摘要：NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，其在N端含有一段高度保守的特異結(jié)構(gòu)域，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫反應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物生物合成等過(guò)程具有重要功能。研究基于高州油茶第三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選獲得51個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，為深入研究基因家族特征，對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析、多列比對(duì)分析、蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析、亞細(xì)胞定位，以及二級(jí)蛋白域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白磷酸化位點(diǎn)分析。結(jié)果表明：NAC蛋白存在氨基酸數(shù)量差異，且氨基酸序列間疏水性呈現(xiàn)為親水性蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)中具有5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域。NAC轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明116個(gè)基因可劃分為10個(gè)亞族群，部分高州油茶NAC蛋白具有特異性聚為單一亞族群，其他與擬南芥和水稻融合為不同亞族群。同時(shí)NAC蛋白均具有NAM超家族結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位表明51個(gè)高州油茶NAC蛋白均位于細(xì)胞核，且二級(jí)結(jié)構(gòu)中隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)為主，同時(shí)含有α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)等。蛋白磷酸化位點(diǎn)都具有絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）。

關(guān)鍵詞：高州油茶；NAC轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S565.4; Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）07-0007-08

Identification and Bioinformatics Analysis of NAC Transcription Factor Family in Camellia drupifera Loureiro

SHEN Hong-jian，DENG Jin-qing，LIAO Bo-yong，ZHANG Bi-pei，LI Yong-quan，WANG Yi

（Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou 510220， PRC）

Abstract： NAC transcription factors are unique transcription factors in plants， which contain a highly conserved segment of specific structural domains at the N-terminus and have important functions in the processes of plant growth and development， stress response， and secondary metabolite biosynthesis. In this study， based on the information of the third-generation full-length transcriptome data of Camellia drupifera Loureiro （C. drupifera）， 51 NAC transcription factors were obtained by bioinformatics screening. In order to study the characteristics of these gene families， their physicochemical properties were analyzed， and multilinear comparison， protein phylogenetic trees， conserved motifs， gene structure， and subcellular localization were investigated. The structure of the secondary protein domains was predicted， and the protein phosphorylation sites were analyzed. The results show that NAC proteins differ in the number of amino acids， and the hydrophobicity between amino acid sequences is presented as hydrophilic proteins. Their protein structures have five conserved sub-structural domains. The phylogenetic tree analysis of the NAC transcription factors shows that 116 genes can be classified into 10 sub-populations. Part of the NAC proteins of C. drupifera is clustered as a single sub-population with specificity， and the other parts of the NAC proteins are fused with Arabidopsis thaliana and rice as a mixed sub-population. Meanwhile， all the NAC proteins have NAM superfamily structures. The subcellular localization shows that all 51 NAC proteins of C. drupifera are located in the nucleus， and the secondary structure is dominated by a randomly curled structure， with the structures of α-helix and β-rotor present. All the protein phosphorylation sites contain serine （Ser）， threonine （Thr）， and tyrosine （Tyr）. The gene family characteristics of NAC transcription factors from C. drupifera provide a reference for the subsequent research on their gene functions.

Key words：C. drupifera; NAC transcription factors; bioinformatics analysis

引用格式：沈紅建，鄧錦清，廖柏勇，等. 高州油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定及生物信息學(xué)分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024（7）：7-14.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.007.002

收稿日期：2024-02-23

基金項(xiàng)目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2023KJCX006）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202201011754）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020B

020215003）

作者簡(jiǎn)介：沈紅建（1998—），男，湖南株洲市人，碩士研究生，專業(yè)為農(nóng)藝與種業(yè)。

通信作者：廖柏勇

NAC是植物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子[1]，其廣泛分布于陸生植物當(dāng)中。NAC轉(zhuǎn)錄因子N端具有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，C端則呈現(xiàn)出高度多樣性[2]。

在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa L.）、

石榴（Punica granatum）等物種均有NAC轉(zhuǎn)錄因

子[3-5]。許多研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖發(fā)育以及生物和非生物脅迫響應(yīng)中都起著重要作用[6-9]。例如，在番茄中鑒定出的SlNAC35基因，對(duì)于干旱脅迫、鹽脅迫、細(xì)菌病原體均可誘導(dǎo)促進(jìn)SlNAC35的表達(dá)；通過(guò)對(duì)SlNAC35的過(guò)表達(dá)提高了煙草干旱和鹽脅迫的耐受度，也提高了對(duì)病原體的抵抗能力性[10-11]。在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，蛋白磷酸化與蛋白的翻譯和修飾有著重要關(guān)系，在參與調(diào)節(jié)酶的活性和植物的信號(hào)傳遞中起著重要作用[12]。蛋白質(zhì)磷酸化可以影響蛋白質(zhì)之間的相互作用，可以改變蛋白的結(jié)構(gòu)，從而影響他們與其他蛋白相互作用，磷酸化修飾作為一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，可以被蛋白磷酸酶催化反應(yīng)去除磷酸基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)關(guān)于細(xì)胞周期信號(hào)傳遞調(diào)控[13]。

油茶（Camellia oleifera）屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（CamelliaL），為常綠闊葉樹種，適宜種植在丘陵、山區(qū)地帶[14]。干旱脅迫影響油茶樹體生長(zhǎng)，造

成枝葉枯萎，葉片和果實(shí)脫落[10]。長(zhǎng)期干旱脅迫容易

造成樹體衰老加速直至植株死亡[10，15]。目前，高州油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究未見報(bào)道，筆者基于高州

油茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)高州油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[2]，為提高高州油茶抗脅迫相關(guān)的NAC基因功能研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)樣品采自廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)國(guó)有小坑林場(chǎng)（113°35′E，24°15′N）。分別在“B255”的3株無(wú)性系樹上采集花藥、葉片、葉芽、枝條、果皮、種仁鮮樣放入無(wú)紡布袋，再放入液氮冷凍帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存，稱取同樣重量的不同組織樣品進(jìn)行混樣后，立即加入液氮磨樣，開始總RNA的提取。并將提取的RNA，分成３管送至中科新生命生物科技有限公司，基于第三代測(cè)序技術(shù)Pacbio[16]，采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）測(cè)序篩選從而得到較高質(zhì)量高州油茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.2 NAC基因家族成員的鑒定

基于高質(zhì)量高州油茶的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，通過(guò)cd–hit–v4.6.7軟件對(duì)下機(jī)處理好的高質(zhì)量一致性序列進(jìn)行去冗余，使用perl程序提其取蛋白序列，在TF數(shù)據(jù)庫(kù)（plantTFdb）中進(jìn)行hmmscan比對(duì)，進(jìn)行NAC成員鑒定，篩選獲得相關(guān)的NAC蛋白序列文件，利用PlantTFDB v5.0默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行篩選分析最終獲得含保守結(jié)構(gòu)域的NAC蛋白序列[17-18]。

1.3 NAC家族理化性質(zhì)及序列比對(duì)分析

通過(guò)Expasy工具進(jìn)行在線分析獲得NAC蛋白序列中所有相關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)行分析處理。通過(guò)DNAMAN軟件中Multiple aligment sequence選項(xiàng)進(jìn)行多序列比較，默認(rèn)參數(shù)設(shè)置在Highlight homology level≥50%之間。

1.4 NAC蛋白進(jìn)化樹分析

使用PlantTFDB v5.0數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取擬南芥中關(guān)于NAC家族基因蛋白序列信息，在Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選水稻數(shù)據(jù)庫(kù)獲得NAC家族基因的蛋白序列信息[19]。使用Mega11軟件將其匯總整理好的油茶、擬南芥以及水稻轉(zhuǎn)錄因子NAC蛋白序列文件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[20]，先進(jìn)行多序列比對(duì)，選用neighbor–joining算法，Bootstrap運(yùn)行參數(shù)選擇

1 000，其余參數(shù)選擇默認(rèn)值[21]。然后使用FigTreev 1.4.4軟件對(duì)構(gòu)建好的進(jìn)化樹進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 NAC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守基

序和基因結(jié)構(gòu)分析

使用TBtools（v2.003）軟件拼接與繪制高州油茶51個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守基序和基因結(jié)構(gòu)圖[22]。使用MEME軟件，對(duì)高州油茶中NAC蛋白序列的保守基序進(jìn)行分析[23-25]。

1.6 NAC轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位及跨膜分析

使用BUSCA亞細(xì)胞定位軟件[26-27]進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)TMHMM在線分析軟件，完成高州油茶NAC家族的跨膜分析[28]。

1.7 NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

使用NPS@SOPMA軟件完成高州油茶NAC的蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)與二級(jí)結(jié)構(gòu)和分析[29-30]。

1.8 NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)的分析

使用NetPhos 3.1 Server在線工具對(duì)51個(gè)高州油茶NAC家族中的蛋白氨基酸序列中可能存在的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高州油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定

通過(guò)生物信息學(xué)篩選共獲得NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族51個(gè)成員（表1）。在ExPASy網(wǎng)站中預(yù)測(cè)結(jié)果表明，高州油茶NAC蛋白的氨基酸序列在250～756 aa之間，平均分子量為56 604.14 Da，其中CdNAC26氨基酸含量最多，其分子量為85 490.56 Da，而CdNAC51氨基酸數(shù)量的最少，其分子量只有27 611.84 Da。等電點(diǎn)范圍在4.65～10.13之間，其中CdNAC33最大，CdNAC15最小。NAC脂肪系數(shù)范圍在55.25～98.74之間，其中CdNAC48最大，而CdNAC21最小。經(jīng)過(guò)蛋白總平均疏水指數(shù)結(jié)果分析，得知高州油茶所有的NAC基因家族成員的平均疏水指數(shù)均為負(fù)值，表明其NAC蛋白為親水蛋白。

2.2 油茶NAC蛋白序列比對(duì)分析

通過(guò)對(duì)51個(gè)NAC蛋白多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NAC蛋白具有保守的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域A～E[1]（圖1），但是

CdNAC3、CdNAC9、CdNAC13、CdNAC16、CdNAC25、

CdNAC27、CdNAC29和CdNAC43均缺少亞結(jié)構(gòu)域A。5個(gè)結(jié)構(gòu)域中C和D結(jié)構(gòu)域相對(duì)比較穩(wěn)定，A、B、E結(jié)構(gòu)域變異更多。

2.3 高州油茶NAC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，116個(gè)NAC蛋白被劃分為10個(gè)亞族，其中CdNAC48和CdNAC49所在的亞族相對(duì)于其他的Ⅷ亞族最少，而Ⅹ亞族蛋白序列最多。對(duì)51個(gè)高州油茶蛋白序列進(jìn)行保守基序和結(jié)構(gòu)域分析（圖2A）發(fā)現(xiàn)，motif3和motif2主要構(gòu)成了NAC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（圖2B）。其中Ⅹ亞族全部都不含有motif2，CdNAC蛋白序列中保守基序最少的是motif7；其中有6種類型的motif是大多數(shù)的CdNAC蛋白序列中都含有的?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，NAM超家族結(jié)構(gòu)域均存在于高州油茶的51個(gè)NAC蛋白序列中（圖2C）。

2.4 高州油茶、擬南芥和水稻NAC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)系

為進(jìn)一步研究NAC蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)高州油茶51個(gè)，擬南芥36個(gè)和水稻的29個(gè)NAC蛋白序列進(jìn)行匯總整理比對(duì)，同時(shí)采用鄰接法（neighbor–joining，NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[19-20]

（圖3）?？蓪⒏咧萦筒?、擬南芥和水稻NAC蛋白劃分為10個(gè)亞族群，其中第Ⅹ號(hào)基因家族亞族群中未包含油茶蛋白只有OsNAC16和OsNAC17。OsNAC12

與其他蛋白亞群比較遠(yuǎn)單獨(dú)形成一個(gè)分支。在Ⅲ亞族群中可能存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系CdNAC44、CdNAC45、CdNAC46、CdNAC47中未包含擬南芥和水稻蛋白。其余分支中既包含油茶蛋白序列，也包含擬南芥和水稻的蛋白序列。

2.5 油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位與跨膜預(yù)測(cè)分析

亞細(xì)胞定位分析表明，高州油茶中有23個(gè)NAC

蛋白均進(jìn)行膜外運(yùn)輸、跨膜運(yùn)輸和膜內(nèi)運(yùn)輸（表2），其中CdNAC11、CdNAC12、CdNAC13、CdNAC14位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，CdNAC22、CdNAC26位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，CdNAC48位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核中，其余蛋白均位于細(xì)胞核。

2.6 高州油茶NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表3是對(duì)高州油茶的NAC的蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果，其中α–螺旋平均比例為25.36%，延伸鏈平均比例為19.30%，β–折疊平均比例為6.15%，

無(wú)規(guī)則卷曲平均比例為49.41%。其中無(wú)規(guī)卷曲占比最大，比例范圍達(dá)到29.49%～61.71%之間；β–折疊占比最小，比例范圍比較小只有3.16%～10.51%。

2.7 油茶NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

通過(guò)對(duì)51個(gè)高州油茶的蛋白序列磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果可知（表4），所有蛋白序列都包含絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中數(shù)目最多的是Ser位點(diǎn)，數(shù)目最少的是Tyr，CdNAC蛋白序列中磷酸化位點(diǎn)最多的是CdNAC19蛋白含有88個(gè)，最少的是CdNAC49蛋白只有23個(gè)。

3 討論與結(jié)論

基于高州油茶的三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息數(shù)據(jù)，共鑒定出51個(gè)高州油茶NAC家族成員，從蛋白理化性質(zhì)分析來(lái)看，高州油茶NAC蛋白在氨基酸數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、總平均親水性、數(shù)量上存在較大的差異。高州油茶NAC蛋白的總平均疏水指數(shù)均為負(fù)數(shù)說(shuō)明其蛋白多為親水性蛋白，這可能與該蛋白參與植物發(fā)育有關(guān)、基因表達(dá)調(diào)控、調(diào)控植物酶活、植物的信號(hào)傳遞等功能方面密切相關(guān)[32]。51個(gè)高州油茶NAC蛋白均具有NAM超家族結(jié)構(gòu)域可能與NAC轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)[33]。51個(gè)高州油茶的蛋白結(jié)構(gòu)域與擬南芥和水稻同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹被分為10個(gè)亞群，其中Ⅲ亞簇群的CdNAC蛋白序列與其他兩個(gè)物種存在較大差異并未產(chǎn)生混合聚類，為高州油茶特異的NAC蛋白，后續(xù)可深入分析其在油茶中的特異功能。在51個(gè)油茶NAC蛋白中，有43個(gè)包含5個(gè)典型的亞結(jié)構(gòu)域A～E，其中C和D在保守基序的組成上具有較高的相似性。

51個(gè)NAC蛋白均位于細(xì)胞核，其中還有23個(gè)蛋白參與了膜外與膜內(nèi)的跨膜運(yùn)輸。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果中NAC蛋白最大的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件均為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，最小的為β–轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，這與其他物種的NAC蛋白預(yù)測(cè)相似[19，28]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是參與多種生物過(guò)程的一個(gè)家族，表明其作為植物育種的非生物脅迫耐受性具有巨大潛力[34]。從蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Ser位點(diǎn)是高州油茶中蛋白中最多的磷酸化位點(diǎn)，這可能表明Ser磷酸化可能影響CdNAC蛋白的功能調(diào)控，可能參與植物細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)[35]

油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，但油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)的研究比較少，研究首次利用高州油茶的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)高州油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行生物信息分析，為后續(xù)相關(guān)基因功能的挖掘研究提供了參考。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）