摘要：目的 探討長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（LncRNA MALAT1）對(duì)多囊卵巢綜合征（PCOS）顆粒細(xì)胞的凋亡、自噬和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的影響。方法 qRT-PCR檢測(cè)PCOS卵巢組織、正常卵巢組織、人卵巢顆粒細(xì)胞KGN及正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80中LncRNA MALAT1的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)KGN細(xì)胞，將KGN細(xì)胞分為control組、si-NC組、si-MALAT1組、pc-NC組、pc-MALAT1組、pc-MALAT1+740Y-P（PI3K激活劑）組。qRT-PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞MALAT1 mRNA的表達(dá)水平；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；透射電鏡觀察KGN細(xì)胞中自噬小體；Western blot檢測(cè)細(xì)胞B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）、微管相關(guān)蛋白Ⅱ輕鏈3（LC3Ⅱ）、微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3（LC3Ⅰ）、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 PCOS卵巢組織MALAT1 mRNA表達(dá)水平低于正常卵巢組織，KGN細(xì)胞中MALAT1 mRNA表達(dá)水平低于正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞；control組KGN細(xì)胞中可見少量的自噬小體；干擾MALAT1表達(dá)后KGN細(xì)胞OD450值（24、48、72 h）、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05），自噬小體數(shù)量增多；過表達(dá)MALAT1后上述指標(biāo)變化均逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）；與pc-MALAT1組相比，pc-MALAT1+740Y-P組OD450（24、48、72 h）值、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高（P＜0.05），自噬小體數(shù)量增多。結(jié)論 過表達(dá)MALAT1可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而抑制PCOS顆粒細(xì)胞凋亡和自噬。

關(guān)鍵詞：多囊卵巢綜合征；RNA，長鏈非編碼；粒層細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；自噬；LncRNA MALAT1；PI3K/Akt/mTOR通路

中圖分類號(hào)：R711.75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240332

Impacts of lncRNA MALAT1 on apoptosis， autophagy of granulosa cells and

PI3K/Akt/mTOR pathway in polycystic ovary syndrome

QIAO Na， TIAN Ying， CHEN Yang， HAO Jing

Reproductive Medicine Center， Yellow River Sanmenxia Hospital， Sanmenxia 472000， China

Abstract： Objective To investigate the impacts of long non-coding RNA-lung adenocarcinoma metastasis-associated transcripton-1 （lncRNA MALAT1） on apoptosis， autophagy and phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）/protein kinase B （Akt）/mammalian rapasin target protein （mTOR） pathway in granulosa cells of polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods The expression levels of lncRNA MALAT1 in PCOS ovarian tissue， normal ovarian tissue， human ovarian granulosa cells （KGN） and normal ovarian epithelial cells IOSE80 were detected by qRT-PCR. KGN cells were cultured in vitro and grouped into the control group， the si-NC group， the si-MALAT1 group， the pc-NC group， the pc-MALAT1 group and the pc-MALAT1+740Y-P （PI3K activator） group. qRT-PCR was applied to detect the expression level of MALAT1 mRNA in cells of each transfection group. CCK-8 was applied to detect cell viability. Flow cytometry was applied to detect cell apoptosis rate. Transmission electron microscopy was applied to observe autophagosomes in KGN cells. Western blot assay was applied to detect expression levels of B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2 associated X protein （Bax）， microtubule-associated protein Ⅱ light chain 3 （LC3 Ⅱ）， microtubule-associated protein Ⅰ light chain 3 （LC3Ⅰ）， Beclin1， p-PI3K， PI3K， p-Akt， Akt， p-mTOR and mTOR proteins in cells. Results The expression level of MALAT1 mRNA in PCOS ovarian tissue was lower than that in normal ovarian tissue， and that in KGN cells was lower than that in normal ovarian epithelial IOSE80 cells. A small number of autophagosomes were observed in KGN cells in the control group. After interfering MALAT1 expression， OD450 values （24， 48 and 72 hours） and the Bcl-2 protein expression of KGN cells were reduced， and the apoptosis rate， the expression of Bax， LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ， Beclin1， p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR proteins were increased （P＜0.05）. The number of autophagosomes increased. Changes of the above indexes were reversed after overexpression of MALAT1 （P＜0.05）. Compared with the pc-MALAT1 group， the OD450 values （24， 48， 72 h）， and the expression of Bcl-2 protein were obviously reduced in the pc-MALAT1+740Y-P group， while the apoptosis rate， number of autophagosomes， the expression of Bax， LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ， Beclin1， p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt， and p-mTOR/mTOR proteins were obviously increased （P＜0.05）. The number of autophagosomes increased. Conclusion Overexpression of MALAT1 may inhibit apoptosis and autophagy in PCOS granulosa cells by inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words： polycystic ovary syndrome; RNA， long noncoding; granulosa cells; apoptosis; autophagy; LncRNA MALAT1; PI3K/Akt/mTOR pathway

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種育齡婦女常見的內(nèi)分泌疾病，以胰島素抵抗、無排卵、高雄激素血癥為主要特征［1］。胰島素抵抗、高雄激素血癥會(huì)導(dǎo)致患者月經(jīng)紊亂、卵巢囊腫，抑制顆粒細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，從而加速PCOS進(jìn)展［2］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是長度不大于200 bp且不編碼蛋白質(zhì)的RNA，參與增殖、凋亡、分化、自噬等多種過程［3］。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）在體外過表達(dá)可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)過表達(dá)可減輕PCOS大鼠卵巢組織損傷和內(nèi)分泌紊亂［3］。Elmonier等［4］研究表明LncRNA MALAT1在PCOS患者體內(nèi)低表達(dá)，促進(jìn)PCOS的進(jìn)展。郭向東等［5］研究表明補(bǔ)腎活血湯通過抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路可以抑制HEI-OC1細(xì)胞凋亡。Chen等［6］研究表明阻斷PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可抑制人成纖維細(xì)胞線粒體自噬和損傷，提高成纖維細(xì)胞活力。筆者推測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可能也參與PCOS顆粒細(xì)胞的凋亡和自噬。本研究就LncRNA MALAT1對(duì)PCOS顆粒細(xì)胞的凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR通路的影響進(jìn)行探究，以期為PCOS的治療提供新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2020年4月—2022年9月在黃河三門峽醫(yī)院確診并接受手術(shù)治療的30例PCOS患者的卵巢組織以及因卵巢其他良性疾病進(jìn)行手術(shù)的30例患者的正常卵巢組織。所有參與者均提供了書面的知情同意書。本研究獲得黃河三門峽醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-012）。

人卵巢顆粒KGN細(xì)胞以及人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80均購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。PI3K激活劑740Y-P購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒、胎牛血清、Trizol試劑、CCK-8試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自上海北諾生物科技有限公司；si-MALAT1、si-NC、pc-MALAT1、pc-NC質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技有限公司。兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）、微管相關(guān)蛋白Ⅱ輕鏈3（LC3Ⅱ）、微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3（LC3Ⅰ）、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗和羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司；qRT-PCR儀購自德國qTOWER3G公司；Aurora流式細(xì)胞儀購自青島佳鼎分析儀器有限公司；HT7800透射電鏡購自深圳市科時(shí)達(dá)電子科技有限公司。

1.2 qRT-PCR測(cè)定MALAT1 mRNA表達(dá) 提取卵巢組織和細(xì)胞中總RNA，定量并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒的方案制備反應(yīng)體系，并設(shè)定反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。MALAT1引物：上游5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，下游5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′，產(chǎn)物大小356 bp；GAPDH引物：上游5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，下游5'-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'，擴(kuò)增長度311 bp。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將KGN細(xì)胞分為si-MALAT1組（轉(zhuǎn)染si-MALAT1）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、pc-MALAT1組（轉(zhuǎn)染pc-MALAT1）、pc-NC組（轉(zhuǎn)染pc-NC）、pc-MALAT1+740Y-P（20 mmol/L［7］）組（轉(zhuǎn)染pc-MALAT1并用20 mmol/L 740Y-P處理）和control組（未處理），培養(yǎng)48 h后，采用1.2方法測(cè)定各組KGN細(xì)胞MALAT1 mRNA表達(dá)。

1.4 CCK-8測(cè)定KGN細(xì)胞活力 將KGN細(xì)胞接種在96孔板（5×104個(gè)/孔）。24、48、72 h時(shí)，加入10 μL CCK-8試劑。孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處光密度（OD）值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 將KGN細(xì)胞接種于6孔板中孵育，離心收集細(xì)胞并重懸于1×binding buffer緩沖液中，用Annexin V-FITC和PI試劑在室溫下避光染色15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6 透射電鏡觀察KGN細(xì)胞中自噬小體 將KGN細(xì)胞接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用4%戊二醛固定12 h，再用1%四氧化鋨固定2 h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，然后制作超薄切片，最后用3%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色。在透射電鏡下觀察細(xì)胞的自噬小體。

1.7 Western blot檢測(cè)KGN細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 提取KGN細(xì)胞的總蛋白，并定量分析，熱水浴將蛋白變性后電泳，用4 ℃預(yù)冷的跨膜液將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，添加Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、GAPDH一抗，在4 ℃下孵育過夜，洗滌后添加二抗室溫孵育2 h。用ECL試劑顯影，采用Image-Pro Plus軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Graphpad Prism 8.0.1軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織和細(xì)胞中MALAT1 mRNA的表達(dá)水平 PCOS卵巢組織MALAT1 mRNA表達(dá)水平低于正常卵巢組織（0.46±0.05 vs. 1.13±0.08，n=30，t=38.899，P＜0.01）；KGN細(xì)胞中MALAT1 mRNA表達(dá)水平低于正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞（0.51±0.06 vs. 1.04±0.11，n=6，t=10.361，P＜0.01）。

2.2 各組KGN細(xì)胞增殖和MALAT1 mRNA表達(dá)水平比較 si-MALAT1組24、48、72 h的OD450值和MALAT1 mRNA表達(dá)水平低于control組和si-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1組24、48、72 h的OD450值和MALAT1 mRNA表達(dá)水平高于pc-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1+740Y-P組24、48、72 h的OD450值低于pc-MALAT1組（P＜0.05），而MALAT1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組KGN細(xì)胞凋亡率比較 si-MALAT1組KGN細(xì)胞凋亡率高于control組和si-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1組KGN細(xì)胞凋亡率低于pc-NC組（P＜0.05）；pc-MALAT1+740Y-P組KGN細(xì)胞凋亡率高于pc-MALAT1組（P＜0.05），見圖1、表1。

2.4 各組KGN細(xì)胞自噬小體比較 control組KGN細(xì)胞中可見少量的自噬小體；與control組和si-NC組相比，si-MALAT1組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量增加；與pc-NC組相比，pc-MALAT1組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量

2.5 各組KGN細(xì)胞中凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與control組和si-NC組比較，si-MALAT1組Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)水平增加，Bcl-2表達(dá)下降（P＜0.05）；與pc-NC組比較，pc-MALAT1組Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與pc-MALAT1組比較，pc-MALAT1+740Y-P組Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)水平增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），見圖3、表2。

2.6 各組KGN細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與control組和si-NC組比較，si-MALAT1組KGN細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05）；與pc-NC組比較，pc-MALAT1組KGN細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低（P＜0.05）；與pc-MALAT1組比較，pc-MALAT1+740Y-P組KGN細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR增高（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

PCOS是一種代謝紊亂和內(nèi)分泌失調(diào)引起的疾病。有研究報(bào)道，我國70%的不孕癥由PCOS引起［8］。目前PCOS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但卵巢顆粒細(xì)胞異常自噬和凋亡會(huì)促進(jìn)PCOS發(fā)生發(fā)展［9］。研究顯示LncRNA異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞基本活動(dòng)異常，引發(fā)疾?。?］。LncRNA MALAT1位于染色體11q13.1，在細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可在膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡［10］。MALAT1還可抑制肝細(xì)胞癌HCC凋亡和自噬［11］。然而，目前MALAT1在PCOS細(xì)胞中的作用鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示MALAT1基因在PCOS卵巢組織和細(xì)胞低表達(dá)，提示MALAT1的異常表達(dá)可能促進(jìn)PCOS的發(fā)生；沉默MALAT1表達(dá)后可抑制KGN細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬，而上調(diào)MALAT1表達(dá)后，可促進(jìn)KGN細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和自噬，提示MALAT1參與KGN細(xì)胞的增殖和凋亡過程。

Bcl-2和Bax蛋白在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Bcl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。自噬是機(jī)體的一種自我調(diào)節(jié)過程，可將功能失調(diào)的細(xì)胞和細(xì)胞器吞噬分解，為新形成的細(xì)胞提供原料，但過度自噬可造成組織損傷，引起組織和器官功能障礙。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1為自噬標(biāo)志蛋白。為進(jìn)一步明確MALAT1能否調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡來改善PCOS，本研究檢測(cè)了自噬和凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，上調(diào)MALAT1可抑制Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)，提示上調(diào)MALAT1可抑制細(xì)胞自噬和凋亡。

研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在蛋白質(zhì)和糖原合成以及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、自噬、凋亡、衰老過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用［12］。該通路同時(shí)還參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如多種惡性腫瘤、白血病、關(guān)節(jié)炎癥等疾?。?3］。Chen等［14］研究表明，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖，減少卵巢顆粒細(xì)胞自噬。Xu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可減少卵巢顆粒細(xì)胞過度自噬，減輕PCOS癥狀。為探討MALAT1改善PCOS的機(jī)制，本研究檢測(cè)了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，沉默MALAT1表達(dá)可促進(jìn)KGN細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)，上調(diào)MALAT1可抑制KGN細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)，提示MALAT1可能調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，本研究用激活劑740Y-P處理KGN細(xì)胞，結(jié)果表明740Y-P可減弱MALAT1對(duì)KGN細(xì)胞的保護(hù)作用，提示MALAT1可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來保護(hù)KGN細(xì)胞。

綜上所述，干擾MALAT1表達(dá)可激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)PCOS顆粒細(xì)胞凋亡和自噬。過表達(dá)MALAT1可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來抑制PCOS顆粒細(xì)胞凋亡和自噬，緩解PCOS癥狀。然而，LncRNA MALAT1具體如何對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控還需要深入探究。

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（2024-03-18收稿 2024-04-26修回）

（本文編輯 李國琪）

基金項(xiàng)目：河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（LHGJ20200205）

作者單位：黃河三門峽醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（郵編472000）

作者簡介：喬娜（1983），女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科、生殖醫(yī)學(xué)方面研究。E-mail：qcx0ci@163.com