陳剛　馬曉

摘要：研究了香蕉皮中多酚氧化酶（PPO）的特性。結(jié)果表明，香蕉皮PPO的最適溫度為35℃，最適pH值為6.5.75℃以上水浴5min，100%水浴20s可以完全鈍化香蕉皮PPO的活性，香蕉皮PPO存在同工酶。香蕉皮PPO的最適反應(yīng)底物濃度為0.125mol/L。動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，香蕉皮PPO的Km=0.087922mol/L，Vrnax=0.009240D404/min?？疾榱藱幟仕帷喠蛩釟溻c、抗壞血酸、EDTA-2Na對(duì)PPO的褐變抑制效果和PPO酶液4℃保存時(shí)間與其活性的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：香蕉皮；多酚氧化酶；特性

香蕉屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）的多年生草本植物，香蕉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，且質(zhì)地柔軟，味道鮮美，是世界四大水果之一。但是香蕉作為呼吸躍變型水果很難儲(chǔ)存運(yùn)輸，酶促褐變不僅影響香蕉外觀、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和加工性能，而且還大大降低耐貯性。香蕉皮是香蕉的主要廢棄物，約占果實(shí)重量的30%，其多酚氧化酶是影響酶促褐變的主要原因，多酚氧化酶會(huì)催化多酚氧化為醌，醌聚合并與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，產(chǎn)生黑色素沉淀，相應(yīng)研究也較多。本試驗(yàn)對(duì)香蕉皮多酚氧化酶的特性進(jìn)行研究，為香蕉貯藏和加工應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

香蕉，取市場(chǎng)售賣香蕉Musa nana Lour，新鮮無黑斑、無病蟲害、無機(jī)械傷、大小均勻、組織完好的為試驗(yàn)材料。

1.2方法

1.2.1 PPO粗酶液的制備。取新鮮香蕉皮6g，加2.5倍量的pH值6.0磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，冰浴研磨至勻漿。然后再以8000r/min、4℃冷凍離心機(jī)離心5min，上清液即為PPO粗酶液。

1.2.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。取pH值6.0的磷酸鹽緩沖液2mL，加入0.2mol/L的鄰苯二酚溶液1.0mL，0.1mLPPO粗酶液至比色皿中，室溫下迅速混合。香蕉皮PPO的最適波長(zhǎng)在400～420nm，試驗(yàn)操作過程中測(cè)得在波長(zhǎng)400～420nm只有1個(gè)峰值，且香蕉皮PPO多酚氧化酶的褐變產(chǎn)物在波長(zhǎng)414nm處之后吸光度變化值（OD值）明顯一直降低，故分別在波長(zhǎng)400、402、404、406、408、410、412、414nm處測(cè)吸光度變化值（0D值）進(jìn)一步確定最適波長(zhǎng)。酶液加入后開始測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度，每15s記錄1次吸光度，共記錄30s內(nèi)的吸光度的變化值。并且重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.2.3酶活力與pH值的關(guān)系。在30℃時(shí)，于pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.8、9.0的一系列磷酸鹽緩沖液2mL中，分別加入濃度為0.2mol/L的鄰苯二酚溶液ImL，PPO粗酶液0.1mL，按照1.2.2方法測(cè)定在波長(zhǎng)404nm處不同pH值時(shí)的吸光度的變化值，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.2.4酶活力與溫度的關(guān)系。取pH值6.0的磷酸鹽緩沖液2mL、濃度為0.2mol/L的鄰苯二酚溶液ImL和PPO粗酶液0.1mL分別在0、5、10、1 5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃的水浴中水浴5min，取出迅速冷卻至室溫，再按照1.2.2方法測(cè)定在波長(zhǎng)404nm處不同溫度時(shí)的吸光度的變化值，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.2.5酶活力與底物濃度的關(guān)系。在30℃時(shí)，在2mL磷酸鹽緩沖液中分別加入濃度為0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20、0.225、0.25mol/L的鄰苯二酚溶液lml和PPO粗酶液0.1mL，迅速搖勻。按照

1.2.2方法測(cè)定在波長(zhǎng)404nm處不同底物濃度時(shí)的吸光度的變化值，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.2.6酶活力與褐變抑制劑的關(guān)系。30℃時(shí)，在2mL磷酸鹽緩沖液中加入底物濃度0.125mol/L鄰苯二酚0.1mL，分別加入（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L）檸檬酸0.1mL、（0、0.01、0.02、0.03、0.04mol/L）亞硫酸氫鈉0.1mL、（0、0.0025、0.0050、0.0075、0.01mol/L）抗壞血酸0.1mL、（0、0.0025、0.0050、0.0075、0.01mol/L）EDTA-2Na 0.1mL，粗酶液0.1mL，保溫10min，按照1.2.2方法測(cè)定在波長(zhǎng)404nm處不同底物濃度時(shí)的吸光度的變化值，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.2.7酶活力與酶液保存時(shí)間的關(guān)系。提取的新鮮PPO粗酶液放置在4℃冰箱中保存7天。每天同一時(shí)刻取出部分PPO粗酶液進(jìn)行試驗(yàn)，于2mL磷酸鹽緩沖液中加入0.125mol/L的鄰苯二酚溶液1mL，PPO粗酶液0.1mL，30℃水浴加熱5min后取出迅速冷卻至室溫然后迅速搖勻，按照1.2.2方法測(cè)定在波長(zhǎng)404nm處的吸光度的變化值，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1反應(yīng)體系波長(zhǎng)的測(cè)定

反應(yīng)產(chǎn)物在波長(zhǎng)400～414nm下的吸光度的變化值如圖1。由圖1得出反應(yīng)產(chǎn)物在波長(zhǎng)404nm處有最大吸收峰，即在此吸收波長(zhǎng)處反應(yīng)產(chǎn)物有最大吸光度的變化值。因此確定在以后的測(cè)定中都以波長(zhǎng)404nm為測(cè)定工作波長(zhǎng)。

2.2酶活力與pH值的關(guān)系

經(jīng)測(cè)定，pH值不同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度的變化值如圖2所示。從圖2可知，反應(yīng)體系pH值對(duì)香蕉皮PPO酶活力的影響比較明顯，在pH值4.5和6.5有最大吸光度的變化值，說明在pH值4.5和6.5時(shí)香蕉皮PPO酶活力較大，且在pH值6.5時(shí)最大；在pH值<4.5時(shí)，酶活力隨著pH值的降低也逐漸降低；在pH值<3.0時(shí)，香蕉皮PPO活性明顯被抑制；而在pH值>6.5時(shí)，隨著pH值的逐漸增大，酶活力仍然逐漸減?。划?dāng)pH值>7.5時(shí)，酶活力得到了明顯的抑制。主要原因是PPO為堿性蛋白，在較強(qiáng)的酸性條件下，輔基銅將以銅離子的形式解離出來，從而使酶失活；而在堿性條件下輔基銅會(huì)解離成Cu（OH）₂，使酶活力明顯降低。同時(shí)由圖2看到香蕉皮PPO在pH值為4.5和6.5有2個(gè)吸收峰，這表明香蕉皮PPO有同工酶的存在，已有文獻(xiàn)報(bào)道了牛蒡、草菇、板栗、蓮藕等的多酚氧化酶具有同工酶。因此在香蕉貯藏加工中調(diào)節(jié)pH能減輕香蕉的酶褐變程度。

2.3酶活力與溫度的關(guān)系

溫度對(duì)多酚氧化酶的影響作用是兩面的：隨著溫度的升高，酶的催化反應(yīng)速率會(huì)得到升高，當(dāng)溫度達(dá)到一定程度，就會(huì)促使酶蛋白變性失活，是2種對(duì)抗效應(yīng)的綜合反應(yīng)。香蕉皮PPO粗酶液在不同溫度下處理5min后的活性如圖3所示。由圖3可知，香蕉皮PPO的最適溫度為35℃，溫度低于20℃時(shí)酶活力較低，高于40℃酶開始鈍化，到75℃以上處理5分鐘酶已喪失活性。

2.4酶活力與底物濃度的關(guān)系

如圖4可知，在底物濃度較低的時(shí)候，隨著底物濃度的增加，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度也是相應(yīng)增加的，但是當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?.1 25mol/L之后，增加底物濃度，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度的變化值不再變化。在底物濃度達(dá)到0.25mol/L時(shí)，酶活力仍保持一定的反應(yīng)速度，并沒有隨底物濃度的增加而對(duì)酶活力產(chǎn)生抑制作用。

2.6酶活力與酶液保存時(shí)間的關(guān)系

6天內(nèi)酶活力的變化情況如圖6。由圖6可以看出，新提取PPO粗酶液活性最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性逐漸降低?？赡苁且?yàn)樘崛〕鰜淼南憬镀PO粗酶液在沒有其他附作物（纖維素、糖等）的保護(hù)下被氧化或降解了。

2.7不同褐變抑制劑對(duì)酶活力的影響

檸檬酸、NaHS03、抗壞血酸、EDTA-2Na 4種褐變抑制劑對(duì)酶活力的影響如圖7、8、9。

由圖7可知，隨著檸檬酸濃度的增加，酶活力逐漸降低。當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到0.015mol/L的時(shí)候，酶活力達(dá)到最低，因?yàn)闄幟仕岬?個(gè)羧基對(duì)香蕉皮PPO的輔基銅有螯合作用；但是再增加檸檬酸濃度之后，酶活力會(huì)先變大再減小，因?yàn)闄幟仕崮芨淖兎磻?yīng)體系的酸堿環(huán)境，正如圖2所示在pH值4.5的時(shí)候有1個(gè)波峰，所以當(dāng)檸檬酸濃度為0.2 mol/L時(shí)會(huì)有所增強(qiáng)，在0.3mol/L時(shí)，對(duì)酶活力的抑制效果最明顯。

圖8可得，NaHS03對(duì)PPO酶活力具有較明顯的抑制效果。隨著NaHS03濃度的增加，酶活力逐漸降低，當(dāng)NaHS03濃度達(dá)到0.04mol/L之后，酶活力降到很低。這是因?yàn)镹aHS03不可逆地與中間產(chǎn)物醌作用生成無色的產(chǎn)物，并且具有漂白和防止微生物污染的作用。NaHSO₃濃度在0.04mol/L時(shí)抑制效果最好。

由圖9可知，抗壞血酸能有效抑制PPO酶活力，當(dāng)抗壞血酸濃度為0.01 mol/L時(shí)，酶液基本失活?？箟难嵩诙喾友趸阁w系中，對(duì)酶褐變的抑制機(jī)理是與中間產(chǎn)物鄰二醌作用生成鄰二酸和脫氫抗壞血酸，防止中間產(chǎn)物進(jìn)一步聚合成黑色素?？箟难岷蛠喠蛩釟溻c抑制褐變?cè)谄渌墨I(xiàn)中也有類似結(jié)論。

而EDTA-2Na卻沒有抗壞血酸那樣顯著的抑制效果，EDTA-2Na是常用的金屬絡(luò)合物，主要通過螯合PPO中的輔基銅從而達(dá)到抑制酶活力的目的，相對(duì)來說抑制效果較差，一般不單獨(dú)使用。

3討論

試驗(yàn)表明，香蕉皮PPO褐變反應(yīng)的最適測(cè)定波長(zhǎng)是404nm；PPO在pH值4.5和6.5時(shí)有2個(gè)峰值，表明PPO有同工酶存在，且在pH值6.5時(shí)香蕉皮PPO的活性最大；香蕉皮中PPO的最適溫度是35℃，高于40%酶開始鈍化，到75%以上處理5mn酶已喪失活性；而趙立的研究結(jié)論認(rèn)為：香蕉皮多酚氧化酶的最適溫度為30%，最適pH值為4.5和5.5。鮑金勇的研究結(jié)果表明：香蕉皮PPO最適溫度為30%、最適pH值5.5、并且香蕉皮PPO有同工酶；上述2項(xiàng)研究?jī)?nèi)容中關(guān)于香蕉皮PPO最適溫度是溫度梯度為1 0℃，且這2項(xiàng)研究中沒有考查35%時(shí)的酶活性，因此，本研究認(rèn)為香蕉皮PPO最適溫度為35℃應(yīng)是更精確的。酶的最適pH值研究結(jié)論不一致，可能是供試材料品種不一樣所導(dǎo)致的。PPO儲(chǔ)存時(shí)間越久，其活力會(huì)降低；香蕉皮PPO符合動(dòng)力學(xué)方程，相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式為V=0.00924[S]/（0.087922+[S]）；0.04mol/L的亞硫酸氫鈉和0.01mol/L的抗壞血酸對(duì)防止香蕉皮PPO的褐變有明顯的抑制作用。