摘要：為降低發(fā)酵成本，增加貝萊斯芽孢桿菌XY40-1的發(fā)酵有效活菌數，采用全因子試驗、正交試驗、單因素試驗結合響應面試驗對貝萊斯芽孢桿菌XY40-1的培養(yǎng)體系進行系統(tǒng)優(yōu)化。結果表明：貝萊斯芽孢桿菌XY40-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.7%、豆粕1.0%、七水硫酸鎂0.5%；XY40-1最佳培養(yǎng)條件為初始pH值7.3、發(fā)酵溫度36.4℃、轉速196.4 r/min、接菌量1.0%，該條件下XY40-1的有效活菌數達到3.57×109 CFU/mL，比優(yōu)化前提高了92.97%；200 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)的活菌數達到8.23×109 CFU/mL。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；有效活菌數；響應面法；發(fā)酵優(yōu)化；培養(yǎng)條件

中圖分類號：TQ920.6 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）09-0001-07

Optimization of Fermentation Conditions of Bacillus velezensis XY40-1 by Response Surface Methodology

ZHANG Ping-mei1，TAO Yu2，3，PENG Yu-xiang4，LONG Li5，ZHOU Chi2，LI Xin2，3，CAI Yan-ping1

（1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Vegetable Research Institute， Changsha 410125， PRC; 3. Hunan Engineering Research Center of Exploration and Utilization of Endophytic Microbial Resources in Plants， Changsha 410125， PRC; 4. Long Ping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， PRC; 5. Xiangxi National Agricultural Science and Technology Park Management Committee， Xiangxi 416000， PRC）

Abstract： To reduce the fermentation cost and increase the viable count of Bacillus velezensis XY40-1 in fermentation， this study employed full factorial design， orthogonal design， single factor test， and response surface methodology to optimize the fermentation medium and conditions of this strain. The optimal fermentation medium for XY40-1 was composed of 0.7% glucose， 1.0% soybean meal， and 0.5% magnesium sulfate heptahydrate. The fermentation of XY40-1 with an inoculation amount of 1.0% at 36.4 °C and 196.4 r/min， and initial pH 7.3 showed the viable count reaching 3.57×109 CFU/mL， which increased by 92.97% compared with that without optimization. The viable count in a 200-L fermenter reached 8.23×109 CFU/mL under the optimized conditions.

Key words： Bacillus velezensis; viable count; response surface methodology; fermentation condition optimization; culture condition

微生物菌劑能維持根際微生物區(qū)系平衡、恢復土壤肥力，具有選擇性高、環(huán)境友好、效果持久等優(yōu)點，已成為發(fā)展最迅速、商業(yè)化推廣應用最成功的生物產品[1-2]。芽孢桿菌（Bacillus sp.）以其優(yōu)良的防病促生特性，成為了目前微生物菌劑中應用最廣泛的菌屬，占市場份額的80%以上[3]。其中，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）具有抑制病原菌繁殖、活化土壤養(yǎng)分和促進植物生長等多種功能，在生物防治、藥物研發(fā)和肥料應用等微生物研究領域的應用前景非常廣闊[4-6]。

受遺傳背景、生理特性等條件的影響，貝萊斯芽孢桿菌不同菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件各不相同。因此，針對不同菌株優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，改良發(fā)酵技術是充分發(fā)揮貝萊斯芽孢桿菌功能的前提和基礎[7-8]。目前，國內外關于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在菌株的分離鑒定、抑菌活性分析以及初步應用示范等方面，關于其發(fā)酵工藝優(yōu)化和工業(yè)化生產的研究仍處于初始階段[9]。微生物菌劑發(fā)酵生產主要存在有效活菌數少、成本高、儲存時間短等問題，而微生物菌劑的有效活菌數作為衡量微生物菌劑質量和應用效果的重要指標，直接影響菌株在植物根部的定殖，是菌株發(fā)揮各項作用的基礎[10]。因此，通過科學試驗提高微生物有效活菌數對產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件常用的試驗方法有單因素法、正交試驗法和響應面分析

法等，這些方法各有優(yōu)勢，也均可取得較好效果[11-13]。

與單因素和正交試驗相比，響應面分析法試驗成本低，可通過較少的試驗次數快速研究多個發(fā)酵影響因素的作用，優(yōu)化最佳因變量的影響條件，且可對各因子及其交互作用進行評價，目前已被廣泛應用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化[14]。李姝江等[15]以貝萊斯芽孢桿菌ZJ20活菌數為指標，通過響應面試驗優(yōu)化菌株的發(fā)酵參數，明顯提高了活菌數目及其防病效果。石慧敏等[3]以貝萊斯芽孢桿菌YH-18的活菌數與芽孢數為目標參數，通過響應面發(fā)酵優(yōu)化試驗增強了發(fā)酵液的抑菌能力，降低了生產成本并明顯延長了儲存時間。

貝萊斯芽孢桿菌XY40-1為廣譜拮抗菌，對辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum"capsici）和辣椒青枯病菌（Ralstonia solanacearum）等多種病原菌有較好的抑制效果，且以貝萊斯芽孢桿菌XY40-1菌液灌根能促進辣椒生長發(fā)育、提升果實品質。鑒于此，該研究以貝萊斯芽孢桿菌XY40-1為研究對象，采用全因子試驗、正交試驗、單因素試驗結合響應面試驗優(yōu)化XY40-1的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以期為貝萊斯芽孢桿菌工業(yè)化生產和推廣應用提供理論支撐，并為生防菌劑研發(fā)提供優(yōu)良微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為分離自辣椒葉片的貝萊斯芽孢桿菌XY40-1，由湖南省蔬菜研究所實驗室篩選、鑒定和保存，菌種保藏編號為CCTCC NO：M 2022342。種子培養(yǎng)基與基礎培養(yǎng)基（CK）為LB液體培養(yǎng)基，配方為胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH值6.8?；罨囵B(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基（在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂18 g/L）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)與活菌計數 采用平板劃線法將-80℃甘油凍存的貝萊斯芽孢桿菌XY40-1接種于LB固體平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h獲取單菌落。使用接種環(huán)挑取已活化的XY40-1單菌落接種到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于28℃、160 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，備用。使用顯微鏡直接對發(fā)酵液的有效活菌數進行計數[16]。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化包括碳源（A）、氮源（B）和無機鹽（C）3個組分，為降低發(fā)酵原料成本，分別選擇價格相對低廉的碳源（1糖蜜、2玉米淀粉、3蔗糖、4葡萄糖）、氮源（1豆粕、2玉米漿干粉）和無機鹽（1七水硫酸鎂、2氯化鈉、3碳酸鈣、4硫酸錳），等量替換基礎培養(yǎng)基中的碳源（酵母浸出粉）、氮源（胰蛋白胨）和無機鹽（氯化鈉），共設置32組不同培養(yǎng)基（3個組分同時替代），每組培養(yǎng)基設置3個重復。發(fā)酵條件設置為裝液量50%、接菌量1%、轉速160 r/min、溫度28℃，于100 mL搖瓶培養(yǎng)24 h后檢測發(fā)酵液有效活菌數，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機鹽種類。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分配比優(yōu)化 根據組分優(yōu)化試驗篩選出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源及無機鹽，設計3因素3水平正交試驗，檢測發(fā)酵液的有效活菌數，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源及無機鹽配比。正交試驗的因素與水平見表1。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 基于優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，以pH值6.8、發(fā)酵溫度28℃、轉速160 r/min、

接菌量0.5%、裝液量50%為初始培養(yǎng)條件，采用單因素試驗依次研究初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、溫度（31、33、35、37、39、41℃）、轉速（160、170、180、190、200、210、220、240、260 r/min）、接菌量（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）4個因素對有效活菌數的影響，每組處理設置3次重復，每次參數優(yōu)化試驗均在前試驗最優(yōu)發(fā)酵參數的基礎上進行，以此確定后續(xù)響應面優(yōu)化發(fā)酵參數的控制范圍。

1.3 響應面試驗設計

1.3.1 Plackett-Burman（PB）試驗 基于單因素優(yōu)化試驗結果，使用Design Expert 8.0.6軟件對初始pH值、發(fā)酵溫度、轉速、接菌量等4個發(fā)酵參數設計PB試驗方案，每個變量設置1個低水平和1個高水平，每組試驗設置3次重復[17]。以發(fā)酵液的活菌數為響應值，篩選出對活菌數影響顯著的參數，試驗因素與水平見表2。

1.3.2 最陡爬坡試驗 根據PB試驗結果進行方差分析，確定影響發(fā)酵的主要參數，再根據擬合方程中各變量的系數確定主要參數的爬坡方向和變化步長。在主要發(fā)酵參數中，設置各水平值時，正效應因子在原始基礎上依次增加，負效應因子在原始基礎上依次降低，其他非主要影響因素根據效應因子的正負，選擇相應的高或低值保持不變[18]。

1.3.3 Box-Behnken試驗 根據最陡爬坡試驗結果，確定主要影響參數的響應中心點。以發(fā)酵液活菌數為響應值，采用Box-Behnken設計法進行因素優(yōu)化試驗，優(yōu)化XY40-1發(fā)酵條件，并驗證響應面法獲得的活菌數預測值。

1.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)

根據搖瓶優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，對貝萊斯芽孢桿菌XY40-1進行200 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)驗證。投料體積140 L、消泡劑0.2%，進行實罐高壓蒸汽滅菌。待自然冷卻降溫后接入種子液，調節(jié)通氣量為12 m3/h、罐壓0.05 MPa。發(fā)酵期間每隔4 h取樣，3次重復，待發(fā)酵罐中活菌數上升至相對穩(wěn)定期時結束發(fā)酵。

1.5 數據處理

采用SPSS Statistics 24進行方差分析和Duncan多重比較，采用Sigmaplot 12.5進行圖形繪制，采用Design Expert 13軟件進行Plackett-Burman及響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化分析

2.1.1 培養(yǎng)基組分確定 由表3可知，貝萊斯芽孢桿菌XY40-1在以葡萄糖為碳源、豆粕為氮源和七水硫酸鎂為無機鹽的32號培養(yǎng)基（A4B1C1）中的活菌數最多，為1.85×109 CFU/mL，表明該培養(yǎng)基組合更利于貝萊斯芽孢桿菌XY40-1的生長。

2.1.2 培養(yǎng)基組分配比確定 正交試驗分析結果（表4）顯示，R值越大，對應因素對試驗結果的影響越大，因此葡萄糖、豆粕和七水硫酸鎂對XY40-1活菌數的影響大小順序為七水硫酸鎂＞豆粕＞葡萄糖。根據不同配比的活菌數，可以確定培養(yǎng)基組分的最佳配比為8號（A3B2C1），即葡萄糖0.7%、豆粕1.0%、七水硫酸鎂0.5%。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化分析

2.2.1 初始pH值對活菌數的影響 由圖1 A可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值逐漸增加，貝萊斯芽孢桿菌XY40-1的活菌數呈先增加后降低的趨勢。當初始pH值為6.5～7.5時，XY40-1活菌數較大，且顯著高于其他處理，因此在該范圍內進行pH值梯度為0.2的復篩試驗以確定最佳初始pH值。由圖1 B可知，XY40-1發(fā)酵的最佳初始pH值為7.3，活菌數達到2.2×109 CFU/mL。

2.2.2 發(fā)酵溫度對活菌數的影響 在初始pH值7.3條件下，進行最佳發(fā)酵溫度的篩選。如圖2所示，隨著溫度的升高，XY40-1活菌數先增加后降低。當培養(yǎng)溫度在37℃時活菌數達到2.55×109 CFU/mL，與39℃下活菌數差異不顯著，但顯著高于其他溫度處理，因此確定37℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.3 轉速對活菌數的影響 在初始pH值7.3、溫度37℃條件下進行最佳轉速的篩選。由圖3可知，隨著轉速的增加，XY40-1活菌數呈先增后降的趨勢，當轉速為190 r/min時，活菌數達到為3.0×109 CFU/mL，且顯著高于其他處理，因此確定190 r/min為最佳轉速。

2.2.4 接菌量對活菌數的影響 在初始pH值7.3、溫度37℃、轉速190 r/min條件下進行最佳接菌量的篩選。由圖4可知，隨著接菌量的增加，XY40-1活菌數先增加后降低，當接菌量為1.0%時，活菌數達到3.15×109 CFU/mL，且顯著高于其他處理。因此，XY40-1液體發(fā)酵接菌量以1.0%為宜。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1 Plackett-Burman試驗結果 基于單因素優(yōu)化試驗結果，以活菌（Y）數為響應值，采用PB試驗對初始pH值、溫度、轉速、接菌量4個因素進行顯著因子的篩選，試驗結果見表5。

根據PB試驗結果進行方差分析（表6），得到試驗模型的P值為0.000 8，說明該模型具有統(tǒng)計學意義。由各參數的P值可知，溫度和轉速對活菌數的影響顯著，故選擇發(fā)酵溫度和轉速進行后續(xù)最陡爬坡試驗。

2.3.2 最陡爬坡試驗結果 根據表6中各參數的預估系數，可知溫度表現為負效應，試驗中應逐漸減?。晦D速表現為正效應，試驗中應逐漸增大。由表7可知，發(fā)酵溫度36℃、轉速195 r/min時，XY40-1活菌數最高，因此選擇該條件作為響應面試驗因素水平的中心點。

2.3.3 Box-Behnken試驗與響應面分析 綜合上述試驗結果，選擇溫度、轉速2個參數，以發(fā)酵液的活菌數為響應值，進行參數優(yōu)化試驗，試驗設計及結果見表8，回歸模型方差分析見表9。對試驗數據進行回歸擬合，回歸模型P值小于0.000 1，失擬項P值大于0.05，表明該回歸模型可靠，可利用回歸方程預測最佳發(fā)酵條件。由模型預測該菌株活菌數的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度36.4℃、轉速196.4 r/min，其活菌數理論值最高，為3.57×109 CFU/mL。

構建響應值對試驗因子的等高線圖和三維空間曲面圖（圖5），分析溫度和轉速2種參數間的交互作用，發(fā)現溫度和轉速的等高線較為陡峭，且等高線呈橢圓形，說明溫度和轉速的交互作用顯著。

為驗證響應面試驗所得結果的可靠性，采用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件，即發(fā)酵溫度36.4℃、轉速196.4"r/min、初始pH值7.3、接菌量1.0%進行3次平行試驗，活菌數實際值分別為3.50×109、3.55×109、3.65×109 CFU/mL，均值為3.57×109 CFU/mL，較進行響應面優(yōu)化前活菌數1.85×109 CFU/mL提高了92.97%，且實測值均與預測值無顯著差異，驗證了該模型具有較高的擬合度，故此模型能較好地預測貝萊斯芽孢桿菌XY40-1發(fā)酵液活菌數。

2.4 發(fā)酵罐驗證

應用200 L發(fā)酵罐對貝萊斯芽孢桿菌XY40-1優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及工藝參數進行驗證。試驗結果表明，發(fā)酵18 h到達穩(wěn)定期，22 h后活菌濃度開始下降，穩(wěn)定期間活菌數最大達到8.23×109 CFU/mL，比搖瓶培養(yǎng)的最大活菌濃度3.57×109 CFU/mL提高了130.53%?？梢姡惾R斯芽孢桿菌XY40-1搖瓶優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數對200 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)具有重要參考價值。

3 討論與結論

目前，市場上的微生物菌劑以活菌制劑為主，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是實現微生物制劑產業(yè)化的關鍵環(huán)節(jié)[13]。不同菌種的營養(yǎng)需求不同，因而其最適培養(yǎng)基具有差異性，因此，根據微生物菌種的營養(yǎng)特性選擇適宜的培養(yǎng)基組分，是發(fā)酵優(yōu)化工作的前提[19]。該研究結合全因子試驗和正交試驗確定了貝萊斯芽孢桿菌XY40-1的最適碳源為葡萄糖，與前人研究結果類似[3，20-21]。XY40-1的發(fā)酵碳源為單糖時比多糖的產率更高，可能是因為多糖碳源水解慢限制了菌株的利用率[22]。以豆粕為氮源時的活菌數明顯高于玉米漿干粉，原因可能是豆粕的氨基酸種類更豐富且成分更復雜，更能滿足菌株的生長繁殖所需[23]。菌株XY40-1的最適無機鹽為硫酸鎂，研究表明鎂離子在酶促反應、調節(jié)滲透壓等微生物代謝過程中發(fā)揮了重要作用[24-26]。此外，培養(yǎng)基中碳氮源相對濃度對貝萊斯芽孢桿菌的生長與代謝也具有重要影響[27]。該試驗通過正交試驗發(fā)現碳氮源濃度較低或較高均會降低有效活菌數，而且過高的葡萄糖或豆粕濃度不僅造成原料浪費，還易導致菌體發(fā)生衰老自溶，直接降低發(fā)酵菌液的質量[28]。

適宜的培養(yǎng)條件可提高菌株的繁殖速率和活菌濃度[29]。研究表明環(huán)境溫度主要通過影響生物大分子活性和細胞膜流動性來影響微生物生長代謝，其影響機制的核心是菌株的酶活性[30]。轉速主要通過影響培養(yǎng)基中的溶氧量來影響菌濃度，轉速過低時低濃度氧使芽孢桿菌產生有機酸，造成發(fā)酵環(huán)境偏酸，阻礙生長代謝；而轉速過高時高濃度氧刺激菌體產生大量代謝物，反而抑制細胞生長[31]。菌株XY40-1優(yōu)化后的最適接菌量較低，僅為1%，研究發(fā)現低接菌量會延長發(fā)酵周期，增加生產成本，在工廠大體系發(fā)酵時可考慮適當增加接菌量，以節(jié)約成本和縮短發(fā)酵時間[32]。

該研究綜合全因子試驗、正交試驗、單因素試驗和響應面分析法等多種研究方法對貝萊斯芽孢桿菌XY40-1的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。結果發(fā)現，響應面分析可快速準確的確定XY40-1發(fā)酵參數的最優(yōu)配置，明顯縮短發(fā)酵優(yōu)化時間進而提高優(yōu)化效率，優(yōu)化后貝萊斯芽孢桿菌XY40-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.7%、豆粕1.0%、七水硫酸鎂0.5%，最佳培養(yǎng)條件為初始pH值7.3、發(fā)酵溫度36.4℃、轉速196.4 r/min、接菌量1.0%，在此條件下，菌株XY40-1搖瓶培養(yǎng)的活菌數較優(yōu)化前顯著提高，200 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)活菌數達到8.23×109 CFU/mL。這結果可為該菌株的生長特性研究及在微生物菌劑中的開發(fā)應用提供理論支撐。

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（責任編輯：王婷）