任軍方　楊珺　王丹萍等

摘要：采用根段共培養(yǎng)法，利用不同分離培養(yǎng)基（孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基），通過控制不同培養(yǎng)條件和消毒條件，從卷萼兜蘭菌根中分離內(nèi)生真菌，再用點(diǎn)植法進(jìn)一步分離，得到純化菌株。對(duì)得到的真菌進(jìn)行形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)觀察，用于鑒定真菌的分類。結(jié)果表明：根段共培養(yǎng)法分離時(shí)的表面消毒條件、培養(yǎng)條件和分離培養(yǎng)基的選用均直接影響菌根真菌的分離效果及其多樣性。本研究旨在對(duì)卷萼兜蘭菌根的研究方法進(jìn)行初步試驗(yàn)，為其更深入的研究提供科學(xué)參考。關(guān)鍵字：卷萼兜蘭；茵根；內(nèi)生真菌；分離

海南卷萼兜蘭是海南特有的一種蘭花，其株型優(yōu)美、花朵艷麗、花期較長、具有極高的觀賞價(jià)值。目前，卷萼兜蘭的利用整體上仍處于直接從自然界獲取的低級(jí)階段，近年來，過度的采挖和環(huán)境的惡化使野生資源受到了嚴(yán)重破壞。常規(guī)的分株繁殖速度慢、且易傷母株，而卷萼兜蘭組培困難，無菌苗移栽成活率很低，生長緩慢，不易開花，其原因是蘭根中沒有形成菌根結(jié)構(gòu)，不能為蘭花的生長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。組培苗菌根化是促進(jìn)卷萼兜蘭快速繁殖的重要技術(shù)，也是解決瀕危蘭花資源人工栽培的關(guān)鍵。因此，研究蘭花與其菌根真菌的共培養(yǎng)體系和菌根結(jié)構(gòu)，可為探討菌根真菌與蘭科植物之間的相互作用，以及人工接種大量繁育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

人工栽培于溫室大棚的卷萼兜蘭植株，基質(zhì)為泥炭土，株齡1年以上。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌根真菌的分離及培養(yǎng)。分離方法主要參照郭順星等的關(guān)于菌根菌的分離方法，并略作改進(jìn)。自根尖取蘭科植物新鮮營養(yǎng)根，清水沖洗一洗潔精泡洗2min-清水洗凈→無菌水沖洗3遍→75%酒精消毒20s→無菌水沖洗1遍→2%次氯酸鈉消毒處理（min）→無菌水沖洗3～5遍→無菌濾紙吸干，用滅菌工具在培養(yǎng)皿中將根切成0.5～1cm的根段，根段分別置于孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿3個(gè)根段，于28%、40%光照的恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置光照培養(yǎng)與遮光培養(yǎng)（稱為光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)）對(duì)比；根段表面與橫切面長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至另一平板的中心進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察記錄，直至菌落長滿平板，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2不同濃度的次氯酸鈉溶液的消毒試驗(yàn)。配制不同濃度的次氯酸鈉溶液：0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%9個(gè)濃度。配好后，棕色瓶于陰暗處保存。接種：采用PDA培養(yǎng)基，材料處理方法同上，分別用不同濃度的次氯酸鈉消毒4min，每個(gè)濃度梯度處理的材料接種4皿，光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)各2皿。

2結(jié)果與分析

2.1真菌分離方法的試驗(yàn)效果

2.1.1孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)菌根真菌的結(jié)果。根據(jù)表1，可以發(fā)現(xiàn)2%次氯酸鈉消毒液處理3、4、5min均可分離出真菌，隨著消毒時(shí)間的增加，其雜菌污染率有降低趨勢但也導(dǎo)致真菌豐富度的降低；不同培養(yǎng)方式可以分離出不同的真菌，暗培養(yǎng)的分離效果較光培養(yǎng)好些。該培養(yǎng)基初步分離純化出了5種較典型的真菌，對(duì)其菌落特征進(jìn)行觀察描述（圖1、表2），為后期鑒定分類工作做好準(zhǔn)備。

2.1.2沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)菌根真菌的結(jié)果。從表3可以看出，根段在相同濃度消毒液處理?xiàng)l件下處理3、4min與光、暗培養(yǎng)不同方法均可培養(yǎng)出真菌，消毒處理4min污染率較穩(wěn)定，暗培養(yǎng)分離出的菌根菌數(shù)量比光培養(yǎng)豐富。該培養(yǎng)基分離純化得到3種典型真菌，并做形態(tài)學(xué)觀察描述（圖2、表3）。

2.1.3 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌根真菌的結(jié)果。采用相同濃度的消毒液處理根段，不同處理時(shí)間下，進(jìn)行光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)都能分離出真菌（表5）。在相同處理時(shí)間下，暗培養(yǎng)的污染率均比光培養(yǎng)的污染率小，暗培養(yǎng)分離出的菌根菌數(shù)也較光培養(yǎng)的多，總體上暗培養(yǎng)效果比光培養(yǎng)好。該培養(yǎng)基亦純化得到3種較為典型的真菌（圖3，表6）。

2.2不同消毒液濃度對(duì)真菌分離的影響

用不同濃度的消毒液處理根段，材料消毒時(shí)間均為4min（表7），都分離出了真菌。對(duì)比可知，不同的次氯酸鈉濃度對(duì)真菌的分離效果不同，消毒液濃度增高，則培養(yǎng)過程中雜菌污染有降低趨勢，菌根菌落數(shù)也相應(yīng)有所減少，濃度為1.5%～3.0%的消毒液處理培養(yǎng)的效果較佳。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)不同消毒時(shí)間和不同培養(yǎng)方式的分離結(jié)果進(jìn)行比較，以及3種不同培養(yǎng)基的對(duì)比，得出如下結(jié)論：

（1）以75%酒精處理30s+2%次氯酸鈉溶液處理4min進(jìn)行表面消毒，為較適宜的處理方法。用此方法處理材料分離培養(yǎng)真菌的效果相對(duì)穩(wěn)定，消毒液濃度過低或消毒處理時(shí)間過短均會(huì)造成雜菌污染嚴(yán)重，濃度過高或處理時(shí)間過長可能會(huì)使菌根菌大量致死，達(dá)不到分離目的。

（2）以孟加拉紅培養(yǎng)基，為較適宜的培養(yǎng)基。試驗(yàn)采用的3種培養(yǎng)基均為真菌的選擇性培養(yǎng)基，適合于真菌生長，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，孟加拉紅培養(yǎng)基分離菌根具有一定優(yōu)勢，其因成分中包含玫瑰紅鈉而得名，該物質(zhì)有抑制菌落瘋長的作用，避免菌物混為一體，便于觀察、計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)。培養(yǎng)基為半合成固體培養(yǎng)基，成分具有一定比例的氯霉素，避免自主配制時(shí)抗生素失效而影響效果。因此，孟加拉紅培養(yǎng)基用于分離卷萼兜蘭菌根真菌較為適宜。