摘要［目的］研究山蘭組織培養(yǎng)條件。［方法］以長(zhǎng)白山山蘭（Oreorchispatens）的假鱗莖為研究材料，分析消毒處理、激素組合、生根培養(yǎng)等對(duì)山蘭假鱗莖組織培養(yǎng)的影響，篩選最佳消毒處理組合和假鱗莖不同階段的最適培養(yǎng)基。［結(jié)果］山蘭假鱗莖最適消毒處理為75%乙醇45s+0.1%升汞表面消毒5min，無(wú)菌苗污染率為10.94%，成活率為87.62%；山蘭最佳的增殖、分化和生根培養(yǎng)基均為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH5.6，增殖率為78.89%，分化率為88.34%，生根率為83.85%。［結(jié)論］該研究建立了山蘭的組織培養(yǎng)再生體系，可為長(zhǎng)白山區(qū)其他瀕危植物的保護(hù)和繁育提供技術(shù)支撐與開(kāi)發(fā)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞山蘭；組織培養(yǎng)；消毒處理；激素組合；生根培養(yǎng)；假鱗莖

中圖分類號(hào)S567.23"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2024）24-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.030

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

ResearchonTissueCultureTechnologyofOreorchispatensinChangbaiMountain

WANGYuan1，LUShuang2，SHAYue1etal

（1.CollegeofLifeSciences，ChangchunNormalUniversity，Changchun，Jilin130000;2.KeyState-ownedForestryTechnologyServiceCenterofJilinProvince，Changchun，Jilin130000）

Abstract［Objective］TostudythetissuecultureconditionsofOreorchispatens.［Method］ThepseudobulbsofOreorchispatensinChangbaiMountainwereusedasresearchmaterialstoanalyzetheeffectsofdisinfectiontreatment，hormonecombinationandrootingcultureonthetissuecultureofpseudobulbsofOreorchispatensinordertoscreenthebestdisinfectiontreatmentcombinationandtheoptimalmediumfordifferentstagesofpseudobulbs.［Result］Theoptimaldisinfectiontreatmentofpseudobulbswas75%alcoholfor45s+0.1%mercuricchloridefor5min，thecontaminationrateofasepticseedlingswas10.94%，andthesurvivalratewas87.62%.Thebestmediumforproliferation，differentiationandrootingwas1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/Lsucrose+8g/Lagar，pH5.6，andtheproliferationratewas78.89%，thedifferentiationratewas88.34%，andtherootingratewas83.85%.［Conclusion］ThisstudyestablishedthetissuecultureandregenerationsystemofOreorchispatens，whichcanprovidetechnicalsupportanddevelopmentbasisfortheprotectionandbreedingofotherendangeredplantsinChangbaiMountainarea.

KeywordsOreorchispatens（Lindl.）Lindl.;Tissueculture;Disinfectiontreatment;Hormonecombination;Rootingcultivation;Pseudobulbs

長(zhǎng)白山山蘭［Oreorchis patens （Lindl.） Lindl.］為蘭科（Orchidaceae）山蘭屬（Oreorchis）多年生附生草本植物，也被人們叫做“冰球子”^［1］。野生廣泛分布于中國(guó)東北地區(qū)（黑龍江、遼寧和吉林）、西南（四川、貴州和云南北部）、西北（甘肅）、華中（江西、湖南）和臺(tái)灣，主要分布于海拔1 000～3 000 m 的林下、林緣、灌叢、草甸或溝谷旁^［2］。經(jīng)過(guò)干燥處理的假鱗莖可以作為藥材，其葉片一般呈現(xiàn)1～2片，6月底葉子逐漸開(kāi)始枯萎，7月底又萌發(fā)新葉^［3-4］，其味甘、性寒、辛，有小毒，具有滋陰補(bǔ)腎、清熱解毒、益氣養(yǎng)生、消癰散結(jié)的功效，用于瘰疬、無(wú)名腫毒、癰疳瘡腫、蛇蟲(chóng)咬傷等的治療^［5-6］。民間把山蘭作為山慈菇來(lái)入藥，俗稱“山芋頭”^［7］。山慈菇作為一味歷史悠久的常用藥材，自古以來(lái)便擁有廣泛的應(yīng)用傳統(tǒng)，在《中國(guó)藥典》中，山慈菇這一藥材被明確記載其植物來(lái)源包括杜鵑蘭［Cremastra appendiculata （D.Don） Makino］、獨(dú)蒜蘭［Pleione bulbocodioides （Franch.） Rolfe］和云南獨(dú)蒜蘭［Pleione yunnanensis （Rolfe） Rolfe］^［8-9］。此外，據(jù)《中華本草》與《中藥大辭典》記載，來(lái)自山蘭屬的植物如山蘭、獨(dú)葉山蘭等的假鱗莖，同樣被認(rèn)定為山慈菇的有效入藥部分^［10-11］。近年來(lái)，由于山慈菇的3種原植物供不應(yīng)求，長(zhǎng)白山地區(qū)大量收購(gòu)山蘭，導(dǎo)致野生山蘭儲(chǔ)量銳減，成為珍稀植物。因此，筆者采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖是保護(hù)長(zhǎng)白山山蘭野生資源和解決山蘭稀缺的有效辦法，以期得到最優(yōu)的山蘭組織培養(yǎng)條件，創(chuàng)新山蘭組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)，為長(zhǎng)白山山蘭種質(zhì)資源保存、精準(zhǔn)利用和規(guī)范化育苗等提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料2023年5月取長(zhǎng)春師范大學(xué)種質(zhì)保存中心在通化縣興林鎮(zhèn)闊葉林下仿生態(tài)栽培的3年生山蘭假鱗莖萌發(fā)新芽作為組織培養(yǎng)材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體消毒。

山蘭假鱗莖流水沖洗15min，表面沖洗干凈后，將其放在超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇浸泡30、45、60s，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒4、5、6min，最后無(wú)菌水沖洗3～5次，將不同消毒處理組合（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.2假鱗莖增殖培養(yǎng)中激素組合篩選。以1/4MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加蔗糖20g/L和瓊脂8g/L，調(diào)節(jié)pH為5.6，以玉米素（ZT）、萘乙酸（NAA）為不同因素，設(shè)置不同濃度水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2），ZT設(shè)置0.5、1.0、1.5mg/L3個(gè)濃度梯度，NAA設(shè)置0.025、0.050、0.100mg/L3個(gè)濃度梯度，共9個(gè)處理。

1.2.3假鱗莖分化為球莖培養(yǎng)中激素組合篩選。以假鱗莖增殖培養(yǎng)基為參照，繼續(xù)篩選最適假鱗莖分化為球莖的激素組合。

1.2.4球莖生根培養(yǎng)中激素組合篩選。以假鱗莖增殖培養(yǎng)基為參照，繼續(xù)篩選最適球莖生根的激素組合。

1.2.5培養(yǎng)條件。取山蘭假鱗莖進(jìn)行誘導(dǎo)，在基本培養(yǎng)基中添加不同種類的植物生長(zhǎng)激素應(yīng)用于不同培養(yǎng)階段，使用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。設(shè)置（25±2）℃、光照強(qiáng)度1000lx、每天光照12h的培養(yǎng)室條件。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析通過(guò)Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行整合與處理，并利用Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法對(duì)其進(jìn)行顯著性分析，以獲得更加精確的結(jié)果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析的相關(guān)計(jì)算公式如下：

污染率=污染的假鱗莖數(shù)／接種假鱗莖總數(shù)×100%

成活率=正常生長(zhǎng)的假鱗莖數(shù)／接種假鱗莖總數(shù)×100%

增殖率=假鱗莖增殖數(shù)／接種假鱗莖數(shù)×100%

分化率=分化球莖數(shù)／接種假鱗莖數(shù)×100%

生根率=生根的球莖數(shù)／接種球莖數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理組合對(duì)滅菌效果的影響

山蘭假鱗莖經(jīng)過(guò)消毒滅菌處理，每瓶接種一個(gè)假鱗莖，每30瓶為一個(gè)處理，3次重復(fù)，在空白的1/4MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后不同組合消毒處理的消毒效果見(jiàn)表3。從表3可以看出，不同消毒處理組合對(duì)山蘭假鱗莖的污染率和成活率有一定影響，所選的處理組合需要兼具較高的成活率和較低的污染率。污染率最高的組合是序號(hào)1，為49.98%，其滅菌效果是最差的；序號(hào)5污染率是最低的，為10.94%；其次是序號(hào)4和序號(hào)9，2個(gè)處理組合之間沒(méi)有顯著的差異。成活率比較高且達(dá)到70%以上的處理組合有序號(hào)1、4、5，其中序號(hào)5的成活率最高，為87.62%；序號(hào)9的污染率較低（19.33%），但其成活率同樣也很低，為30.58%，這表明消毒劑的使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)損害假鱗莖的生命力。所有消毒處理組合中序號(hào)5滿足較高的成活率和較低的污染率，因此，山蘭假鱗莖最適消毒處理為75%乙醇45s+0.1%升汞表面消毒5min。

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)假鱗莖增殖的影響從表4可以看出，不同濃度配比的培養(yǎng)基對(duì)山蘭假鱗莖增殖的影響具有明顯差異。除了1/4MS+0.5mg/LZT培養(yǎng)基中，隨著NAA濃度的升高，假鱗莖增殖率呈逐漸升高的趨勢(shì)，其他不同培養(yǎng)基在統(tǒng)一1/4MS和ZT濃度時(shí)，隨著NAA濃度的升高，假鱗莖增殖率均先升高后降低。其中，當(dāng)培養(yǎng)基為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA時(shí)，假鱗莖增殖率最高，為78.89%。因此，山蘭假鱗莖增殖的最適培養(yǎng)基為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH5.6。在最適培養(yǎng)基中山蘭假鱗莖的增殖情況如圖1所示。

2.3不同培養(yǎng)基對(duì)假鱗莖分化為球莖的影響從表5可以看出，不同濃度配比的培養(yǎng)基對(duì)山蘭假鱗莖分化為球莖的影響具有明顯差異。在1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂、pH5.6的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，分化率最高，為88.34%，瓶苗長(zhǎng)勢(shì)最佳（圖2）。

2.4不同培養(yǎng)基對(duì)球莖生根的影響從表6可以看出，不同濃度配比的培養(yǎng)基對(duì)山蘭球莖生根的影響具有明顯差異。除了1/4MS+1.0mg/LZT培養(yǎng)基中，隨著NAA濃度的升高，假鱗莖生根率呈逐漸降低的趨勢(shì)，其他同一單因素變量下生根率則是呈先升高而后降低的趨勢(shì)；在1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂、pH5.6的生根培養(yǎng)基中，球莖生根率最高，為83.85%。在最適培養(yǎng)基中山蘭假鱗莖的生根情況如圖3所示。

3結(jié)論與討論

山蘭作為一種名貴的藥材在醫(yī)藥方面發(fā)揮重要作用，由于其有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，人們?yōu)楂@取利益進(jìn)行貪婪的開(kāi)采，導(dǎo)致山蘭的野生資源急劇流失，使其生態(tài)環(huán)境遭受了嚴(yán)重破壞，其自然條件的繁殖方式已無(wú)法滿足市場(chǎng)需求^［12-13］。因此對(duì)山蘭的組織培養(yǎng)研究勢(shì)在必行。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)山蘭外植體（種子、原球莖等）進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)研究^［14-15］。張正海等^［14］研究發(fā)現(xiàn)，將消毒處理好的山蘭種子播撒在相應(yīng)培養(yǎng)基上進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，可以觀察萌發(fā)過(guò)程種子的形態(tài)變化；張正海等^［15］選用“原球莖增殖-原球莖分化為球莖-球莖生根”的組培流程，這為該試驗(yàn)提供一定的思路。

激素在植物組織培養(yǎng)中起著至關(guān)重要的作用，有效誘導(dǎo)一種植物育苗或促進(jìn)幼莖良好生長(zhǎng)所需的激素類型和濃度的不同取決于培養(yǎng)階段的不同^［16］，因此該研究用不同濃度激素進(jìn)行配比篩選出假鱗莖各階段最適培養(yǎng)基。在研究過(guò)程中要控制好消毒條件，嚴(yán)格控制好溫度、pH、光照時(shí)間等因素，避免這些因素對(duì)山蘭生長(zhǎng)環(huán)境產(chǎn)生不利影響^［17］。接種必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)榧禀[莖的滅菌效果對(duì)山蘭的組織培養(yǎng)有很大影響。在分配培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的量應(yīng)盡可能相同。在接種過(guò)程中，應(yīng)注意確保每種培養(yǎng)基中的材料在相同的條件下生長(zhǎng)。

該研究以山蘭假鱗莖為外植體，對(duì)其滅菌方式及假鱗莖增殖、假鱗莖分化為球莖、球莖生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，建立了山蘭組織培養(yǎng)的體系。在1/4MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的ZT、NAA激素，通過(guò)不同激素配比找出山蘭各階段的最適培養(yǎng)基。經(jīng)流水沖洗15min后，以75%乙醇45s+0.1%升汞5min浸泡處理的滅菌效果最佳。其中山蘭最佳的增殖、分化和生根的培養(yǎng)基均為1/4MS+1.5mg/LZT+0.050mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH5.6，增殖率為78.89%，分化率為88.34%，生根率為83.85%。

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