【摘 要】目的：比較用于供精人工受精（artificial insemination with donor semen，AID）技術(shù)的人類精子庫冷凍精液標(biāo)本高生育力組、中生育力組與低生育力組精液常規(guī)參數(shù)、精子形態(tài)、精子線粒體膜電位水平，精子DNA碎片率。探討上述指標(biāo)與供精妊娠結(jié)局的相關(guān)性，從而篩選出評估人類精子庫捐精志愿者生育力的有效指標(biāo)。方法：收集外供生殖中心用于AID同批次冷凍精液標(biāo)本共140例，分別是“低生育力組”44例、“中生育力組”48例以及“高生育力組”48例。使用流式細(xì)胞儀檢測精子線粒體膜電位水平（mitochondrial membrane potential，MMP）以及精子DNA碎片率（DNA fragmentation，DFI）。比較各組間精液常規(guī)參數(shù)、正常精子形態(tài)率、精子MMP以及精子DFI。結(jié)果：年齡（P=0.476），禁欲天數(shù)（P=0.320）、體質(zhì)指數(shù)（P=0.475）、精子濃度（P=0.751）、前向運(yùn)動精子百分率（P=0.230）、正常精子形態(tài)率（P=0.444）在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，精子MMP（P=0.000）、精子DFI（P=0.004）在各組間存在顯著性差異。AID臨床妊娠率與精子DFI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.308，P=0.000）。結(jié)論：精子MMP、精子DFI是精子功能評價的重要指標(biāo)。精子MMP是否能成為完全獨立的精子質(zhì)量指標(biāo)尚有待進(jìn)一步的研究。精子MMP聯(lián)合精子DFI能否預(yù)測AID妊娠結(jié)局，還需進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】供精人工受精；精子；線粒體膜電位；精子DNA碎片率

【中圖分類號】R69 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-03-22

實施供精人工授精（artificial insemination withdonor semen，AID）是不育夫婦實現(xiàn)生育愿望的有效途徑之一[1]。因此，如何篩選健康、優(yōu)良的冷凍精液標(biāo)本成為提高AID成功率的關(guān)鍵。

現(xiàn)有評估外供精液標(biāo)本質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)仍依賴于傳統(tǒng)的精子濃度及活力等常規(guī)分析指標(biāo)[2-3]。在長期供精實踐中發(fā)現(xiàn)，部分冷凍精液標(biāo)本雖然符合甚至高于原衛(wèi)生部176號文件中關(guān)于人類精子庫冷凍精液標(biāo)本的外供標(biāo)準(zhǔn)（濃度gt;12×106/mL，前向運(yùn)動精子百分率gt;40%），但AID臨床妊娠率仍不高，并且不同的捐精志愿者冷凍精液標(biāo)本受孕能力也各不相同。部分捐精志愿者冷凍精液標(biāo)本的周期妊娠率很高，超過50%，最高可達(dá)100%（即5個AID周期有5例婦女受孕）；而有些捐精志愿者冷凍精液標(biāo)本的周期妊娠率卻很低，更有甚者使用10個AID周期后，出現(xiàn)未使1例婦女受孕的情況。這一現(xiàn)象說明臨床上普遍采用的精液常規(guī)分析指標(biāo)實則并不能準(zhǔn)確地反映精子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能，無法全方位呈現(xiàn)精子狀態(tài)，故而無法全面評估男性生育能力[4]。

有研究證實精子線粒體作為精子活動能量的來源場所，與精子發(fā)生、發(fā)展、凋亡、受精過程密切相關(guān)[5]。目前研究證實精子受精過程所需的能量主要來自精子線粒體合成的腺苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP），且精子線粒體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）與精子發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]，精子線粒體的功能對精子質(zhì)量及男性生育力存在至關(guān)重要的影響。而精子線粒體膜電位是評價線粒體功能的重要指標(biāo)之一[8-9]。

國內(nèi)關(guān)于精子MMP 與輔助生殖技術(shù)（assistedreproductive technology，ART）妊娠結(jié)局的相關(guān)研究較少[10-11]，尤其是針對人類精子庫捐精志愿者冷凍精液標(biāo)本開展精子MMP方面的研究尚屬空缺。本研究通過回顧性分析，比較了不同生育力組別之間精液常規(guī)參數(shù)、精子MMP以及精子DNA碎片率的差異性，進(jìn)一步分析了精子MMP與AID臨床妊娠率的相關(guān)性，探討了精子MMP對于AID妊娠結(jié)局的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集符合條件的精液樣本140例，分別是“低生育力組”44例、“中生育力組”48例和“高生育力組”48例?；仡櫺苑治隽酥貞c市人類精子庫2015年4月至2023年12月期間AID妊娠結(jié)局。統(tǒng)計AID外供周期以及妊娠結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)分布情況，據(jù)此制訂高生育力組、中生育力組及低生育力組的入組標(biāo)準(zhǔn)。排除女方影響因素及各種混雜因素后，將周期妊娠率≤10%精液判定為“低生育力組”（外供周期≥10，使0～1例婦女受孕），將精液周期妊娠率≥50%判定為“高生育力組”（外供周期≤10，至少使5例及其以上婦女受孕），將10%lt;周期妊娠率lt;50%判定為“中生育力組”。

女方入組條件：年齡≤35歲，以男性不育或男方和/或家族有不宜生育的嚴(yán)重遺傳性疾病實施AID。

女方排除條件：內(nèi)分泌因素、子宮內(nèi)膜因素、宮腔因素等導(dǎo)致的女方不孕。

所有提供本研究精液樣本的捐精志愿者均簽署了知情同意書，并經(jīng)重慶市人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意后實施（[ 2021）倫審第（011）號]。

所有研究對象均需禁欲2～7 d后，通過手淫法獲取精液。

1.2 方法

1.2.1 精液標(biāo)本冷凍

使用人工冷凍法進(jìn)行精液冷凍，在廣口保溫瓶中裝入液氮備用，將分裝好的凍存管依次放在冷凍盤上，冷凍盤固定于距液氮液面上方1 cm處（不能與液面接觸），蓋上保溫蓋，開始計時。30 min后將凍存管放入液氮中，至少5 min后方能復(fù)蘇。

1.2.2 冷凍精液標(biāo)本復(fù)蘇

將凍存于液氮的精液冷凍管取出室溫平衡1 min后，放置于37 ℃水浴箱5 min進(jìn)行解凍。

1.2.3 精子冷凍前后相關(guān)參數(shù)、指標(biāo)檢測

參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗手冊》第五版的標(biāo)準(zhǔn)、方法，對精子濃度、活力、形態(tài)進(jìn)行檢測。精子形態(tài)采用改良巴氏染色法（巴氏染色液，成都樸華科技）對樣本進(jìn)行涂片、染色。符合原衛(wèi)生部176號文件外供標(biāo)準(zhǔn)要求者，方可外供實施AID。

1.2.4 精子MMP、精子DFI檢測

精子線粒體膜電位染色試劑盒（JC-1染色法）、精子DNA碎片染色試劑盒均購自青島復(fù)諾醫(yī)療科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。熒光信號采用流式細(xì)胞儀（廈泰DxPAthenaTM）進(jìn)行檢測。使用Flowjo10.9.0流式細(xì)胞分析軟件對精子MMP、DFI檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2 組間均數(shù)比較采用t 檢驗，方差齊者多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，方差不齊采用秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同生育力組間精液參數(shù)、精子MMP、精子DFI比較

捐精志愿者年齡（F=0.746，P=0.476）、禁欲天數(shù)（F=1.150，P=0.320）、體質(zhì)量指數(shù)（F=0.749，P=0.475）在各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，精子濃度（F=0.288，P=0.751）、前向運(yùn)動精子百分率 （F=1.486，P=0.230）、正常形態(tài)精子百分率（F=0.818，P=0.440）在各組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異，精子MMP（F=24.642，P=0.000）、DFI（F=5.885，P=0.004）在各組間存在顯著性差異。其中，精子MMP水平在低生育力組顯著低于中生育力組（P=0.000），但與高生育力組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.335），精子MMP水平在中生育力組卻顯著高于高生育力組（P=0.000）。精子DFI在低生育力組檢測值顯著高于中育力組（P=0.006）、高生育力組（P=0.002），見表1。

2.2 未妊娠組與妊娠組之間精液參數(shù)、精子MMP、精子DFI比較

將研究對象按照是否使受者妊娠進(jìn)行分組，捐精志愿者年齡（t=0.788，P=0.432）、禁欲天數(shù)（t=-1.215，P=0.227），BMI（t=0.960，P=0.339）、精子濃度（t=0.034，P=0.973）、前向運(yùn)動精子百分率（t=1.544，P=0.125）、正常形態(tài)精子百分率（t=-0.639，P=0.524）在兩組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異，精子MMP（t=-3.913，P=0.000）、DFI（t=3.655，P=0.000）在各組間存在顯著性差異，且精子MMP 水平在未妊娠組顯著低于妊娠組（t=-3.913，P=0.000），精子DFI在未妊娠組顯著高于妊娠組（t=3.655，P=0.000），見表2。

2.3 AID臨床妊娠率與精子MMP、精子DFI、精液參數(shù)相關(guān)性分析

AID 臨床妊娠率與精子濃度（rs=0.030，P=0.732）、前向運(yùn)動精子百分率（rs=-0.122，P=0.150）、正常精子形態(tài)率（rs=-0.080，P=0.346）、精子MMP（rs=-0.033，P=0.696）均無相關(guān)性，但與精子DFI呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.308，P=0.000），見表3。

3 討 論

精子MMP是指在正常精子線粒體中發(fā)生的三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的能量傳遞給電子，電子經(jīng)呼吸鏈的傳遞產(chǎn)生ATP，與此同時將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)泵至內(nèi)膜外，形成的跨膜電位差[12]。精子MMP是評價精子線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)，進(jìn)而反映精子功能[13]。在人類精子細(xì)胞中MMP的檢測，具有廣泛的應(yīng)用價值，很有潛力成為評價精子受精能力的常規(guī)分析和診斷指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，AID外供后反饋的隨訪數(shù)據(jù)中，顯示不同生育力組別之間，衡量精液質(zhì)量的傳統(tǒng)參數(shù)指標(biāo)（精子濃度、前向運(yùn)動精子百分率、正常形態(tài)精子百分率）均無統(tǒng)計學(xué)差異，但精子MMP、DFI兩項檢測指標(biāo)均存在顯著性差異，精子MMP水平在低生育力組顯著低于中生育力組，但與高生育力組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，精子MMP水平在中生育力組卻顯著高于高生育力組。提示精子MMP、DFI水平與成年育齡男性精液質(zhì)量密切相關(guān)，從而影響AID臨床妊娠率。精子DFI值隨著AID臨床妊娠率的升高而呈現(xiàn)下降趨勢。精子MMP結(jié)果較復(fù)雜，在各組別之間未發(fā)現(xiàn)明顯升高或下降趨勢，推測精子MMP一定范圍內(nèi)的異常通常容易被卵子所修復(fù)，卵子不同的修復(fù)能力導(dǎo)致了不同的臨床妊娠率。但不可否認(rèn)，精子MMP 在低生育力組水平仍低于中、高生育力組。這與白雙勇等[13]研究發(fā)現(xiàn)正常不育組精子MMP 低于正常已生育組的結(jié)果一致。精子MMP下降可能與活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量過多存在密切關(guān)聯(lián)，精液內(nèi)ROS含量過多易損傷非致密性的mtDNA，通過線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，亦可破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)、破壞線粒體呼吸功能，降低精子MMP 水平。Wang X 等[14]研究指出精子內(nèi)ROS含量是導(dǎo)致精子細(xì)胞凋亡率的升高的主要原因。一旦精子細(xì)胞凋亡率升高，精子DNA完整性遭到破壞，精子DNA碎片率也相應(yīng)升高，進(jìn)而影響男性生育能力[9]。故本研究中精子DFI在低生育力組檢測值明顯高于中、高生育力組?？梢?，ROS含量過多是導(dǎo)致精子MMP下降、DFI升高的重要因素之一，但具體發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將140例研究對象按照是否妊娠進(jìn)行分組后，結(jié)果顯示在精子濃度、前向運(yùn)動精子百分率、正常精子形態(tài)率無統(tǒng)計學(xué)差異的情況下，精子MMP、精子DFI在2組間卻存在統(tǒng)計學(xué)差異，且精子MMP在未妊娠組檢測值顯著低于妊娠組，精子DFI在未妊娠組檢測值顯著高于妊娠組。精子MMP越高，精子DFI越低，AID臨床妊娠率越高；反之，精子MMP越低，精子DFI越高，AID臨床妊娠率越低。本結(jié)果與Marchetti C 等[15]發(fā)現(xiàn)精子MMP越高，精子DNA碎片化越低，IVF受精率越高一致。由此可見，在精液常規(guī)參數(shù)均符合外供標(biāo)準(zhǔn)的情況下，通過精子MMP和精子DFI 2兩項指標(biāo)，反映出精子受精能力方面的差別，最終導(dǎo)致AID臨床妊娠率的高低。

本研究還發(fā)現(xiàn)研究對象實施AID 后的臨床妊娠率與精子濃度、前向運(yùn)動精子百分率、正常精子形態(tài)率、精子MMP均無相關(guān)性，但與精子DFI呈顯著負(fù)相關(guān)。這個結(jié)果與Kasai T、Meseguer M等[16-17]發(fā)現(xiàn)精子MMP 與精子受精率呈正相關(guān)不相符。DFI呈負(fù)相關(guān)與國內(nèi)大多數(shù)學(xué)者的觀點一致[18]。究其原因，一方面本研究納入對象是精液常規(guī)參數(shù)指標(biāo)正常的捐精志愿者，有別于臨床不育人群。另一方面，女性卵子細(xì)胞質(zhì)遠(yuǎn)多于精子，在受精過程中，精子MMP 異?？赡軙宦炎铀迯?fù)，而且精子DNA損傷比線粒體功能受損更為嚴(yán)重，故檢測后數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析顯示AID臨床妊娠率與精子MMP無相關(guān)性，但與精子DNA卻表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。精子線粒體具有不同于其他體細(xì)胞線粒體的獨特特征，影響著精子的活力、獲能、頂體反應(yīng)和最終受精能力。MMP是反映精子線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)。MMP水平的變化、mtDNA突變或缺失均可引起精子能量合成障礙，導(dǎo)致男性不育。國外學(xué)者建議將精子MMP作為評估男性不育的常規(guī)指標(biāo)[19]。MMP是否能成為完全獨立的精子質(zhì)量指標(biāo)尚有待進(jìn)一步的研究。但有學(xué)者認(rèn)為，精子MMP可作為DFI值正?；蚺R界患者的輔助檢測指標(biāo)，尤為重要的是，精子MMP和精子DNA碎片指數(shù)聯(lián)合，預(yù)測女性配偶自然受孕的能力優(yōu)于精液常規(guī)參數(shù)，是臨床評估特發(fā)性男性不育的重要指標(biāo)[20]。

AID是輔助生殖技術(shù)常用助孕方式之一，目前的臨床妊娠率也僅20%左右。通過傳統(tǒng)的精液常規(guī)參數(shù)分析來評價捐精志愿者的精液質(zhì)量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，無法對供精妊娠結(jié)局進(jìn)行精準(zhǔn)的把握和預(yù)測，精子內(nèi)在的功能缺陷也會對男性生育力產(chǎn)生不良影響。精子MMP直接反映了精子線粒體功能的完整性和能量狀態(tài)，精子DFI則反映了精子細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的完整性。本研究通過精子MMP、精子DFI與AID臨床妊娠率相關(guān)性的探究，進(jìn)一步證實了精子DFI與供精妊娠結(jié)局的相關(guān)性，但精子MMP與供精妊娠結(jié)局的相關(guān)性尚不明確。男性精液發(fā)生發(fā)展過程較多環(huán)節(jié)目前仍不清楚，精子線粒體的生成過程和精子MMP對男性精子成熟、獲能以及受精過程中扮演的角色尚需要進(jìn)一步探討，精子MMP與妊娠結(jié)局的相關(guān)性尚存在爭議，且其在正常妊娠過程中的機(jī)制及意義尚不明確。故精子MMP與輔助生殖技術(shù)應(yīng)用結(jié)局的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：周一青）

基金項目：重慶市科衛(wèi)聯(lián)合醫(yī)學(xué)科研資助項目（編號：2022MSXM063）。