【摘 要】目的：探究香豆素（coumarin）對(duì)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）疾病的影響及其具體作用機(jī)制。方法：在Venny2.1.0網(wǎng)站將香豆素與OA的作用靶點(diǎn)交叉后，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作PPI分析，并利用Autodock vina1.1.2對(duì)篩選到的香豆素和OA疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。接下來(lái)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為對(duì)照組、IL-1β組和IL-1β+coumarin組。CCK-8法檢測(cè)香豆素對(duì)C28/I2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，qPCR及免疫熒光檢測(cè)各組OA相關(guān)標(biāo)志物及SASP因子表達(dá)情況，并利用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老水平。結(jié)果：共篩選到香豆素作用靶點(diǎn)196個(gè)，其中香豆素與OA共同作用靶點(diǎn)127個(gè)。PPI分析篩選到了CCND1、EGFR、ERBB2、MAPK14 等4 個(gè)香豆素治療OA 的可能的核心靶點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果顯示，香豆素與核心靶點(diǎn)CCND1、EGFR、ERBB2、MAPK14能形成較穩(wěn)定的復(fù)合物。CCK-8結(jié)果顯示，5～15 μmol/L香豆素處理C28/I2細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高于20 μmol/L的香豆素處理則會(huì)抑制細(xì)胞活性（Plt;0.05）；其中10 μmol/L香豆素在24 h、48 h、72 h均會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖（Plt;0.05），且處理48 h增殖最為明顯（Plt;0.05）。qPCR結(jié)果顯示，10 μmol/L的香豆素處理48 h能降低C28/I2細(xì)胞中細(xì)胞衰老標(biāo)志基因p16、p21的mRNA水平，β-半乳糖苷酶染色的結(jié)果與qPCR的結(jié)果一致。香豆素處理后SASP因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP9、MMP13 的mRNA 水平降低（Plt;0.05）。同樣地，免疫熒光結(jié)果也顯示香豆素處理后部分SASP 因子表達(dá)水平降低。結(jié)論：香豆素可能通過(guò)作用于p38/MAPK14通路，抑制SASP導(dǎo)致的細(xì)胞衰老及軟骨分解，從而治療骨關(guān)節(jié)炎。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞衰老；衰老相關(guān)分泌表型；骨關(guān)節(jié)炎；香豆素；衰老相關(guān)分泌表型因子

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-12-29

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，主要是由關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的破壞引起。骨關(guān)節(jié)炎是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎形式，也是世界上導(dǎo)致殘疾的主要原因之一，截至2015年，全球約有2.37億人受到影響。研究顯示衰老是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的主要原因之一，在60 歲以上的人群中，約有10% 的男性和18% 的女性被骨關(guān)節(jié)炎疾病困擾。骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍縮小，手臂和腿部無(wú)力或麻木等，通常這些癥狀會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)逐漸加重。

細(xì)胞衰老作為一種應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)引起永久性細(xì)胞周期停滯并導(dǎo)致衰老相關(guān)分泌表型（senescenceassociatedsecretory phenotype，SASP）。當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)衰老表型時(shí)，會(huì)產(chǎn)生分泌蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子以及蛋白酶等多種SASP因子，而SASP因子又會(huì)以自分泌方式進(jìn)一步加劇衰老細(xì)胞的進(jìn)程。

香豆素是一個(gè)天然存在的酚類(lèi)化合物家族，它由α-吡喃酮環(huán)與苯環(huán)稠合而成[1]。1820年，AugustVogel從零陵香豆和茅香中首次分離出了香豆素，香豆素的名稱(chēng)取自法語(yǔ)單詞coumarou，代表零陵香豆，在植物學(xué)上一度被稱(chēng)為CoumarounaodorataAubl[2]。如今已在多種植物、細(xì)菌和真菌中鑒定出約1 300多種天然香豆素。天然和合成的香豆素化合物，因其多樣化的藥理和生物學(xué)特性而受到藥物化學(xué)家和藥物設(shè)計(jì)科學(xué)家的廣泛關(guān)注，其中許多具有抗癌[3-6]、抗菌[7-9]、抗病毒[10]、抗炎[11-12]等作用。已有研究報(bào)道，香豆素家族成員瑞香素能抑制人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)[13]。但香豆素在骨關(guān)節(jié)炎疾病中的作用尚不明確，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)，分子對(duì)接輔助驗(yàn)證，探究了香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎的藥效和機(jī)理。為后續(xù)開(kāi)發(fā)骨關(guān)節(jié)炎治療藥物提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

C28/I2由美國(guó)耶魯大學(xué)劉傳聚教授饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，青鏈霉素混合液購(gòu)于北京索萊寶生物科技公司。C28/I2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2 藥物及試劑

胎牛血清、香豆素和IL-1β 購(gòu)自Med Chemexpress（貨號(hào)：HY-T1000、HY-N0709、HY-P73149）；CCK-8試劑盒、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天（貨號(hào)：C0038、C0602）；TRIzol購(gòu)自Invitrogen（貨號(hào)：15596026）；SYBR green購(gòu)自諾唯贊（貨號(hào)：Q311-02/03）；anti-IL6、anti-MAPK14、MMP9、MMP13 抗體購(gòu)于proteintech（貨號(hào)：21865-1-AP、51115-1-AP、27306-1-AP、18165-1-AP）。

1.3 儀器

定量PCR儀購(gòu)于上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，倒置顯微鏡購(gòu)自上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.4 引物

定量PCR引物序列見(jiàn)表1。

1.5 香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制預(yù)測(cè)

1.5.1 香豆素靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中以“coumarin”為關(guān)鍵詞搜索，得到香豆素可能的靶點(diǎn)。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中以“coumarin”為關(guān)鍵詞搜索，得到香豆素的Smile號(hào)、Inchi號(hào)以及3D結(jié)構(gòu)；通過(guò)Smile號(hào)在Swiss target prediction、SuperPred數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得香豆素可能的靶點(diǎn)。通過(guò)Inchi號(hào)在Batman數(shù)據(jù)庫(kù)獲得香豆素可能的靶點(diǎn)。通過(guò)3D結(jié)構(gòu)在Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得香豆素可能的靶點(diǎn)。將所有數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)匯總。在軟件Cytoscape3.7.2中繪制香豆素結(jié)合預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5.2 骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在Drugbank、OMIM、GeneCards、TTD、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)中以“osteoarthritis”為關(guān)鍵詞搜索，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到骨關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)基因。

1.5.3 香豆素及骨關(guān)節(jié)炎共有靶點(diǎn)篩選

將香豆素及骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)去重復(fù)值匯總后上傳至Venny2.1.0軟件，得到二者共有靶點(diǎn)后，繪制Venn圖。

1.5.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

將香豆素及骨關(guān)節(jié)炎共有靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制香豆素靶點(diǎn)與骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）和香豆素靶向骨關(guān)節(jié)炎共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5.5 GO、KEGG富集分析

將香豆素-骨關(guān)節(jié)炎的共有靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析得到GO結(jié)果表格，手動(dòng)篩選P 值小于0.05 的結(jié)果后，利用Sangerbox 3.0 網(wǎng)站的KEGG富集分析功能，繪制KEGG富集分析圖。

1.5.6 分子對(duì)接

用PyMOL軟件打開(kāi)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)得到的香豆素的3D結(jié)構(gòu)文件，另存為PDB格式。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PPI網(wǎng)絡(luò)中與其余蛋白關(guān)聯(lián)最緊密的核心蛋白的3D 結(jié)構(gòu)文件。在PyMOL 軟件中完成對(duì)接前準(zhǔn)備。利用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接，依照結(jié)合能（Affinity，kcal/mol）來(lái)預(yù)測(cè)香豆素與靶點(diǎn)受體之間的結(jié)合強(qiáng)度，通過(guò)Py‐MOL可視化結(jié)合能最低的構(gòu)象。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將C28/I2 細(xì)胞接種至96 孔板，細(xì)胞密度為5×103/孔，每孔加100 μL 培養(yǎng)基。細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、control 組和實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，Control組正常培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組使用不同濃度的香豆素處理。向所有組別加入含有10% 體積比CCK-8的完全培養(yǎng)基孵育2 h，孵育結(jié)束后，酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度（absorbance，A）值（A450 nm）。細(xì)胞活性=（A450 nm實(shí)驗(yàn)組-A450 nm陰性對(duì)照組）/（A450 nm control組-A450 nm陰性對(duì)照組）。

1.7 實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞分組

將C28/I2 細(xì)胞分為正常培養(yǎng)的Control 組、IL-1β 組及IL-1β+coumarin組。將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，Control組繼續(xù)正常培養(yǎng)，向IL-1β組及IL-1β+coumarin組加入20 ng/mL的IL-1β。IL-1β處理48 h后，將Control組、IL-1β組培養(yǎng)基換為正常完全培養(yǎng)基，向IL-1β+coumarin組加入含有10 μmol/L香豆素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)

向每孔6孔板培養(yǎng)的C28/I2細(xì)胞中加入500 μL Trizol試劑，室溫放置10 min。將Trizol試劑連同細(xì)胞沉淀一起轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL Rnase-Free離心管中，加入100 μL氯仿溶液。混勻后，4 ℃ 10 600×g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL Rnase-Free離心管并加入500 μL異丙醇溶液?；靹蚝? ℃ 10 600×g離心5 min。棄上清，加入500 μL 75%乙醇溶液 4 ℃ 10 600×g離心2 min，棄上清。重復(fù)此步驟。自然風(fēng)干沉淀后加入30 μL DEPC 水溶解RNA。使用ABScriptⅢ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。然后，使用ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix 進(jìn)行RT-qPCR。GAPDH 作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 細(xì)胞免疫熒光

細(xì)胞分組及IL-1β/coumarin處理同1.8。處理結(jié)束后加入PBS溶液重復(fù)洗3次，每次5 min。加入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液室溫15 min，棄多聚甲醛溶液，加入0.5%Triton溶液（PBS）室溫20 min。PBS溶液重復(fù)洗3次，每次5 min。加入1%的BSA封閉液30 min后，加入一抗4 ℃過(guò)夜。PBS溶液重復(fù)洗3次，每次5 min。后續(xù)步驟需避光，加入熒光二抗，37 ℃孵育4 h后用PBS溶液重復(fù)洗4次，加入DAPI染液染色10 min，PBS溶液重復(fù)洗3次，加入20 μL的50%甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍片。

1.10 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色

細(xì)胞分組及IL-1β/coumarin處理同1.8。處理結(jié)束后加入PBS清洗1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。棄固定液用PBS清洗3次。加入1 mL配置好的染色工作液，37 ℃孵育過(guò)夜，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來(lái)呈現(xiàn)。多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.1.1 香豆素靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“coumarin”，最匹配項(xiàng)即為香豆素，通過(guò)搜索結(jié)果得到香豆素藥物的3D結(jié)構(gòu)、Smile號(hào)以及InchI號(hào)。在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“coumarin”，在左側(cè)狀態(tài)欄中選擇“Targets”選項(xiàng)后得到香豆素的部分靶點(diǎn)。將香豆素的InchI號(hào)粘貼進(jìn)Batman數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置檢索參數(shù)中默認(rèn)評(píng)分gt;20，P 值lt;0.05，點(diǎn)擊“start”進(jìn)行檢索并得到香豆素的部分靶點(diǎn)。將香豆素的Smile號(hào)粘貼進(jìn)Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種“Homo sapiens”，點(diǎn)擊“predict targets”，檢索得到香豆素的部分靶點(diǎn)。將香豆素的3D結(jié)構(gòu)上傳至Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)，填寫(xiě)郵箱用于接收結(jié)果文檔。將香豆素的Smile號(hào)粘貼至SuperPred數(shù)據(jù)庫(kù)中，點(diǎn)擊“Search”，下方出現(xiàn)香豆素的2D結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊“start”，得到香豆素的部分靶點(diǎn)。將所有數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的香豆素預(yù)測(cè)靶點(diǎn)匯總，去除重復(fù)項(xiàng)后共篩選到香豆素的作用靶點(diǎn)201個(gè)（圖1A）。

2.1.2 骨關(guān)節(jié)炎潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在Drugbank、OMIM、Genecards、MalaCards、TTD、Disgenet、Pharmgkb、CTD、HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞檢索，得到骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶點(diǎn)，在去除重復(fù)項(xiàng)后，共得到OA的潛在靶點(diǎn)23 150個(gè)。

2.1.3 香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)篩選

將香豆素的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果及OA疾病的治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果上傳至Venny2.1.0網(wǎng)站，通過(guò)網(wǎng)站的在線工具將香豆素的靶點(diǎn)及OA的靶點(diǎn)進(jìn)行映射并繪制Venny圖（圖1B）。

2.1.4 香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將篩選得到的香豆素治療OA靶點(diǎn)文件上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)的在線工具對(duì)127個(gè)香豆素治療OA的可能靶點(diǎn)進(jìn)行分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件完成可視化，隱藏和其余靶點(diǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)的單個(gè)節(jié)點(diǎn)后，得到香豆素治療OA靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖1C）。靶點(diǎn)的顏色越深說(shuō)明靶點(diǎn)蛋白與其余靶點(diǎn)蛋白之間的作用聯(lián)系越深。使用Cytoscape內(nèi)置的“Cytohubba”插件篩選得到PPI網(wǎng)絡(luò)中的Hub基因（圖1D）。

2.1.5 GO和KEGG富集分析

將香豆素治療OA的靶點(diǎn)信息上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，挑選Plt;0.05的靶點(diǎn)，將結(jié)果利用sangerbox3.0網(wǎng)站進(jìn)行可視化展示。KEGG富集分析結(jié)果主要涉及鈣信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、NF-κB 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化等（圖2A）。GO分析結(jié)果顯示共篩選到條目463條，其中BP條目共293條，BP分析主要涉及炎癥反應(yīng)、抗原刺激炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)、MAPK級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的自磷酸化、酶結(jié)合、細(xì)胞分化等（圖2B）；篩選到CC條目共77條，CC分析主要向胞漿、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)中的核周區(qū)域以及質(zhì)膜的組分富集（圖2C）；篩選到MF條目共96條，MF分析主要包含MAP激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等（圖2D）。

2.1.6 分子對(duì)接

為評(píng)估香豆素與其關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力，在AutoDock Vina 軟件中進(jìn)行分子對(duì)接。以香豆素作為配體，CCND1、EGFR、ERBB2、MAPK14等4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作為受體進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果顯示，香豆素與4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，這說(shuō)明香豆素與4 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)均能較好地結(jié)合，證明了其是香豆素的靶點(diǎn)。其中香豆素與MAPK14的結(jié)合能最高，其結(jié)合能為-5.9 kcal/mol，利用PyMOL v2.2.0對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示（圖3）。

2.2 香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎的藥理驗(yàn)證

2.2.1 香豆素對(duì)C28/I2軟骨細(xì)胞活性的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度香豆素處理C28/I2細(xì)胞，與Control組相比，5、10、15 μmol/L 香豆素顯著促進(jìn)了C28/I2 細(xì)胞的活性（Plt;0.05），其中10 μmol/L香豆素促進(jìn)C28/I2細(xì)胞活性最為明顯（圖4A）（Plt;0.05）。當(dāng)使用10 μmol/L香豆素分別處理C28/I2細(xì)胞0、24、48、72 h時(shí)，結(jié)果顯示香豆素處理48 h細(xì)胞活性促進(jìn)作用最為明顯（圖4B）（Plt;0.05）。

2.2.2 香豆素對(duì)C28/I2細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平的影響

文獻(xiàn)報(bào)道衰老相關(guān)分泌表型（senescenceassociatedsecretory phenotype，SASP）與軟骨退化及OA有著密切的關(guān)系[14]，IL-6、IL-17、IL-1β、制瘤素M和TNF家族等促炎SASP因子的分泌是SASP的一個(gè)標(biāo)志[15-16]。其中部分SASP因子可誘導(dǎo)OA相關(guān)表型，包括炎癥、骨生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解[14]。而IL-1β處理及p38MAPK途徑的激活均會(huì)導(dǎo)致SASP的產(chǎn)生[17-18]，IL-1β處理細(xì)胞后，軟骨細(xì)胞衰老水平會(huì)顯著上調(diào)。qPCR結(jié)果顯示，與Control組相比，IL-

2.2.3 香豆素對(duì)C28/I2細(xì)胞衰老的影響

β-半乳糖苷酶染色及其量化結(jié)果顯示，與Control組相比，IL-1β處理組的陽(yáng)性染色細(xì)胞顯著增加（Plt;0.05），而香豆素處理可降低由IL-1β引起的β-半乳糖苷酶染色加?。≒lt;0.05）（圖6）。這些結(jié)果表明香豆素可顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老。

2.2.4 香豆素對(duì)C28/I2細(xì)胞中p38/MAPK14途徑及炎性因子類(lèi)SASP因子表達(dá)水平的影響

qPCR 結(jié)果顯示，相較于Control組，IL-1β處理后IL-1β、IL-6、TNF-α等SASP相關(guān)因子及MAPK14的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（Plt;0.05）。加入香豆素處理后，IL-1β、IL-6、TNF-α 等SASP 相關(guān)因子及MAPK14的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（Plt;0.05）（圖7）。免疫熒光及熒光強(qiáng)度量化結(jié)果顯示，相較于Control組，IL-1β處理后SASP因子及P38的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（Plt;0.05），這說(shuō)明IL-1β處理能促進(jìn)細(xì)胞中p38及IL-6的表達(dá)（圖8）。當(dāng)使用香豆素處理后，逆轉(zhuǎn)了IL-1β處理引起的P38、IL-6染色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（Plt;0.05），這些結(jié)果表明香豆素能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的P38、IL-6的表達(dá)。

2.2.5 香豆素對(duì)C28/I2細(xì)胞蛋白酶類(lèi)SASP因子表達(dá)水平的影響

IL-1β處理細(xì)胞后，蛋白酶類(lèi)SASP因子中的MMP家族表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)。qPCR結(jié)果顯示，與Control組相比，IL-1β 處理組的SASP 相關(guān)因子MMP9、MMP13 的mRNA 表達(dá)上升（Plt;0.05），香豆素處理可顯著逆轉(zhuǎn)由IL-1β 上調(diào)的MMP9、MMP13的mRNA表達(dá)（Plt;0.05）（圖9）。免疫熒光結(jié)果與qPCR結(jié)果一致（圖10），表明香豆素可緩解IL-1β誘導(dǎo)的SASP，抑制對(duì)軟骨細(xì)胞ECM具有降解作用的SASP因子MMP9及MMP13的表達(dá)，從而預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎。

3 討 論

OA是一種常見(jiàn)的退行性疾病，影響因素錯(cuò)綜復(fù)雜，包括肥胖、關(guān)節(jié)損傷、遺傳及關(guān)節(jié)組織中的細(xì)胞衰老等[14]。骨關(guān)節(jié)炎的主要特征是關(guān)節(jié)軟骨丟失和軟骨下骨硬化。在組織學(xué)上，該疾病的特征是軟骨表面的早期破碎、軟骨細(xì)胞的增殖、軟骨中出現(xiàn)垂直裂隙、可變晶體沉積、重塑以及血管最終穿越潮線。骨關(guān)節(jié)炎的退行性疾病過(guò)程不僅影響關(guān)節(jié)軟骨，還涉及整個(gè)關(guān)節(jié)，包括軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周?chē)∪狻Ｓ捎诶w維軟骨變性、軟骨骨贅、突出物、滑膜下炎癥細(xì)胞和滑膜細(xì)胞增生，骨重塑和磨損在疾病過(guò)程中發(fā)生得相對(duì)較早。活化的滑膜分泌過(guò)多的滑液，導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊腫脹。

衰老是一種細(xì)胞命運(yùn)，其特征是永久性細(xì)胞周期停滯和促炎分子釋放到周?chē)h(huán)境中，這一特征被稱(chēng)為衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associatedsecretory phenotype，SASP）[19]。衰老相關(guān)分泌表型是與衰老細(xì)胞相關(guān)的表型，SASP細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、生長(zhǎng)因子和蛋白酶表達(dá)增多[20-21]。SASP還可能由含有酶、microRNA、DNA片段、趨化因子和其他生物活性因子的外泌體和胞外體組成[22-23]?？扇苄阅蚣っ咐w溶酶原激活劑表面受體是SASP的一部分，已用于識(shí)別衰老細(xì)胞以進(jìn)行senolytic 治療[24]。最初，SASP 具有免疫抑制性（以TGF-β1和TGF-β3為特征）和促纖維化作用，但逐漸發(fā)展為促炎性（以IL-1β、IL-6和IL-8為特征）和纖維溶解性作用[25-26]。目前已知的軟骨分解代謝的標(biāo)志基因之一的MMP 家族也屬于SASP 因子[27]。SASP是衰老細(xì)胞造成有害影響的主要原因[23]。衰老細(xì)胞隨著生物體老化而積累，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少、組織再生功能受損[28]。由于這些原因，衰老與包括 OA在內(nèi)的多種衰老相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展相關(guān)，但衰老影響OA的病理機(jī)制仍不清楚。

香豆素屬于天然苯丙素類(lèi)化合物，已有研究報(bào)道其具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎作用。炎癥反應(yīng)是SASP中重要的病因及病理表現(xiàn)之一，香豆素的抗炎作用可能成為一種治療骨關(guān)節(jié)炎的新方案。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，探究香豆素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎疾病的治療可行性及作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，香豆素可能通過(guò)調(diào)控MAPK14、EGFR、CCND1、ERBB2 進(jìn)而影響骨關(guān)節(jié)炎疾病，針對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果進(jìn)行GO、KEGG富集分析以及分子對(duì)接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香豆素與MAPK14的結(jié)合能最高，說(shuō)明香豆素最有可能通過(guò)調(diào)控MAPK14途徑來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎疾病。MAPK14全稱(chēng)為絲裂原激活蛋白激酶14，也被稱(chēng)為p38-α。研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK14途徑的激活會(huì)增強(qiáng)NF-κB活性，進(jìn)而導(dǎo)致促炎SASP 的產(chǎn)生，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老[26]。

研究表明，在炎癥過(guò)程中，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactivenitrogen species，RNS）來(lái)對(duì)抗病原體并刺激組織修復(fù)和再生，但這些化學(xué)物質(zhì)也會(huì)損傷DNA，進(jìn)而導(dǎo)致SASP[29-30]。IL-1β被廣泛用于誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎疾病模型中的炎癥反應(yīng)，本研究探究香豆素通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞SASP，進(jìn)而預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的效應(yīng)。qPCR及β-半乳糖苷酶染色顯示香豆素通過(guò)p38/MAPK14途徑抑制軟骨細(xì)胞衰老。qPCR 及免疫熒光結(jié)果顯示，香豆素能夠抑制軟骨細(xì)胞中IL-1β導(dǎo)致的多聚蛋白聚糖的分解。本研究結(jié)果證明香豆素通過(guò)抑制IL-1β導(dǎo)致的P16、P21、IL-1β、p38/MAPK14、IL-6、TNF-α、MMP9、MMP13等各類(lèi)SASP因子的上調(diào)，治療骨關(guān)節(jié)炎。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接手段，對(duì)香豆素治療骨關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并通過(guò)體外試驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，香豆素可能通過(guò)p38/MAPK14途徑調(diào)控軟骨細(xì)胞SASP，進(jìn)一步緩解由于衰老導(dǎo)致的軟骨結(jié)構(gòu)破壞，從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。

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（責(zé)任編輯：周一青）

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