【摘 要】目的：研究流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞珠陣列（cytometric bead array，CBA）法檢測膿毒癥患者人細(xì)胞因子譜表達(dá)水平，探討并比較各細(xì)胞因子在膿毒癥患者早期診斷及預(yù)測死亡風(fēng)險(xiǎn)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：納入256例ICU膿毒癥患者，99例健康體檢者和99例ICU非膿毒癥患者，流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測入組人群入院當(dāng)天血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的水平。Spearman及R語言Mantel檢驗(yàn)分別用于常規(guī)相關(guān)性分析和指標(biāo)集合間的相關(guān)性分析，構(gòu)建受試者工作特征曲線（receiveroperating characteristic，ROC）曲線，評估并比較人細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子對膿毒癥患者早期診斷及預(yù)估死亡風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果：膿毒癥患者血漿人細(xì)胞因子譜中IL-6、IL-10水平明顯高于健康對照及ICU非膿毒癥患者。IL-6的早期膿毒癥診斷ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.868（Plt;0.000 1，95%CI=0.835～0.901），IL-10為0.831（Plt;0.000 1，95%CI=0.793～0.869）。Mantel檢驗(yàn)指標(biāo)集合間的相關(guān)性分析顯示：在膿毒癥患者死亡組中，IL-6與CRP呈顯著相關(guān)性（r=0.101，P=0.001），IL-10與NEUT呈顯著相關(guān)性（r=0.132，P=0.001）。人細(xì)胞因子譜中的各細(xì)胞因子預(yù)測28 d死亡率的AUC均低于0.70。結(jié)論：使用流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測人細(xì)胞因子在膿毒癥早期診斷中表現(xiàn)出不同的效力。IL-6和IL-10能為膿毒癥的早期臨床診斷提供證據(jù)，但在預(yù)估死亡風(fēng)險(xiǎn)方面與其他因子效力相當(dāng)。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞因子譜；膿毒癥預(yù)后；白介素-6；白介素-10；生物標(biāo)志物

【中圖分類號】R473.72 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-07-15

膿毒癥被定義為由宿主對抗感染反應(yīng)失衡引起的危及生命的器官功能障礙，可導(dǎo)致死亡[1-4]。它也是重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的主要原因[5]。膿毒癥已成為全球面臨的嚴(yán)峻衛(wèi)生問題[6]，WHO已將其列為影響全球健康的重要疾病[7]。2017年初步數(shù)據(jù)顯示全球約4 890萬例新發(fā)膿毒癥病例，報(bào)告死亡人數(shù)為110萬[6]。膿毒癥患者死亡率高達(dá)16.67%～33.33%[5，8-9]。2021年國際膿毒癥和膿毒癥休克管理指南再次修訂，以指導(dǎo)成年膿毒癥及膿毒性休克患者的管理，它特別強(qiáng)調(diào)早期診斷的重要性以及適當(dāng)使用抗生素和對器官功能支持治療的必要性[9]。盡早識別和適當(dāng)?shù)闹委煷胧τ诟纳颇摱景Y患者的預(yù)后至關(guān)重要[9-11]。

膿毒癥免疫機(jī)制是機(jī)體在抗感染過程中，過度炎癥與抗炎反應(yīng)在宿主體內(nèi)的平衡發(fā)生紊亂，形成以過度炎癥和免疫抑制為特征的綜合征。檢測炎性及抗炎細(xì)胞因子有助于早期識別膿毒癥，也有助于評估膿毒癥患者的預(yù)后。以往研究主要采用ELISA檢測各種炎性標(biāo)志物，包括抗炎細(xì)胞因子及趨化因子，如IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10，用于膿毒癥的診斷或預(yù)后監(jiān)測[12-18]。然而，ELISA方法繁瑣、耗時(shí)，且不適合膿毒癥患者的急診檢測。相比之下，流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞因子檢測方面展現(xiàn)出顯著的靈敏度，其檢測結(jié)果與ELISA相關(guān)性超過90%[19]。目前，細(xì)胞珠陣列（cytometric bead array，CBA）、Luminex技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光等廣泛用于細(xì)胞因子的多因素分析[19]。流式細(xì)胞術(shù)CBA 法已成為檢測人類細(xì)胞因子特征的有效方法，在各種疾病的臨床和輔助診斷中得到了很好應(yīng)用[20-22]。已有文獻(xiàn)報(bào)告，在感染革蘭陰性細(xì)菌的兒科血液患者中，IL-6、TNF-α和IL-10顯著升高[23]。也有研究表明細(xì)胞因子在識別兒童革蘭陰性細(xì)菌方面的優(yōu)缺點(diǎn)[20]，然而，針對膿毒癥患者細(xì)胞因子譜中各因子對膿毒癥診斷的優(yōu)勢進(jìn)行比較的研究甚少，且利用流式細(xì)胞術(shù)CBA方法檢測細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子預(yù)測膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的效力也尚未被深入研究。本研究旨在檢測膿毒癥患者人細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子的水平，并比較其在膿毒癥診斷及死亡風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究隊(duì)列

1.1.1 研究隊(duì)列和分組

根據(jù)Sepsis-3 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入2019年6月至2022年10月四川省人民醫(yī)院ICU、急診ICU和老年ICU住院成人膿毒癥患者256例，納入同期99例年齡及性別匹配的非膿毒癥ICU患者作為非膿毒癥對照組，并納入99例體檢人群作為健康對照組。99例非膿毒癥患者入住ICU的原因，見圖1。本研究遵循《赫爾辛基宣言》的原則進(jìn)行。所有受試者的研究均獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（NO：2019-309，2021-521），并征得患者的知情同意。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：按照膿毒癥-3診斷標(biāo)準(zhǔn)納入實(shí)驗(yàn)組。SEPSIS-3診斷標(biāo)準(zhǔn)定義為：入院時(shí)懷疑感染且SOFA評分≥2分。膿毒癥休克定義為：在符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，且SOFA評分≥3分，乳酸水平≥2 mmol/L，以及需要使用血管升壓藥物者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡lt;18歲者；自身免疫性疾病、HIV感染、器官移植、惡性腫瘤或2周內(nèi)使用免疫抑制劑者。

1.2 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞因子

研究人群采集外周靜脈全血5 mL，肝素抗凝，低溫3 500 r/min離心20 min分離血漿，細(xì)胞因子檢測采用人TH1/TH2亞群檢測試劑盒（流式熒光法，試劑廠家：江西賽基）于貝克曼庫爾特NAVIOS 血液流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量檢測。操作過程嚴(yán)格依照試劑使用說明進(jìn)行。特別說明的是在測定開始前，準(zhǔn)備陰性對照品和相應(yīng)濃度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)和線性驗(yàn)證。將標(biāo)準(zhǔn)微球混合后重懸（去除上清后與血清增強(qiáng)緩沖液混合），并加入相應(yīng)檢測管，孵育150 min，1 mLPBS清洗后300 μL PBS重懸上機(jī)。對于細(xì)胞因子濃度高的（gt;5 000 pg/mL）樣品，用樣品稀釋液稀釋樣品以獲得所需的稀釋后濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)，即[Md（P25，P75）]表示。使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)分析組間差異，常規(guī)相關(guān)性分析及指標(biāo)集合間的相關(guān)性分析分別應(yīng)用Spearman及R語言中的Mantel檢驗(yàn)進(jìn)行。構(gòu)建受試者工作特征（receiveroperating characteristic，ROC）曲線，確定每個(gè)指標(biāo)的ROC曲線下面積，并計(jì)算最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度（SE）和特異性（SP），評估每個(gè)指標(biāo)在膿毒癥患者中的診斷和預(yù)測死亡的價(jià)值。使用Graph Pad Prism 7.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。指標(biāo)集合之間的相關(guān)性分析通過R語言中的Mantel檢驗(yàn)繪圖，以Plt;0.05為有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床基本特征

本研究共入組454例個(gè)體，其中包括256例成人膿毒癥患者、99例ICU非膿毒癥患者及99例健康體檢者。 研究隊(duì)列基本人口統(tǒng)計(jì)和臨床特征，見表1。

2.2 膿毒癥患者血漿人細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子水平

膿毒癥患者血漿IL-6、IL-10、IL-2、IL-4、TNF-α 和IFN-γ的中位水平分別為119.7（29.76，1402.00） pg/mL、11.2（3.11，55.94） pg/mL、0.520（0.01，1.34） pg/mL、0.245（0.01，1.55） pg/mL、0.355（0.01，1.94） pg/mL和1.0（0.01，3.02） pg/mL。非膿毒癥ICU組的中位水平分別為21.91（6.15，66.99） pg/mL、2.90（0.70，8.38） pg/mL、0.14（0.01，1.23） pg/mL、0.10（0.01，1.16） pg/mL、0.10（0.01，1.34） pg/mL和0.80（0.04，2.51） pg/mL。正常對照組中IL-6 和IL-10 的中位水平均為0.10 pg/mL、0.09 pg/mL。膿毒癥患者的IL-6和IL-10水平明顯高于健康對照組和非膿毒癥ICU患者。膿毒癥患者的TNF-α、IFN-γ、IL-2 和IL-4 水平明顯高于健康對照組（Plt;0.05），但與ICU非膿毒癥患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.3 人細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子對膿毒癥患者早期診斷的應(yīng)用價(jià)值

執(zhí)行ROC曲線以探索膿毒癥患者人細(xì)胞因子譜中各參數(shù)的早期診斷價(jià)值，IL-2 的ROC 曲線下面積（area undercurve，AUC）為0.643 [Plt;0.000 1，95%置信區(qū)間（CI）：0.593～0.694]，IL-4為0.629（Plt;0.000 1，95%CI=0.578～0.680），IL-6為0.868（Plt;0.000 1，95%CI=0.835～0.901），IL-10為0.831（Plt;0.000 1，95%CI=0.793～0.869），TNF-α 為0.655（Plt;0.000 1，95%=CI=0.605～0.705），IFN-γ 為0.641（Plt;0.000 1，95%CI=0.591～0.692）（圖3）。在6種細(xì)胞因子中，僅IL-6和IL-10的AUC 值超過0.8。IL-6 和IL-10 的靈敏度和特異性分別為91.02%和87.5%，以及67.68%和66.67%，見表2。

2.4 膿毒癥患者血漿細(xì)胞因子譜中IL-6和IL-10的相關(guān)性分析

為了了解膿毒癥患者人細(xì)胞因子譜中IL-6與IL-10的相關(guān)性，對其進(jìn)行了Spearman 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示膿毒癥患者的IL-6與IL-10呈正相關(guān)（rs=0.636 4，Plt;0.000 1），見圖4。

2.5 膿毒癥患者細(xì)胞因子譜中各因子與部分炎性指標(biāo)的相關(guān)性分析

Mantel檢驗(yàn)顯示膿毒癥患者細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子與部分炎性指標(biāo)之間的相關(guān)性（圖5，表3）。256例膿毒癥患者中，入院28 d 146例存活，110例死亡，膿毒癥患者28 d死亡率為42.97%（110/256）。在膿毒癥患者生存組中，IL-6與其他因素（IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ）以及常規(guī)檢測指標(biāo)（WBC、NEUT、CRP 和PCT）之間未觀察到顯著相關(guān)性。然而，僅IL-10與PCT呈相關(guān)性（rs=0.087，P=0.024）。在膿毒癥患者死亡組中，IL-6與CRP（rs=0.101，P=0.001）呈顯著相關(guān)；IL-10與NEUT%（rs =0.132，P=0.001）顯著相關(guān)，并與PCT（rs=0.087，P=0.024）呈相關(guān)，而其他指標(biāo)（IL-2、IL-4、TNF-α 和IFN-γ）與NEUT%的有相關(guān)性（rs=0.092，P=0.025），且與WBC、CRP和PCT僅微弱相關(guān)性。相比其他因子膿毒癥患者血漿人細(xì)胞因子譜中IL-6和IL-10與常規(guī)炎性因子顯示出更高的相關(guān)性。

2.6 膿毒癥患者人細(xì)胞因子譜中各參數(shù)預(yù)測28 d死亡風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值

構(gòu)建ROC曲線以探索人細(xì)胞因子譜中各因子對膿毒癥患者28 d 死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測價(jià)值。IL-2 的ROC 曲線下面積（AUC）為0.611（P=0.002 5，95%CI=0.540～0.681），IL-4 為0.612（P=0.002 2，95%CI=0.542～0.682），IL-6 為0.636（P=0.000 2，95%CI=0.567～0.704），IL-10 為0.632（P=0.001，95%CI=0.562～0.701），TNF-α 為0.608（P=0.003，95%CI=0.538～0.679），IFN- γ 為0.595（P=0.009 2，95%CI=0.525～0.665）（圖6）。IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-2 和IL-4 在預(yù)測膿毒癥患者28 d 死亡率的AUC均低于0.7（表4）。

3 討論

膿毒癥的免疫機(jī)制可被看作是炎癥與抗炎反應(yīng)在宿主體內(nèi)的平衡。維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)依賴于固有免疫和適應(yīng)性免疫，主要由對某些刺激反應(yīng)的細(xì)胞因子級聯(lián)釋放所調(diào)節(jié)[24]。流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測人細(xì)胞因子譜中各細(xì)胞因子預(yù)測膿毒癥患者結(jié)局的文獻(xiàn)相對甚少。本研究明確了細(xì)胞因子譜中IL-6、IL-10、IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ對膿毒癥患者診斷價(jià)值各不相同，其中僅IL-6和IL-10的AUC值超過0.8，顯示出顯著的診斷能力。TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-4的診斷有效性相對較低，然而，所有細(xì)胞因子，包括IL-6和IL-10在內(nèi)對膿毒癥患者28 d死亡風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測能力均不足，AUC均低于0.70。

前期多項(xiàng)研究探討了細(xì)胞因子對膿毒癥的診斷作用[20-21，25]，其中IL-6和IL-10被廣泛認(rèn)為是關(guān)鍵標(biāo)志物。關(guān)于這2種細(xì)胞因子對膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)估能力結(jié)果并不一致。隨著流式細(xì)胞術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用，CBA技術(shù)已成為了一種快速且定量分析多種細(xì)胞因子的有效方法，結(jié)果約3 h內(nèi)得到，且所需樣本量小，適合于膿毒癥患者的急診檢測。本研究顯示，膿毒癥患者細(xì)胞因子譜中IL-6濃度顯著升高，這與炎癥、器官損傷以及免疫反應(yīng)相關(guān)。IL-6作為免疫機(jī)制的促進(jìn)因子，主要由巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放，其通過3種不同信號通路，即經(jīng)典信號、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和呈遞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與免疫防御[26-27]。進(jìn)一步的結(jié)果表明，IL-6的ROC曲線下面積最高，提示其在早期膿毒癥診斷中的應(yīng)用價(jià)值。這些結(jié)果與以往ELISA檢測方法得到的結(jié)果相似[17，25]。有學(xué)者提出通過CBA技術(shù)檢測IL-6是診斷膿毒癥較經(jīng)濟(jì)的檢測方法[28]。此外IL-2、TNF-α、IFN-γ是固有免疫及適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)因子[29-31]。以往研究表明，干擾素γ在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥休克中促進(jìn)炎性反應(yīng)，但中和干擾素γ并未改善生存率 [31]。本研究表明IL-2、TNF-α和IFN-γ在膿毒癥患者中的水平高于健康者，但在鑒別膿毒癥與ICU非膿毒癥患者方面能力有限。本研究顯示人細(xì)胞因子譜中IL-10水平明顯高于健康者和ICU非膿毒癥患者，其在膿毒癥診斷中的ROC 曲線位于第二，僅次于IL-6。IL-10作為關(guān)鍵的抗炎細(xì)胞因子，在保護(hù)宿主免受病原體和微生物的過度反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。過量釋放的IL-10與膿毒癥細(xì)菌感染相關(guān)的免疫抑制和患者死亡相關(guān)[33]。細(xì)胞因子譜中的抗炎因子還包括IL-4[34]。IL-4通過抑制NFκB活性，下調(diào)單核細(xì)胞分泌炎性因子如TNF-α和IFN-γ[15]，減輕細(xì)胞和體液免疫中的炎性反應(yīng)[35]。本研究中IL-4雖在膿毒癥患者入院時(shí)濃度高于健康個(gè)體，但在鑒別膿毒癥與ICU非膿毒癥患者方面能力也有限。

相關(guān)性分析顯示，膿毒癥患者IL-6與部分炎性因子（如WBC、NEUT、CRP和PCT）相關(guān)性較弱，而在非存活組中，IL-6與CRP顯著相關(guān)，IL-6和IL-10在人類細(xì)胞因子特征中比其他因素（IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ）顯示出更強(qiáng)的相關(guān)性。提示死亡膿毒癥患者的炎性反應(yīng)更為嚴(yán)重。本研究證實(shí)了IL-6和IL-10在膿毒癥早期診斷中的重要性。為了進(jìn)一步探討這2種細(xì)胞因子在預(yù)測膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)中的潛在作用，本課題組構(gòu)建了ROC曲線，以評估人類細(xì)胞因子在該患者群體中對28 d 死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測能力。值得注意的是，包括IL-6和IL-10在內(nèi)的細(xì)胞因子譜中所有因子的AUC 值均低于0.70。這表明，IL-6和IL-10在預(yù)估膿毒癥患者28 d死亡風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，其預(yù)測能力與其他因素相當(dāng)。這些結(jié)果與使用Luminex檢測方法獲得的早期研究結(jié)果相一致[33]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞因子在預(yù)測膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)方面的局限性。因此，在臨床實(shí)踐中使用IL-6和IL-10作為預(yù)后指標(biāo)時(shí)，應(yīng)保持謹(jǐn)慎，以避免對患者治療產(chǎn)生不準(zhǔn)確的預(yù)測影響。

然而本研究仍然存在局限性，首先，僅納入了6種細(xì)胞因子的進(jìn)行檢測且未對膿毒癥患者的進(jìn)行動態(tài)分析；其次，膿毒癥患者的結(jié)局受多種因素影響。本課題組選擇的研究時(shí)間點(diǎn)是膿毒癥患者入院當(dāng)天，即膿毒癥的早期階段，患者的生存結(jié)局可能會隨疾病進(jìn)展和藥物使用而變化。在未來的研究中仍需考慮更多的影響因素。

4 結(jié)論

本研究表明，流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測膿毒癥患者人細(xì)胞因子顯示出不同的診斷效能。特別是IL-6和IL-10在早期診斷中具有重要價(jià)值。然而，它們在死亡風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測方面的能力相對有限，僅為膿毒癥患者的診斷和治療策略提供參考。

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（責(zé)任編輯：周一青）

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)資助項(xiàng)目（編號：2022YFS0238）。