李留洋

金黃色葡萄球菌是生活中最常見的病原菌之一，也是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重的感染。該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧。容易受金黃色葡萄球菌污染的食品主要為乳制品、蛋及蛋制品、各類熟肉制品，其次是含有乳類的冷凍食品等，因此對(duì)于該菌的檢驗(yàn)也被確定為食品致病性菌種檢驗(yàn)中的重要項(xiàng)目。

按照現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)方法，金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法分為第一法定性檢驗(yàn)、第二法平板計(jì)數(shù)法（適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品），以及第三法MPN計(jì)數(shù)法（適用于金黃色葡萄球菌含量較低的食品）。

第一法定性檢驗(yàn)過(guò)程包括樣品處理、樣品增菌、平板分離劃線、初步鑒定、確證鑒定這5個(gè)步驟，整個(gè)流程全部完成至少需要5天時(shí)間。第二法平板計(jì)數(shù)法包括5個(gè)步驟——樣品稀釋、樣品接種涂布、典型菌和可疑菌計(jì)數(shù)、鑒定試驗(yàn)、結(jié)果計(jì)算，整個(gè)流程全部完成至少需要4天時(shí)間。第三法MPN計(jì)數(shù)法同樣包括5個(gè)步驟，即樣品稀釋、樣品增菌、平板分離劃線、鑒定試驗(yàn)、查MPN表確認(rèn)結(jié)果，整個(gè)流程全部完成至少需要5天時(shí)間。以下將對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)流程進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，并對(duì)難點(diǎn)、注意事項(xiàng)進(jìn)行梳理和講解。

1 第一法：金黃色葡萄球菌定性

1.1 樣品處理

固態(tài)和半固態(tài)樣品：稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯中，充分混勻。

液體樣品：吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，振蕩混勻。

1.2 樣品增菌

將上述樣品勻液置于36±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。

1.3 平板分離劃線

該步驟是整個(gè)金黃色葡萄球菌檢測(cè)環(huán)節(jié)中最重要的步驟之一，因?yàn)槠桨鍎澗€分離的效果決定了可疑菌落的判定和選擇。平板劃線選擇三分法或四分法則分離效果較好，更容易出現(xiàn)單菌落平板。

1.4 初步鑒定

分離的培養(yǎng)基選用Baird-Parker平板（BP平板）和血平板。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)，菌落直徑為2～3mm，顏色呈灰黑色至黑色、有光澤，常有淺色（非白色）邊緣，周圍繞以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰帶，當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感;有時(shí)可見到不分解脂肪的菌株——除沒有不透明圈和清晰帶外，其他外觀基本相同;從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其顏色常較典型菌落略淺，且外觀可能較為粗糙，質(zhì)地較干燥。在血平板上，金黃色葡萄球菌形成的菌落較大，呈圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍可見完全透明的溶血圈。結(jié)合兩種培養(yǎng)基的特性即可確定可疑菌落。

1.5 確證鑒定

1.5.1 染色鏡檢

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞和莢膜，直徑約為0.5～1μm。

1.5.2 血漿凝固酶試驗(yàn)

挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個(gè)可疑菌落（小于5個(gè)則全選），分別接種到5mL BHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，在36±1℃條件下培養(yǎng)18～24h。

購(gòu)買凍干兔血漿，按照說(shuō)明書加入0.5mL無(wú)菌生理鹽水溶解，然后加入0.3mL BHI培養(yǎng)物，輕微搖晃至完全溶解或按照說(shuō)明書直接將0.8mL BHI培養(yǎng)物加入到凍干兔血漿中輕微搖晃至完全溶解（一般選用后者），置于恒溫培養(yǎng)箱中，每半小時(shí)觀察一次凝集情況，連續(xù)觀察6h。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，若金黃色葡萄球菌呈強(qiáng)陽(yáng)性，一般1～2h就可凝集，有的甚至長(zhǎng)達(dá)3h才會(huì)凝集。需注意，切忌直接放置6h才進(jìn)行觀察，因?yàn)榫N凝固后會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象，隔夜自溶是常見的判斷。凝集的最好方法就是倒立觀察結(jié)塊，如倒立后內(nèi)容物不下落，則效果較好。

1.5.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂純化

典型金黃色葡萄球菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上一般呈黃色，較容易判斷;有些呈淡色、白色，但不常見。如果認(rèn)為鑒定結(jié)果可疑，可挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL BHI，36±1℃培養(yǎng)18～48h，重復(fù)試驗(yàn)。

2 第二法：平板計(jì)數(shù)法

2.1 樣品稀釋

固態(tài)和半固態(tài)樣品：稱取25g樣品至225mL稀釋液中（可選用0.85%的生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液）充分混勻，即為稀釋度10-1溶液，之后進(jìn)行梯度稀釋。

液體樣品：吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，振蕩混勻。

2.2 樣品接種涂布

選擇性平板采用BP平板，該平板可提前一天配制——潔凈臺(tái)中放置過(guò)夜或置于25～50℃培養(yǎng)基中干燥，直到平板表面的水珠消失后備用。該步驟的目的是檢查平板是否染菌，最重要的是揮發(fā)培養(yǎng)基內(nèi)部的水分以利于涂布。每個(gè)梯度分別吸取1mL樣品勻液，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別接種至3塊BP平板上，然后用無(wú)菌涂布棒涂布整個(gè)平板。如涂布棒不是一次性的，可以提前滅菌備用，也可用酒精燈灼燒2min以上冷卻備用。涂布時(shí)盡量涂干，注意不要觸及平板邊緣。此后將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36±1℃培養(yǎng)1h。等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置后于36±1℃培養(yǎng)24～48h（倒置培養(yǎng)的目的在于防止與空氣中的細(xì)菌交叉污染，還可防止培養(yǎng)基水分揮發(fā)太快），觀察結(jié)果。

2.3 典型菌和可疑菌計(jì)數(shù)

從圖5可以看出，10-1稀釋度下菌落生長(zhǎng)繁多，難以計(jì)數(shù);最適計(jì)數(shù)范圍為20～200CFU，故10-2稀釋度滿足計(jì)數(shù)要求，可疑菌總數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi);而10-3稀釋度下可疑菌落很少，故舍去。從10-2梯度上可以看出，具有沉淀環(huán)的菌落很多，這就需要從這些菌種中選擇5個(gè)或以上可疑菌落進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，但是這5個(gè)菌落該如何選擇才能使最終的結(jié)果最接近真實(shí)值是需要技巧的。

首先可以觀察到，平板上的可疑菌落沉淀環(huán)有兩種：一種是和菌落有些距離的沉淀環(huán)，記為可疑菌1——經(jīng)過(guò)后期確認(rèn)試驗(yàn)可知此菌為干擾菌，即表皮葡萄球菌;另一種是從菌落邊緣直接延伸出來(lái)的沉淀環(huán)，記為可疑菌2。將所有可疑菌1與所有可疑菌2的菌落數(shù)出來(lái)，可判斷出可疑菌落是兩類不同的細(xì)菌。根據(jù)兩者的比例，決定挑選可疑菌落數(shù)的分配情況，比例大的多選，比例小的少選。

2.4 鑒定試驗(yàn)

平板法的鑒定試驗(yàn)過(guò)程及注意事項(xiàng)按第一法的“1.4”“1.5”進(jìn)行。

2.5 結(jié)果計(jì)算

①若只有一個(gè)稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20～200CFU之間，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式（1）計(jì)算;

②若最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)小于20CFU，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式（1）計(jì)算;

③若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式（1）計(jì)算;

④若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU，而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在20～200CFU范圍內(nèi)，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式（1）計(jì)算;

⑤若2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板典型菌落數(shù)均在20～200CFU之間，應(yīng)按式（2）計(jì)算。

式（1）：

式（1）中，T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);A為某一稀釋度典型菌落的總數(shù);B為某一稀釋度鑒定為陽(yáng)性的菌落數(shù);C為某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);d為稀釋因子。

式（2）：

式（2）中，T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);A1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù);B1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定為陽(yáng)性的菌落數(shù);C1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);A2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù);B2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定為陽(yáng)性的菌落數(shù);C2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);1.1為計(jì)算系數(shù);d為稀釋因子（第一稀釋度）。

3 第三法：MPN計(jì)數(shù)法

3.1 樣品稀釋

按照“2.1”進(jìn)行。

3.2 樣品增菌

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別接種1mL樣品勻液至7.5%氯化鈉肉湯管（如接種量超過(guò)1mL，則用雙料7.5%氯化鈉肉湯）。每個(gè)稀釋度接種3管，將上述接種物于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。用接種環(huán)從培養(yǎng)后的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于Baird-Parker平板，36±1℃下培養(yǎng)24～48h。

3.3 平板分離劃線

用接種環(huán)從培養(yǎng)后的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于Baird-Parker平板，36±1℃下培養(yǎng)24～48h。

3.4 鑒定試驗(yàn)

MPN法的鑒定試驗(yàn)過(guò)程及注意事項(xiàng)按第一法的“1.4”“1.5”進(jìn)行。

3.5 查MPN表確認(rèn)結(jié)果

MPN結(jié)果按GB 4789.10-2016中附錄C查詢。

4 總結(jié)

以上便是金黃色葡萄球菌檢樣3種方法的簡(jiǎn)單操作過(guò)程。該菌檢測(cè)過(guò)程的關(guān)鍵步驟是劃線分離和可疑菌落的判定，其中不要放過(guò)任何一個(gè)可疑菌落;檢測(cè)人員進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)時(shí)，需要注意對(duì)時(shí)間和凝固現(xiàn)象的把控，有些細(xì)節(jié)的處理還需要大量經(jīng)驗(yàn)的積累。