【關(guān)鍵詞】壞死性小腸結(jié)腸炎；顆粒蛋白前體；巨噬細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R722.6；R392.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-12-27

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enteroco?litis，NEC）是好發(fā)于早產(chǎn)兒的消化系統(tǒng)危急重癥。雖然近年圍產(chǎn)期醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步，但是NEC的總體發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)，死亡率居高不下（15%～30%）[1-2]。NEC 的臨床治療以禁食，廣譜抗生素治療為主，病情嚴(yán)重的患兒往往需要手術(shù)切除壞死腸段[2-3]。目前仍不清楚NEC的確切發(fā)病機(jī)制。研究表明早產(chǎn)兒的腸道屏障功能和免疫系統(tǒng)均不成熟，容易發(fā)生菌群移位，造成過度的腸道炎癥反應(yīng)[3]。組織病理學(xué)研究指出NEC患者腸道黏膜固有層中有豐富的巨噬細(xì)胞浸潤，伴隨著大量炎癥因子[如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α），白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等]的產(chǎn)生。耗竭腸道中的巨噬細(xì)胞可以改善實(shí)驗(yàn)性NEC中腸組織損傷程度[4-5]。提示了巨噬細(xì)胞在NEC腸組織炎癥損傷中的重要地位的。

顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）是一種生長因子樣分泌性蛋白，其在腸，腦，肺等多種組織器官中有豐富的表達(dá)，參與了包括炎癥反應(yīng)，免疫細(xì)胞分化在內(nèi)的眾多病理生理過程[6]。近期研究顯示PGRN與巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)的炎癥反應(yīng)具有密切關(guān)聯(lián)性。急性中耳炎動(dòng)物研究表明，PGRN缺陷促進(jìn)了CC 趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand2，CCL2）的表達(dá)，增加了炎癥中浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)量，加劇了炎癥反應(yīng)和組織損傷；重組PGRN干預(yù)可以有效減少炎癥部位巨噬細(xì)胞的浸潤[7]。然而，目前暫不清楚PGRN在NEC中的具體作用。

推測(cè)PGRN 可以抑制NEC 腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤，減少腸組織中促炎因子的產(chǎn)生，在NEC中發(fā)揮了保護(hù)性作用。本研究引入PGRN^-/-小鼠，建立了NEC小鼠模型，檢測(cè)PGRN在NEC腸組織的表達(dá)變化及對(duì)腸組織炎癥，巨噬細(xì)胞募集的影響，旨在探討PGRN在NEC動(dòng)物模型中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

犬代乳奶粉（Pet-Ag，美國）；Similac 配方奶（AbbottLaboratories，美國）；RIPA組織裂解液（索萊寶，北京），Trizol（Invitrogen，英國），Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑盒（艾科瑞生物，湖南）SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒Ⅱ（11702）（艾科瑞生物，湖南）。CCL2 Elisa 試劑盒，TNF-αElisa 試劑盒，TGF-β1 Elisa 試劑盒（四正柏，蘇州），PGRNElisa試劑盒（瑞博奧，廣州），F(xiàn)4/80多克隆抗體（Servicebio，武漢），CD11b-FITC，F(xiàn)4/80-PE 流式熒光耦聯(lián)抗體（BioLeg?end，北京）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和NEC模型

取10日齡C57B/L 背景的野生型（Wild Type，WT）新生小鼠（雌雄比1∶1，體質(zhì)量3.5～4.5 g），隨機(jī)數(shù)法分為野生型對(duì)照組（WT+Control，n=30）和野生型建模組（WT+NEC，n=30）；取10日齡C57B/L背景的PGRN基因敲除（PGRN^-/-）新生小鼠（雌雄比1∶1，體質(zhì)量3.5～4.5 g），隨機(jī)數(shù)法分為PGRN基因敲除對(duì)照組（PGRN^-/-+Control，n=30）和PGRN基因敲除建模組（PGRN^-/-+NEC，n=30）。對(duì)照組小鼠全程保持母乳喂養(yǎng)，于14 d清晨處死，取遠(yuǎn)端小腸組織（30～50 mg）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。建模組小鼠在第10天接受NEC應(yīng)激處理，將10日齡小鼠置于恒溫箱中，使用Similac嬰兒配方奶粉和幼犬代乳奶粉配制配方奶，每隔4 h對(duì)小鼠進(jìn)行配方奶（0.04 mL/g）灌胃處理。于每日8：00、14：00、20：00對(duì)建模組小鼠缺氧處理90 s（5% O₂，95% N₂）和冷刺激（4 ℃）處理10 min，持續(xù)3 d。建模完成后，次日清晨將小鼠處死，收集遠(yuǎn)端小腸組織（30～50 mg）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范。本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.3 方法

1.3.1 小鼠的體質(zhì)量改變 記錄建模過程中4組小鼠體質(zhì)量變化。

1.3.2 腸組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)和病理損傷評(píng)分 取小鼠遠(yuǎn)端小腸組織（30～50 mg），進(jìn)行固定，包埋，切片，染色處理。在100倍鏡下觀察HE染色切片，每張切片隨機(jī)采集3張視野圖像，由專業(yè)病理學(xué)家在雙盲法下按照腸道病理損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[8]，取3份圖像均值作為該切片的最終分值。當(dāng)切片評(píng)分值≥2，證明NEC被成功誘導(dǎo)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 每50 mg腸組織放入1 mL管EP管，利用Trizol法提取腸組織中的RNA。測(cè)定提取的RNA濃度，并將不同樣本的RNA濃度均一化至500 ng/uL。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，β-actin 為內(nèi)參基因，利用SYBR試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量QPCR擴(kuò)增（Bio-Rad CFX90 QPCR儀）。引物序列見表1。

1.3.4 免疫熒光染色 對(duì)小鼠的腸道蠟塊切片進(jìn)行免疫熒光分析。利用檸檬酸修復(fù)切片抗原，浸泡于雙氧中25 min，PBS洗滌3次，每次5 min。然后加入BSA孵育30 min。加入兔抗小鼠F4/80多克隆抗體，在濕潤培養(yǎng)皿中于4 °C下孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min。將切片在室溫下用熒光二抗避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min。使用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細(xì)胞核，PBS 洗滌3 次，每次5 min。滴加熒光淬滅劑，封片。利用200倍熒光顯微鏡觀察樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)采集3個(gè)視野圖像，使用Image J軟件分析圖像平均熒光強(qiáng)度。

1.3.5 ELISA檢測(cè)炎癥相關(guān)因子 將小鼠腸道組織（50 mg）與RIPA裂解液1∶10混合，離心10 min（4 ℃，12 000 r/min）收集上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒的說明進(jìn)行炎癥相關(guān)因子（TNF-α、TGF-β1、CCL2）以及PGRN的蛋白表達(dá)評(píng)估。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù) 本研究參考并改進(jìn)了文獻(xiàn)中報(bào)道的小鼠腸道巨噬細(xì)胞提取方法[9]。簡(jiǎn)單來說，取下小鼠的腸道標(biāo)本后，將其縱向剖開，置于預(yù)冷的PBS緩沖液中漂洗并剪成小塊。將腸道組織碎片轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加入包括Hank’s平衡液、5%胎牛血清、EDTA和DTT的分離液，并在37 ℃下振蕩15 min。之后通過100 μm細(xì)胞篩過濾，保留細(xì)胞篩上的組織并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入包含1640培養(yǎng)基、1型膠原酶和DNaseI的消化液，并在37 ℃下振蕩25 min。再次通過40 μm細(xì)胞篩過濾組織，收集濾液，離心沉淀物。沉淀物中含有巨噬細(xì)胞。使用FVD-APC-cy7抗體標(biāo)記細(xì)胞的活性狀態(tài)，使用CD11b-FITC、F4/80-PE 標(biāo)記巨噬細(xì)胞。最后在流式管中用磷酸緩沖液重新懸浮細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，使用FlowJo 10.0軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行。對(duì)于符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。并利用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用SNK-q 法。對(duì)于不符合正態(tài)分布或方差不齊的計(jì)量資料，使用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M_d（P₂₅，P₇₅）]表示，并使用Wilcoxon Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PGRN在NEC小鼠腸組織中高表達(dá)

QPCR檢測(cè)小鼠腸道中PGRN的mRNA水平變化；相比較對(duì)照組，WT+NEC組小鼠腸組織中PGRN的mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.579，P=0.001，圖1A）。ELISA檢測(cè)表明小鼠腸道中PGRN的蛋白水平變化趨勢(shì)與mRNA一致，NEC組小鼠腸道勻漿液中的PGRN蛋白水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.603，Plt;0.001，圖1B）。提示PGRN在NEC小鼠腸道中呈反應(yīng)性升高。

2.2 PGRN缺陷加重小鼠NEC嚴(yán)重程度

WT+Control組和PGRN^-/-+Control組小鼠全程接受母乳喂養(yǎng)，小鼠活動(dòng)較多，無腹脹，腹瀉癥狀。PGRN^-/-+NEC組和WT+NEC組小鼠接受NEC誘導(dǎo)處理；自建模第1天起，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉，腹脹，活動(dòng)下降等改變。相比WT+Control組，WT+NEC 組小鼠體質(zhì)量明顯下降（q=7.491，Plt;0.001），PGRN^-/-+NEC組小鼠較WT+NEC組體質(zhì)量下降程度更明顯（q=4.020，P=0.0343，圖2A）；HE染色檢測(cè)小鼠腸組織病理改變，WT+Control組和PGRN^-/-+Control組小鼠腸組織全層結(jié)構(gòu)清楚，腸道絨毛完整，腸道各層連續(xù)；WT+NEC小鼠腸組織部分絨毛出現(xiàn)水腫和壞死脫落（圖2B），PGRN^-/-+Control組小鼠腸組織絨毛出現(xiàn)明顯壞死脫落，腸道各層分離，連續(xù)性中斷。腸道病理損傷評(píng)分表明，WT小鼠誘導(dǎo)NEC后，病理損傷評(píng)分明顯升高（q=7.956，Plt;0.001），PGRN基因敲除進(jìn)一步提高了NEC 小鼠病理損傷評(píng)分（q=5.892，Plt;0.001；圖2C）。提示PGRN在NEC中可能發(fā)揮保護(hù)性作用。

2.3 PGRN缺陷促進(jìn)小鼠腸道炎癥反應(yīng)

ELISA檢測(cè)小鼠腸組織炎癥相關(guān)因子蛋白水平。誘導(dǎo)NEC后WT小鼠腸組織勻漿液中CCL2（q=8.637，Plt;0.001；圖3A），TNF-α（q=9.261，Plt;0.001，圖3B）的水平明顯提高，TGF-β1水平明顯降低，PGRN基因敲除進(jìn)一步促進(jìn)腸組織中TNF-α 和CCL2的表達(dá)，明顯抑制了TGF-β1的表達(dá)（q=7.510，Plt;0.001；圖3C）。

2.4 PGRN缺陷加劇小鼠腸道黏膜固有層巨噬細(xì)胞浸潤

免疫熒光染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（F4/80），結(jié)果顯示NEC小鼠腸組織中的巨噬細(xì)胞主要表達(dá)于腸道黏膜固有層（圖4A），WT+NEC組小鼠腸組織中F4/80+巨噬細(xì)胞較WT+Control組明顯增多（q=14.99，Plt;0.001）；相比較WT+NEC 組小鼠，PGRN^-/-+NEC組小鼠腸組織中F4/80+巨噬細(xì)胞明顯增加（q=14.85，Plt;0.001；圖4B）。提示PGRN影響了NEC腸道固有層中巨噬細(xì)胞的浸潤。

2.5 PGRN缺陷增加了腸道浸潤巨噬細(xì)胞的比例

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD11b+，F(xiàn)4/80+的巨噬細(xì)胞比例改變。結(jié)果表明，與WT+Control組小鼠相比較，WT+NEC組小鼠腸組織中巨噬細(xì)胞的比例明顯升高（q=13.13，Plt;0.001）；PGRN基因敲除進(jìn)一步增加了NEC小鼠腸組織中巨噬細(xì)胞的比例（q=16.90，Plt;0.001；圖5A、B）。進(jìn)一步提示PGRN 影響了NEC小鼠腸道巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量改變。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)PGRN 水平在NEC 小鼠腸道中明顯升高，PGRN基因敲除加重了小鼠NEC腸組織損傷。本研究還證實(shí)敲除PGRN基因后，NEC小鼠腸道中黏膜固有層浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，促炎因子CCL2，TNF-α水平上升，抗炎因子TGF-β1水平下降。以上結(jié)果提示PGRN 在實(shí)驗(yàn)性NEC 中可能發(fā)揮了保護(hù)性作用。

NEC早期臨床表現(xiàn)以腹脹和喂養(yǎng)不耐受為主，癥狀缺乏特異性，起病較為隱匿[10-12]。NEC的病情可在數(shù)天迅速進(jìn)展，導(dǎo)致腸道黏膜壞死甚至發(fā)生腸穿孔[11]。腹部X線平片出現(xiàn)“氣腹”征的患者往往需要手術(shù)切除壞死腸段[13]。NEC的確切發(fā)病機(jī)制目前仍尚不明確，研究認(rèn)為眾多危險(xiǎn)因素如早產(chǎn)、感染、缺氧等參與了腸道黏膜損傷，進(jìn)而增加細(xì)菌和毒素侵襲腸道組織的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致大量免疫細(xì)胞在腸組織中持續(xù)浸潤，加劇了炎癥反應(yīng)[12]。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體最重要的固有免疫細(xì)胞之一，廣泛存在于血液以及腸組織在內(nèi)的多種組織器官。當(dāng)病原體侵襲腸黏膜時(shí)，局部病變部位的巨噬細(xì)胞浸潤有助于清除致病菌，然而過度的巨噬細(xì)胞浸潤會(huì)導(dǎo)大量炎癥因子產(chǎn)生，導(dǎo)致不受控制的炎癥反應(yīng)[14-15]。組織病理學(xué)研究表明，NEC腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯增加，伴隨著大量炎癥因子的浸潤[4，16]。動(dòng)物研究證明新生小鼠腸道黏膜損傷之后出現(xiàn)具有大量促炎表型的巨噬細(xì)胞浸潤[17]。本研究利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果顯示誘導(dǎo)NEC損傷后小鼠腸黏膜固有層中浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。提示巨噬細(xì)胞浸潤在NEC發(fā)展中具有重要地位。

趨化因子家族是由免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的一個(gè)小分子量蛋白家族，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化性運(yùn)動(dòng)[18-19]。趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）主要來源于上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、記憶T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞向損傷和感染部位的遷移和浸潤[20]。研究表明CCL2在NEC小鼠腸組織中的表達(dá)量明顯升高[21]。高水平的CCL2有助于募集單核細(xì)胞到腸道黏膜損傷部位[22]。本研究結(jié)果亦表明，WT小鼠在誘導(dǎo)NEC后腸組織中CCL2的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，PGRN缺失可以進(jìn)一步促進(jìn)NEC小鼠腸組織中CCL2的高表達(dá)。

PGRN是一種具有多種功能的生長因子樣分泌蛋白，在眾多種組織器官中有豐富的表達(dá)，如腸道、大腦、肺等。PGRN參與了包括炎癥損傷，細(xì)胞生長在內(nèi)眾多生理病理過程[23]。PGRN的抗炎功能已經(jīng)得到了廣泛驗(yàn)證和探索，近期多項(xiàng)研究揭示了PGRN在感染免疫相關(guān)疾病中的潛在治療價(jià)值。在小鼠炎癥性關(guān)節(jié)炎研究中，PGRN 干預(yù)可以減少TNF-α的產(chǎn)生，減少小鼠關(guān)節(jié)炎癥損傷，從而發(fā)揮抗炎作用[24]。在炎癥性腸病動(dòng)物模型中，PGRN可以通過腫瘤壞死因子受體2（Tumor Necrosis FactorReceptor 2，TNFR2）依賴的方式促進(jìn)IL-10的表達(dá)，減少TNF-α的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用，避免腸道炎癥損傷[25]。另一方面，在肥胖和胰島素抵抗性糖尿病狀態(tài)下，PGRN 則發(fā)揮了促炎作用[26]。提示PGRN在不同疾病中發(fā)揮不同功能，本研究結(jié)果顯示，PGRN 在NEC 小鼠腸道中的表達(dá)明顯升高；PGRN基因敲除之后，NEC小鼠腸道中的促炎因子TNF-α明顯升高，抗炎因子TGF-β1水平明顯下降。提示PGRN在NEC中具有抗炎功能。PGRN與巨噬細(xì)胞募集有密切關(guān)系，在急性中耳炎動(dòng)物研究中，PGRN通過降低CCL2水平，抑制了巨噬細(xì)胞在炎癥部位募集[7]。在腎臟缺血再灌注損傷小鼠模型中，PGRN缺失可以增加小鼠腎小管間質(zhì)中巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量，補(bǔ)充重組PGRN可以減少巨噬細(xì)胞的浸潤[27]。一項(xiàng)腦出血?jiǎng)游镅芯恳脖砻?，腦室下注射重組PGRN可以減少腦出血引起的巨噬細(xì)胞浸潤[28]。然而，在皮膚傷口感染的研究中發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果，PGRN發(fā)揮了趨化作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在皮膚損傷部位的浸潤[29]，進(jìn)一步提示了PGRN在病理生理過程中的功能具有疾病特異性，探究PGRN在不同疾病中作用具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，PGRN基因缺失提高了CCL2的水平，促進(jìn)了NEC小鼠腸道進(jìn)一步巨噬細(xì)胞浸潤，加重了腸道炎癥反應(yīng)和損傷程度。提示PGRN可以減輕巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究推測(cè)PGRN可以減少巨噬細(xì)胞在NEC小鼠腸組織中的過度浸潤，減輕腸道中的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明PGRN基因敲除促進(jìn)了NEC小鼠腸道CCL2表達(dá)水平上升，增加了腸道炎癥中巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量，加重了炎癥反應(yīng)，提示了PGRN 在NEC 中可能發(fā)揮保護(hù)性作用。本研究使用了PGRN^-/-小鼠在基因?qū)哟蜗拗芇GRN的表達(dá)，增加了實(shí)驗(yàn)論證的可靠性。同時(shí)本研究存在一定的局限性，本研究主要間接驗(yàn)證了PGRN缺失加劇了NEC小鼠腸道中的炎癥反應(yīng)，增加了巨噬細(xì)胞浸潤，引起該病理生理改變的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。