(guān)記載，一般將其歸屬于“消渴”并發(fā)“胸痹”“心痛”等范疇［12］。中醫(yī)認(rèn)為DCM的發(fā)病與肝腎陰虛、心脾氣虛導(dǎo)致心血不足、血瘀阻滯有關(guān)［13］?；钛舛窘堤欠骄哂凶剃幰鏆?、活血解毒之功效，滋陰益氣具有改善肝腎陰虛的病理狀態(tài)，而活血解毒能消除血瘀阻滯［14］，且有多項臨床研究表明，活血解毒降糖方對DCM具有一定的治療作用。本研究基于中藥成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)冗雜，對通路、作用、靶點(diǎn)等進(jìn)行分析，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來篩選活血解毒降糖方中有效的活性成分，并預(yù)測其在治療DCM方面的核心靶點(diǎn)和信號通路。此外，采用動物實(shí)驗(yàn)對核心靶點(diǎn)及治療效果進(jìn)行驗(yàn)證，以提供相關(guān)參考，探究活血解毒降糖方在治療DCM方面的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，活血解毒降糖方治療DCM的前5位藥物活性成分為槲皮素、γ-氨基丁酸、腺苷、木犀草素和山柰酚。研究表明，槲皮素能抗炎并調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝失調(diào)［15］。此外，可抵抗心肌細(xì)胞凋亡和抑制氧化應(yīng)激，防止心肌細(xì)胞焦亡［16-17］。γ-氨基丁酸能抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的活化，抑制心肌細(xì)胞凋亡［18］，此外，還可以糾正糖脂代謝紊亂［19-20］。腺苷可以通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移，改善缺血缺氧損傷和微血管的病變，并促進(jìn)小動脈收縮［21-22］。木犀草素具有減輕炎癥反應(yīng)和抗氧化作用［23］，同時可以改善糖脂代謝紊亂［24］。山柰酚具有抗炎和改善胰島素抵抗的作用［25-26］。上述5種成分作用于DCM的多種發(fā)病機(jī)制，這為活血解毒降糖方在治療DCM的有效性提供了理論支持。經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)分析PTEN、mTOR、TP53、STAT3、VEGFA是活血解毒降糖方治療DCM的重要靶點(diǎn)。分子對接過程中發(fā)現(xiàn)槲皮素、腺苷、木犀草素和山柰酚與關(guān)鍵靶點(diǎn)都具有較強(qiáng)的結(jié)合性，其中結(jié)合能最低的3對為mTOR與木犀草素、STAT3與槲皮素、VEGFA與木犀草素，提示mTOR、STAT3、VEGFA可能是活血解毒降糖方發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過激活下游蛋白參與DCM多種的發(fā)病機(jī)制如自噬［27］、細(xì)胞凋亡［28］、胰島素抵抗、高血糖和高血脂［29］。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，有研究顯示，抑制糖尿病H9c2細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)，H9c2細(xì)胞凋亡和纖維化的基因的表達(dá)受到抑制［30］，此外，STAT3在自噬［31］、抗炎［32］、氧化應(yīng)激［33］方面發(fā)揮重要作用。VEGFA是一種生長因子，有研究顯示，糖尿病病人VEGFA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)心肌纖維化［34］，但VEGFA又具有抑制心肌細(xì)胞凋亡并激活參與代謝的基因表達(dá)和心肌收縮性的作用［35］。經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn)，活血解毒降糖方的化合物主要參與外源性刺激反應(yīng)、激酶代謝、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞的能量代謝。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，活血解毒降糖方可能通過抗炎、調(diào)節(jié)血脂、調(diào)控凋亡和調(diào)控氧化應(yīng)激等發(fā)揮作用。動物結(jié)果顯示，活血解毒降糖方能夠降低炎癥指標(biāo)CRP、IL-6、TNF-α的含量，證實(shí)活血解毒降糖方具有抗炎功能，并抑制DCM導(dǎo)致的心肌組織膠原纖維增生；此外，活血解毒降糖方能夠抑制mTOR功能蛋白的表達(dá)，說明活血解毒降糖方可能通過上述篩選出的靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究通過對活血解毒降糖方與DCM疾病間的多元網(wǎng)絡(luò)成分進(jìn)行研究，明確了活血解毒降糖方的潛在活性成分和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，以及與其相關(guān)的主要信號通路，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供了新的思路與見解。

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（收稿日期：2023-07-12）

（本文編輯鄒麗）