尹麗莎　辛雅萱　李斌等

摘要：北關(guān)紅杉主要分布于我國(guó)華東、西南地區(qū)，是一種速生珍貴大徑級(jí)用材樹(shù)種和木材工業(yè)原料。從北美紅杉外植體的選擇、消毒、腋芽的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)以及生根、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用等方面，闡述了我國(guó)紅杉組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為促進(jìn)北美紅杉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

關(guān)鍵詞：北美紅杉；組織培養(yǎng)；研究進(jìn)展

植物組織（離體）培養(yǎng)是指利用植物離體器官（如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)）或者植物組織（如分生組織、表皮組織、薄壁組織等）為培養(yǎng)對(duì)象，通過(guò)對(duì)材料誘導(dǎo)，使其產(chǎn)生愈傷組織或者芽等植物器官，進(jìn)一步發(fā)育成完整植株的技術(shù)。植物體的每一個(gè)具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞（不管性細(xì)胞還是體細(xì)胞）都含有該物種的全部遺傳信息，在適合的光照、溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與激素等條件下，愈傷組織便開(kāi)始分化，產(chǎn)生出植物的各種器官和組織，進(jìn)而發(fā)育成1棵完整的植株。

植物離體快速繁殖不僅保持了常規(guī)營(yíng)養(yǎng)繁殖的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，還獨(dú)具以下優(yōu)點(diǎn)：首先，遺傳基礎(chǔ)一致，能保持母體優(yōu)良性狀，可以一次性獲得大量基因型相同、表現(xiàn)型一致的植株。其次，利用組織培養(yǎng)法進(jìn)行繁殖周期短、繁殖快，節(jié)省空間，繁殖系數(shù)高。離體下的培養(yǎng)，擴(kuò)繁倍數(shù)的提高，有利于縮短一個(gè)新品種的選育到推廣所需的時(shí)間。例如：利用植物某一個(gè)極微的組織或器官進(jìn)行離體培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)就能產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)以上植株，如此快的繁殖速度是其他傳統(tǒng)無(wú)性繁殖方法所不能比擬的。由于在人工控制條件下進(jìn)行，根據(jù)不同植物、不同離體部位的要求提供不同的培養(yǎng)條件，不受地區(qū)和氣候的影響，無(wú)季節(jié)之分，能進(jìn)行周年生產(chǎn)。最后，通過(guò)組織培養(yǎng)可以獲得無(wú)毒苗木無(wú)性系。無(wú)毒苗有利于恢復(fù)原品種的性能和增加產(chǎn)量等。由于植物栽培過(guò)程中易感染病毒，從而導(dǎo)致生產(chǎn)力降低、品種退化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡，對(duì)生產(chǎn)者造成難以估量的損失。利用植物脫毒技術(shù)可去除植物病毒，從而恢復(fù)植株原有種性，這是其他營(yíng)養(yǎng)繁殖所不能達(dá)到的。

北美紅杉（Sequoia sempervirens Endll）又稱美國(guó)紅杉，起源于美國(guó)加利福尼亞州，現(xiàn)廣泛分布于我國(guó)華東、西南各省，其適應(yīng)性強(qiáng)，在各引種點(diǎn)都能較好地生長(zhǎng)，廣泛應(yīng)用于造林、城市綠化，是我國(guó)華東、西南地區(qū)的重要速生用材樹(shù)種。紅杉生長(zhǎng)神速、木材材積量高、分布廣阻捌，木材材質(zhì)韌性好、結(jié)構(gòu)均勻，紋理清晰、易于加工、可用于家具、建筑、紙漿等用材，具有廣泛的市場(chǎng)發(fā)展前景。紅杉的繁殖方式以傳統(tǒng)的種子播種繁育為主，此方式成本高，耗時(shí)耗力，且出苗質(zhì)量不高，高矮不一致，分化現(xiàn)象嚴(yán)重。當(dāng)代生物技術(shù)不僅能有效地克服傳統(tǒng)育苗的不足，而且培育出的苗木具有母本的優(yōu)良特征，是取得優(yōu)質(zhì)壯苗的有效方法。

1外植體選擇

植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等為材料，稱為外植體。外植體的選取是否恰當(dāng)對(duì)植物組織離體快繁起著至關(guān)重要的作用。

1.1取材部位

由于植物細(xì)胞具有全能性，因此任何組織或器官在條件適應(yīng)的情況下均可再生成完整植株。但不同種類的植物以及同一植物的不同器官對(duì)外界誘導(dǎo)的條件反應(yīng)敏感程度是不同的。取材時(shí)應(yīng)考慮外材再生能力強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好、來(lái)源豐富、容易滅菌等方面，對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，莖尖是最佳的外材，其形態(tài)已基本建成，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無(wú)病毒苗的重要途徑。通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。

1.2取材時(shí)間

一般選擇植株生長(zhǎng)旺季取材，若在生長(zhǎng)衰老期或已進(jìn)入休眠期取樣，則外植體可能對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)，連續(xù)晴朗天氣取材，避免陰雨天。材料太大，易污染；材料太小，難于成活；材料大小適中，一般為2～3cm。

2外植體的消毒

植物組織培養(yǎng)能否順利進(jìn)行，取決于外植體的滅菌、消毒環(huán)節(jié)。不同取材部位對(duì)滅菌劑的種類、濃度以及處理時(shí)間長(zhǎng)短有所不同，因此視材料敏感情況而定。在北美紅杉組培試驗(yàn)研究中，最常用的消毒試劑是升汞。首先，把取回來(lái)的樣放在流水下沖洗30min以上，可酌量加入洗滌劑；其次，剪下所需材料用75%的無(wú)水乙醇噴灑植株表面2～3s，倒入0.1%升汞溶液處理20min；最后，用無(wú)菌水涮洗4～5次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基，該消毒方法效果顯著，污染率5%，出苗率90%。常見(jiàn)的消毒劑有次氯酸鈉、次氯酸鈣、漂白粉、氯化汞、酒精、過(guò)氧化氫、溴水、硝酸銀、抗菌素等。外植體的消毒是整個(gè)組培試驗(yàn)中的重中之重，消毒是否徹底關(guān)系到后續(xù)的進(jìn)行，不同來(lái)源及不同老化程度的外植體對(duì)消毒試劑的選擇不同。

3離體培養(yǎng)技術(shù)

培養(yǎng)基的篩選是組織培養(yǎng)的必經(jīng)過(guò)程。培養(yǎng)基不僅為外植體創(chuàng)造內(nèi)部小環(huán)境，而且為植物提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基的選擇不同以及所加入植物激素種類及濃度不同，對(duì)外植體腋芽啟動(dòng)、增殖、分化培養(yǎng)及壯苗生根產(chǎn)生的效果不同。在快繁過(guò)程中，人們應(yīng)根據(jù)不同的需求來(lái)選擇不同培養(yǎng)基種類、激素濃度。

3.1腋芽誘導(dǎo)

在紅杉組培快繁試驗(yàn)中，利用莖段為外植體獲取芽是最快最直接最有效的途徑之一。紅杉誘導(dǎo)芽比較容易，對(duì)植物激素的選擇不專一。同一激素不同濃度以及同一濃度不同激素種類的搭配使用對(duì)芽的誘導(dǎo)生長(zhǎng)有不同的影響。在紅杉腋芽誘導(dǎo)過(guò)程中，MS為常用的培養(yǎng)基，6-BA和KT為主要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，6-BA、KT均能促進(jìn)培養(yǎng)體上不定芽的分化和形成，在基本培養(yǎng)基上單獨(dú)使用1.0～2.0mg/L的6-BA可成功誘導(dǎo)新生芽發(fā)生；將6-BA與KT配合使用則需適當(dāng)降低6-BA的使用濃度，且KT濃度應(yīng)以較低（0.5～1.5mg，L）為宜。另外，不同的季節(jié)取材對(duì)不定芽的誘導(dǎo)也具有一定影響。

3.2繼代增殖培養(yǎng)

北美紅杉增殖培養(yǎng)中，出苗率、出苗質(zhì)量、繁殖系數(shù)的高低直接影響到組織培養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，因此篩選增殖培養(yǎng)基顯得十分重要。6-BA、KT和NAA是北美紅杉增殖培養(yǎng)中常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，附加0.05～0.15mg/L6-BA、0.05～0.1mg/LKT和0.1～0.2mg/LNAA的MS培養(yǎng)基均可滿足北美紅杉不同種源、不同無(wú)性系的增殖培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)3個(gè)優(yōu)良無(wú)性系品種進(jìn)行增殖培養(yǎng)研究，進(jìn)一步證明了MS+0.15mg/L6-BA+0.1 mg/LKT+0.1 mg/LNAA具有較好的增殖效果。在紅杉增殖培養(yǎng)中，除NAA外，將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA、2，4-D和Zt配合使用，也具有較好的增殖效果。本實(shí)驗(yàn)中利用莖段不帶芽為起始外植體采用MS+6-BA2.0mg/L+KT2.0mg/L進(jìn)行分化培養(yǎng)，成功地誘導(dǎo)愈傷組織出芽，該研究發(fā)現(xiàn)1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L也比較適合紅杉不定芽的增殖培養(yǎng)。

3.3生根與壯苗

根據(jù)研究表明，添加0.4～2.5mg/LNAA（萘乙酸）和2.0～3.5mg/LIBA（吲哚丁酸）可誘導(dǎo)北美紅杉生根，根的誘導(dǎo)與芽相比較困難，還有待進(jìn)一步的研究。利用紅杉徒長(zhǎng)枝幼苗生根培養(yǎng)45d后，發(fā)現(xiàn)1/4MS培養(yǎng)基中芽的基部首先有乳白色的小根長(zhǎng)出，隨后在其他不同無(wú)機(jī)鹽濃度培養(yǎng)基中陸續(xù)也有根長(zhǎng)出。2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，紅杉生根明顯受無(wú)機(jī)鹽濃度的影響，生根率順序?yàn)椋篒/4MS>1/2MS>MS，其中發(fā)現(xiàn)1/4MS培養(yǎng)基中生根數(shù)量較多，顏色鮮嫩。1/2MS培養(yǎng)基中根系相對(duì)較長(zhǎng)，但苗的生長(zhǎng)情況不好，基部出現(xiàn)少量的愈傷、莖稈出現(xiàn)枯黃現(xiàn)象。MS培養(yǎng)基生根率較低，基部愈傷較嚴(yán)重且枯頂、枯黃現(xiàn)象較嚴(yán)重。結(jié)果表明，不同無(wú)機(jī)鹽濃度培養(yǎng)基，不僅影響根的分化而且影響植株的健康生長(zhǎng)狀況?；蛐鸵仓萍s著根系的形成，不同無(wú)性系間根的誘導(dǎo)也明顯存在不同的差異。外植體的選擇對(duì)生根的影響也很重要，由于不同的取材部位其內(nèi)源抑制物的積累不同，制約著植物生長(zhǎng)素的吸收。

壯苗與生根對(duì)后期的移栽、煉苗以及提高苗木質(zhì)量十分關(guān)鍵，而影響生根的因素較多，生根環(huán)節(jié)是紅杉組織培養(yǎng)中的難點(diǎn)，雖然前人已在生根方面做了大量的研究，但由于不同無(wú)性系間基因型不同，外植體的內(nèi)源抑制物的積累不同等原因，至今尚未研究出最佳生根配方，因此仍需進(jìn)一步的研究。

4問(wèn)題與展望

（1）目前北美紅杉組織培養(yǎng)技術(shù)已在我國(guó)取得了良好的進(jìn)展，且在一些省份已建立了紅杉組織培養(yǎng)體系并用于生產(chǎn)化。但由于紅杉不是我國(guó)特有的樹(shù)種，在取材上范圍過(guò)于局限，不具有代表陛。因此在今后的研究中，應(yīng)大量引種栽培，對(duì)全國(guó)范圍不同地區(qū)不同優(yōu)良無(wú)性系間取材進(jìn)行離體培養(yǎng)，建立具有穩(wěn)定性高、更具廣譜性的紅杉快繁體系。

（2）紅杉外植體的消毒、滅菌還需進(jìn)一步的研究。在滅菌劑的種類、濃度以及處理時(shí)間上相關(guān)研究報(bào)道較少。目前較常用的是采用75%的乙醇和0.1%升汞二步法滅菌。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇的處理時(shí)間對(duì)莖段腋芽的誘導(dǎo)起著至關(guān)重要作用。在紅杉組織培養(yǎng)中，腋芽的誘導(dǎo)是獲取不定芽的主要途徑，目前在滅菌劑種類選擇上單一，因此應(yīng)加大滅菌技術(shù)方面的研究。

（3）在紅杉增殖培養(yǎng)過(guò)程中，出現(xiàn)枯頂現(xiàn)象影響著組織培養(yǎng)的后續(xù)進(jìn)行。目前紅杉枯頂現(xiàn)象尚未解決，有關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)。