摘要 電化學生物傳感器在小分子物質、蛋白質、酶、核酸、外泌體、循環(huán)腫瘤細胞、細菌和病毒等生物靶標的檢測研究領域中備受關注。為實現(xiàn)生物靶標的高靈敏、高選擇性電化學檢測，需采用多種特異性生物識別元件和高效信號放大策略。本文歸納總結了電化學生物傳感中典型的生物識別元件與信號放大策略。依據(jù)生物識別元件與靶標的作用方式，分別介紹了酶-底物型和受體-配體型電化學生物傳感器，著重介紹了核酸類靶標與非核酸類靶標電化學檢測中的生物識別元件；圍繞生物靶標的高靈敏檢測，重點介紹了基于等溫核酸擴增、催化反應、功能納米載體以及聚合物材料的信號放大策略在電化學生物傳感中的應用，討論了電化學生物傳感器實際應用面臨的諸多挑戰(zhàn)，并展望了該領域的發(fā)展趨勢。

關鍵詞 電化學生物傳感器；生物識別元件；信號放大；評述

電化學生物傳感器是一類將發(fā)生在電極上的分子識別事件（如親和識別和酶促催化）轉變?yōu)殡娦盘枺ㄈ珉娏?、電位和阻抗）進而實現(xiàn)對生物靶標定量分析的器件，具有測量范圍寬、易于集成和微小型化、靈敏度和選擇性高、儀器設備簡單且便攜、響應時間短等優(yōu)勢，在醫(yī)學診斷、健康護理和環(huán)境監(jiān)測等方面展示出良好的應用前景[1-4]。電化學生物傳感器主要由電極及其表面固定化的生物識別元件（BRE）構成。對于電化學生物傳感器，選擇性和靈敏度是評價其性能的兩個關鍵指標。圍繞生物靶標的高選擇性檢測，常用的BRE 有核酸（含核酸適體）、抗體及其片段（如納米抗體）、酶和多肽（含底物肽和親和肽）等[5-8]；為實現(xiàn)生物靶標的高靈敏電化學檢測，研究人員利用等溫核酸擴增、催化反應（含酶促催化和非酶促催化）、功能納米載體（如富碳納米材料和無機納米粒子）以及聚合物材料（天然和人工合成）對檢測信號進行放大[9-12]。本文對近年來電化學生物傳感中的BRE 與信號放大策略的研究進展進行了系統(tǒng)的歸納與總結，以期為電化學生物器的發(fā)展提供參考。

1 生物識別元件

BRE 與靶標間的相互作用可分為酶-底物型和受體-配體型這兩大類。酶-底物型利用酶對底物的特異性識別對酶活性或底物進行檢測，如以葡萄糖氧化酶（GOx）和過氧化氫酶（CAT）修飾的酶電極分別對葡萄糖和H2O2 濃度進行檢測，或以底物肽作為BRE 對激酶、蛋白酶和磷酸酶活性進行檢測。受體-配體型利用BRE 與靶標之間的親和識別作用（即捕獲）對靶標進行檢測，包括核酸分子雜交、轉錄因子與DNA 結合、抗原-抗體免疫識別、核酸適體或親和肽對靶標的識別等。受體-配體型識別方式通常用于對靶標濃度進行定量分析，而酶-底物型識別更適用于酶活性檢測。酶（如凝血酶）的活性水平較其濃度更具有臨床意義，在酶分子與抑制劑結合或輔因子濃度過低等情況下，即使酶的總量未發(fā)生改變，其催化活性也會發(fā)生顯著變化[13-14]。因此，在酶類生物靶標的檢測中應優(yōu)先選用酶-底物型識別模式。

1.1 酶-底物型

酶對底物識別的特異性可分為4 類：絕對特異性、基團特異性、鍵特異性和立體化學特異性。絕對特異性可被視為酶對某一特定底物的排他性作用，如乳糖酶只能催化乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖激酶只能催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸?；鶊F特異性是指酶能催化含有某一特定官能團（如羥基、磷酸基團和甲基等）的分子發(fā)生反應，如胃蛋白酶可水解切割疏水性氨基酸殘基之間的肽鍵并識別苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）等芳香族側鏈，己糖激酶（HK）可催化葡萄糖和甘露糖等己糖的磷酸化反應，堿性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）能催化眾多含磷酸基團的底物發(fā)生脫磷酸化反應。鍵特異性是指酶能識別特定的化學鍵類型（如肽鍵）。立體化學特異性是指酶僅對底物的某種特定光學活性敏感，如β-糖苷酶僅能水解纖維素中的β-糖苷鍵，而不能水解α-糖苷鍵。利用酶對底物的特異性識別，既可將酶作為BRE 對其底物進行高選擇性檢測，也可將特定底物作為BRE 對酶活性進行高選擇性檢測。而且，得益于酶對其底物的高效催化活性，酶-底物型電化學生物傳感器通常具有很高的檢測靈敏度。

Updike 等[15]將GOx 修飾到電極表面，催化葡萄糖與O2 反應產生葡萄糖酸與H2O2，通過測定生成的H2O2，實現(xiàn)了對葡萄糖的高選擇性電化學檢測。Kumar 等[16]利用乳酸脫氫酶（LDH）修飾的絲網(wǎng)印刷電極（SPE）對汗液中的乳酸鹽進行電化學檢測，檢出限（LOD）為0.1 mmol/L。Chen 等[17]利用乙酰膽堿酯酶（AChE）修飾的酶電極，借助于電化學阻抗譜（EIS）對乙酰膽堿進行高靈敏、高選擇性檢測。Roberts等[18]以近端含有4 個陰離子谷氨酸（Glu）殘基且遠端含有4 個陽離子賴氨酸（Lys）殘基的底物肽作為固定化BRE，以六胺合釕（[Ru（NH3）6]3+）作為電活性探針，通過比較多肽酶促切割前后的電流信號大小，實現(xiàn)對前列腺特異性抗原（PSA）的高靈敏、高選擇性檢測， LOD 為1.0 pmol/L。Liu 等[19]以末端修飾有電活性二茂鐵（Fc）探針的多肽作為BRE，對基質金屬蛋白酶7（MMP7）活性進行電化學檢測， LOD 低至3.4 pmol/L。Wang 等[20]以底物肽為固定化BRE，其特定位點的絲氨酸（Ser）殘基被磷酸化后會促進[Ru（NH3）6]3+與電極表面的電荷轉移，實現(xiàn)了對蛋白激酶a（PKA）活性的高靈敏、高選擇性檢測， LOD為0.1 mU/mL。Song 等[21]以底物肽為固定化BRE，以γ位含有Fc 探針的ATP（Fc-ATP）為共底物，在蛋白激酶c（PKC）催化底物肽磷酸化的過程中，共底物上的Fc 探針會轉移到底物肽上，實現(xiàn)對PKC 活性的電化學檢測。

1.2 受體-配體型

受體-配體型電化學生物傳感器主要是利用固定化BRE（即受體）對靶標（即配體）進行特異性識別與捕獲，如基于核酸分子雜交反應的電化學DNA/RNA 生物傳感器、基于抗原-抗體識別的電化學免疫傳感器以及基于核酸適體/親和肽的電化學生物傳感器等。受體與配體之間的親和識別主要依賴于氫鍵、靜電作用、疏水效應和范德華力等分子間非共價相互作用（即超分子作用力），具有很好的可逆性；但其結合強度易受溫度和離子強度等因素影響。核酸類靶標可通過核酸分子雜交反應特異性識別與捕獲，而非核酸類靶標（如小分子物質、蛋白質、外泌體、循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）、細菌和病毒）主要通過抗體、核酸適體以及親和肽捕獲。根據(jù)生物靶標的類型，本文將從核酸類靶標與非核酸類靶標檢測的角度分別介紹電化學生物傳感中的BRE。

1.2.1 核酸類靶標的電化學檢測

核酸是由許多核苷酸單體彼此通過3′，5′-磷酸二酯鍵共價連接而成的電負性生物大分子。DNA 是主要的遺傳物質， RNA 是埃博拉病毒等RNA 病毒的遺傳物質。由于遺傳物質具有種屬/個體特異性，并且基因突變可能影響蛋白質和酶的結構與功能進而引發(fā)疾病，因此，可通過核酸分析對疾病進行篩查甚至早期診斷以及病原微生物鑒定。此外，基于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、微小RNA（microRNA）等游離核酸的液體活檢，在疾病的篩查與診斷等方面也備受關注[22-23]。針對核酸類靶標的高選擇性檢測，主要基于Watson-Crick 堿基互補配對原則，將與靶序列互補配對的核酸片段作為BRE[24]。例如， Pareek 等[25]以互補單鏈DNA（ssDNA）片段作為固定化BRE，以亞甲基藍（MB）作為電活性探針，對人乳頭瘤病毒16（HPV-16）DNA 進行高選擇性檢測。為進一步提高選擇性乃至實現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分析，研究人員相繼開發(fā)出發(fā)卡DNA[26]、肽核酸（PNA）[27]、鎖核酸（LNA）[28]和磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO）[29]等核酸類似物，作為核酸檢測的BRE。

發(fā)卡DNA 是根據(jù)分子信標原理設計的一種單鏈核酸探針，其兩端的堿基序列互補配對，常溫下呈莖環(huán)結構，具有選擇性好、結構簡單和可重復使用等特點[30]。如圖1 所示，將發(fā)卡DNA 作為BRE 對核酸進行電化學檢測時，通常在其一端修飾巰基等官能團（用于電極表面固定化），另一端（遠端）修飾電活性探針（如Fc 和MB）[3]。Fan 等[31]將遠端修飾有Fc 探針的發(fā)卡DNA 作為BRE，借助于靶標與發(fā)卡DNA雜交將發(fā)卡環(huán)打開，導致源自Fc 探針的氧化電流下降，據(jù)此實現(xiàn)對DNA 的高選擇性電化學檢測（LOD 為10 pmol/L）。隨著靶標濃度增大，此類電化學DNA 生物傳感器的響應電流信號相應降低。該類方法屬于“信號減弱”型方法，易產生假陽性結果。為克服上述缺陷， Hu 等[32]將末端修飾有疊氮基團（—N3）的發(fā)卡DNA 固定在電極表面，與靶標雜交后，借助于點擊化學反應將含有炔基（—C≡C）的Fc 探針連接到電極表面，實現(xiàn)了對DNA 的“信號增強”型檢測， LOD 為0.296 pmol/L。由于電負性脫氧核糖磷酸骨架之間存在靜電排斥，類似于傳統(tǒng)ssDNA 探針，以發(fā)卡DNA 作為BRE 時，存在電極表面探針組裝密度低以及與靶標雜交效率低等不足。

PNA 是一種人工合成的電中性核酸類似物，通過采用不攜帶電荷的N-（2-氨乙基）-甘氨酸（N-2-AEG）骨架替換DNA 分子的電負性脫氧核糖磷酸骨架獲得[33]。PNA 既能與互補單鏈核酸片段雜交形成穩(wěn)定的雙螺旋，也能經(jīng)由螺旋入侵的方式與dsDNA 的大溝穩(wěn)定結合[34]。PNA 與互補單鏈核酸間的雜交反應呈現(xiàn)以下特征：①分子骨架呈電中性，在電極表面能形成更加致密的單分子層，與電負性核酸片段間結合時無靜電排斥，可形成更加穩(wěn)定的雙螺旋，雜交效率顯著提升，并且形成的雙螺旋具有更高的熱穩(wěn)定性[35]；②能有效區(qū)分單堿基錯配，可用于單核苷酸多態(tài)性分析；③連接N-2-AEG 單元間的酰胺鍵不同于磷酸二酯鍵或肽鍵，可抗核酸酶和蛋白酶水解；④與單鏈核酸間的結合不受溶液離子強度的影響，在Mg2+不存在時也能與互補單鏈核酸發(fā)生高效雜交反應。Li 等[36]以PNA 為BRE，實現(xiàn)了對SARS-CoV-2病毒RNA 的高選擇性電化學檢測， LOD 為0.38 fmol/L。Hu 等[37]以PNA 為BRE，將氨基二茂鐵直接修飾到被PNA 探針捕獲的靶標的5′端游離磷酸基上，實現(xiàn)了對DNA 的快速檢測。但是，相較于ssDNA 探針，目前PNA 探針存在合成費用高等不足。

LNA 是一種修飾過的RNA， RNA 分子中的部分β-D-呋喃核糖的2′-O 與4′-C 被氧亞甲基“橋”共價連接在一起，不僅有效降低了呋喃核糖環(huán)的柔韌性，也在一定程度上提升了磷酸骨架局部結構的穩(wěn)定性[38]。LNA 能與單鏈核酸雜交形成穩(wěn)定的雙螺旋，具有抗酶解能力強和水溶性好等特性[39]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA 同源雙螺旋中的單堿基錯配會使其解鏈溫度（Tm）下降4～16 ℃，而LNA/DNA 異源雙螺旋中的單堿基錯配會使Tm 下降約20 ℃。因此， LNA 與單鏈核酸雜交呈現(xiàn)更高的特異性。Chen 等[40]以LNA 為BRE、MB 為雜交反應指示探針，對DNA 進行電化學檢測， LOD 為0.94 pmol/L。Lin 等[41]以LNA 為BRE、苯甲酸雙核銅（Ⅱ）配合物為雜交反應指示探針（其能插入到LNA/DNA 異源雙螺旋中），對DNA 進行高選擇性電化學檢測， LOD 為0.1 pmol/L。由于存在靜電排斥， LNA 探針與靶標間的雜交反應也存在效率較低等不足。

PMO 為第三代反義寡核苷酸，可阻斷蛋白質翻譯，進而達到抑制靶基因功能的目的，其骨架由亞甲基嗎啉環(huán)與磷酰鍵連接而成[42]。PMO 能與單鏈核酸雜交形成穩(wěn)定的異源雙螺旋，與電負性核酸片段間結合時無靜電排斥，并能更好地抵抗核酸酶水解[43]。與PNA 相比， PMO 具有更好的水溶性。目前，PMO 已被用于核酸的電化學檢測[44]。例如， Tercero 等[29]以PMO 為BRE，通過測量雜交反應前后界面電容的變化，實現(xiàn)了對DNA 的快速檢測。Li 等[45]將PMO 修飾在納米通道表面，以[Fe（CN）6]3–為電活性探針，通過測量雜交反應引起的電流變化，實現(xiàn)了DNA 的免標記型檢測， LOD 為0.1 nmol/L。然而， PMO的合成費用較高。

1.2.2 非核酸類靶標的電化學檢測

針對有機小分子物質（如ATP 和氨基酸）、蛋白質（如糖化血紅蛋白和甲胎蛋白）、外泌體、CTCs、細菌（如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）和病毒（如HIV 病毒和天花病毒）等非核酸類靶標的親和型電化學檢測，常用的BRE 包括抗體、核酸適體以及親和肽等。

基于抗體的高特異性識別，電化學免疫傳感器在非核酸類靶標的檢測中廣泛應用[6，46]。由于抗原-抗體結合會阻礙界面電荷轉移，可將抗體修飾到電極表面，以[Fe（CN）6]4–/3–為電活性探針，通過測量免疫識別所引起的電信號變化，分別實現(xiàn)了對大腸桿菌O157∶H7 和癌胚抗原（CEA）的阻抗型和伏安型檢測，LOD 分別為106 cfu/mL 和3.0 fg/mL[47-48]。由于抗體具有制備過程復雜且批間差異大、穩(wěn)定性差、價格高昂以及不易修飾等缺點，研究人員提出以核酸適體和親和肽作為非核酸類靶標親和捕獲的BRE。

核酸適體是一類由20～100 個堿基組成的單鏈DNA 或RNA 片段，通常經(jīng)由指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）從核酸文庫中體外篩選獲得[49-50]，能夠與有機小分子（如抗生素）[51]、蛋白質（如凝血酶）[52]、外泌體[53]、CTCs[54]、細菌（如霍亂弧菌）[55]以及病毒（如SARS-CoV-2 病毒）[56]等靶標特異性結合。由于核酸適體可人工合成且具有價格低廉、批間差異極小和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[57-58]，在電化學生物傳感領域備受關注[59-60]。例如，研究人員以末端修飾有Fc 探針的核酸適體作為固定化BRE，分別對凝血酶[61]和ATP[62]進行電化學檢測， LOD 分別為0.5 和10 nmol/L。還可將核酸適體作為固定化BRE，采用EIS 對CTC[63]和SARS-CoV-2 病毒[64]進行檢測， LOD 分別為10 和1000 particle/mL。Zhong 等[65]構建了一種伏安型電化學適體傳感器，實現(xiàn)了對黃曲霉毒素B1 的高選擇性檢測， LOD 為1.82 pg/mL。Min 等[66]分別以RNA 和DNA 核酸適體為固定化BRE，對γ-干擾素進行阻抗型檢測， LOD 達到pmol/L 量級。Wan 等[67]以核酸適體為固定化BRE，借助于硼酸鹽親和作用將Fc 探針標記到糖化白蛋白（GA）的非酶促糖基化位點上，實現(xiàn)了高選擇性檢測（該電化學適體傳感器可有效區(qū)分GA 與人血清白蛋白）， LOD 為45.5 ng/mL。然而，核酸適體在生物基質中易被快速降解，與抗體相比，核酸適體的結構穩(wěn)定性仍需進一步提升。

蛋白質分子之間以及抗原-抗體之間的結合通常是通過局部肽段上數(shù)個氨基酸殘基之間的非共價相互作用實現(xiàn)的[68]。雖然某些多肽的序列與抗原的天然表位存在差異，但結合抗體或配體的方式一致，此類具有關鍵氨基酸殘基的多肽通常被稱為模擬表位[69]。因此，可將親和肽作為抗體的替代物，對非核酸類靶標進行高選擇性檢測。類似于核酸適體，親和肽具有可人工合成、價格低、批間差異極小以及熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。研究人員以親和肽作為固定化BRE，分別對脂多糖（LPS）（LOD 為0.08 pg/mL）[70]、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（ NGAL） （ LOD 為1.74 ng/mL） [ 71]、利妥昔單抗（ RitMab） （ LOD 為35.26 ng/mL）[72]和諾如病毒（LOD 為7.8 copies/mL）[73]進行阻抗型檢測。然而，親和肽存在易酶解以及結構穩(wěn)定性差等不足。

2 信號放大策略

在惡性腫瘤的早期診斷以及疫情防控等方面，特定生物靶標的濃度可能處于很低的水平。例如，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNAs）在人血漿中的總濃度僅約為3.0～21.0 amol/L[74]，并且其中與特定疾病相關的某種ctDNA 片段的豐度通常低于1%。為實現(xiàn)低濃度生物靶標的高靈敏電化學檢測，通常需要采用等溫核酸擴增技術[75-76]、催化反應[77-78]、功能納米載體[79-80]以及聚合物材料[81-82]等多種策略放大檢測信號。

2.1 基于等溫核酸擴增技術的信號放大策略

隨著分子生物學的發(fā)展，基于滾環(huán)擴增（RCA）、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）和CRISPR/Cas 系統(tǒng)的等溫核酸擴增技術在生物靶標的高靈敏電化學檢測中引起了廣泛關注[83-84]。Chaibun 等[85]以互補ssDNA 片段為BRE，借助RCA 在電極表面引入大量的電活性探針，對SARS-CoV-2病毒N 和S 基因片段實現(xiàn)了高靈敏檢測， LOD 為1000 fragment/mL。Kim 等[86]以互補ssDNA 片段為固定化BRE，基于RPA 的信號放大策略，對SARS-CoV-2 病毒的RdRP 和S 基因片段進行高靈敏電化學檢測，LOD 低至fg/μL 數(shù)量級。Chen 等[87]以核酸適體為固定化BRE，基于CRISPR/Cas12a 的信號放大作用，實現(xiàn)了對心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的高靈敏電化學檢測（LOD 為10 pg/mL）。與聚合酶鏈式反應（PCR）相比，上述等溫核酸擴增技術具有無需熱循環(huán)等優(yōu)勢；然而，基于RCA、LAMP、RPA 和CRISPR/Cas 系統(tǒng)的等溫核酸擴增均需要使用酶，存在成本高、穩(wěn)定性差等不足。為了克服上述缺陷，研究人員提出將催化發(fā)夾組裝（CHA）等不依賴酶的等溫核酸擴增技術用于信號放大，其具有生物相容性好、反應體系簡單和反應條件溫和等特性[88]。例如， Zhu 等[89]以互補ssDNA 片段為固定化BRE，借助CHA 在電極表面引入大量的[Ru（NH3）6]3+探針，實現(xiàn)了對microRNA 的高靈敏電化學檢測， LOD 為5.24 amol/L。

2.2 基于催化反應的信號放大策略

基于催化反應的信號放大可分為酶促催化和非酶促催化這兩類。其中，酶促催化是采用天然酶（如核酸外切酶、辣根過氧化物酶（HRP）、ALP、GOx 和切刻內切酶）進行信號放大。天然酶具有催化效率高和反應條件溫和等優(yōu)點，在生物靶標的高靈敏電化學檢測中廣泛應用。例如， Fang 等[90]以互補ssDNA片段為BRE，其與靶標雜交后，通過鋅指蛋白ZNF346 對DNA/RNA 異源雙螺旋的識別作用將ALP 引入電極表面，實現(xiàn)了對microRNA 的高靈敏檢測， LOD 為2.0 fmol/L。Wei 等[91]以遠端修飾有熒光素的發(fā)卡DNA 為BRE，其與靶標雜交后，利用抗熒光素抗體與熒光素間的特異性識別將HRP 引入電極表面，實現(xiàn)了對RNA 的高靈敏檢測， LOD 為0.4 fmol/L。Hwang 等[92]構建了一種“夾心型”電化學DNA 生物傳感器，借助ALP 介導的酶促銀沉積，對DNA 進行高靈敏檢測， LOD 為0.1 fmol/L。Salam 等[93]構建了一種夾心型電化學免疫傳感器，借助HRP 的生物催化作用，對鼠傷寒沙門桿菌進行高靈敏檢測， LOD 為20 CFU/mL。Huang 等[94]構建了一種夾心型電化學免疫傳感器，借助于多聚HRP（PolyHRP）的信號放大作用，實現(xiàn)了對神經(jīng)纖維絲輕鏈（NEFL）和白細胞介素6（IL-6）的高靈敏檢測（圖2）， LOD 分別為5.22 和3.69 pg/mL。然而，將天然酶用于信號放大的策略存在檢測成本高、穩(wěn)定性差（天然酶易發(fā)生變性失活）以及酶分子標記過程復雜等不足。鑒于此，近年來，基于金屬卟啉類仿生催化劑[95]、納米酶[96]以及含過渡金屬元素的電催化劑[97]的非酶促催化已被大量應用于生物靶標的高靈敏電化學檢測。例如， Peng 等[98]構建了一種電化學免疫傳感器，借助于G-四鏈體/hemin 復合物的高效電催化活性，實現(xiàn)了對CTC 的高靈敏檢測， LOD 為8 cell/mL。Hu 等[99]以PNA 作為固定化BRE，借助于氯化高鐵血紅素（Hematin）介導的銀沉積，對DNA 進行高靈敏電化學檢測， LOD 為62.41 amol/L。Kwon 等[100]構建了一種夾心型電化學DNA 生物傳感器，借助于Pt 納米粒子（PtNP）對肼的高效電催化活性，實現(xiàn)了對DNA 的高靈敏檢測， LOD為100 pmol/L。

2.3 基于功能納米載體的信號放大策略

納米材料（如碳納米管、金屬納米粒子和有機框架材料）具有極高的比表面積，其表面或內部可攜帶大量的電活性探針（如[Ru（NH3）6]3+）。因此，通過使用功能納米載體，可引入大量電活性探針，實現(xiàn)對生物靶標的高靈敏檢測。例如， Cheng 等[101]以核酸適體作為固定化BRE，待其捕獲靶外泌體后，進一步利用核酸適體對外泌體表面蛋白分子的特異性識別引入表面負載有大量MB 探針的金納米粒子（AuNP），對外泌體進行高靈敏檢測， LOD 為158 particle/μL。Xu 等[102]以底物肽為固定化BRE，通過AuNP 在電極表面引入大量[Ru（NH3）6]3+探針，對PKA 活性進行高靈敏檢測， LOD 為150 mU/mL。Zhang 等[103]構建了一種夾心型電化學免疫傳感器，利用共價有機框架（COF）將大量甲苯胺藍探針引入電極表面，對cTnI 進行高靈敏檢測， LOD 為0.17 pg/mL。

2.4 基于聚合物材料的信號放大策略

聚合物的分子鏈由大量單體或結構單元共價連接而成。利用聚合物材料（含天然的和人工合成的）將大量電活性探針引入電極表面，可實現(xiàn)對生物靶標的高靈敏檢測[104-109]。由于原子轉移自由基聚合（ATRP）[110]和可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT）聚合[111]等可逆失活自由基聚合（RDRP）技術具有調控方式豐富、反應條件溫和和分子設計能力強等優(yōu)良特性[112]， Hu 研究組在利用RDRP 技術引入大量的電活性探針對生物靶標進行高靈敏電化學檢測方面開展了一系列研究工作。例如，將底物肽作為固定化BRE，以甲基丙烯酸二茂鐵基甲酯（FcMMA）為單體，借助熱引發(fā)RAFT 聚合（以水溶性偶氮鹽2，2′-偶氮雙[2-（2-咪唑啉-2-基）丙烷]二鹽酸鹽（VA-044）為自由基引發(fā)劑）[13]和電化學調控RAFT 聚合（以芳基重氮鹽BrPhN2+為電子轉移媒介體）[113]在電極表面引入大量Fc 探針，分別實現(xiàn)了對凝血酶活性和PKA 活性的高靈敏檢測；以核酸適體為固定化BRE， FcMMA 為單體，借助電化學調控ATRP（eATRP，通過硼酸鹽親和作用將ATRP 引發(fā)劑標記到靶標的聚糖鏈上）實現(xiàn)了對甲胎蛋白（AFP）[114]、CEA[115]、LPS[116]和曲妥珠單抗（TraMab）[117]的高靈敏電化學檢測， LOD 低至pg/mL 甚至fg/mL 量級。為了進一步簡化操作流程，他們還提出直接將多糖類天然聚合物材料用于信號放大，以PNA 為固定化BRE，借助于多糖將大量Fc探針引入電極表面，實現(xiàn)了對DNA 的高靈敏檢測[118]。

由于糖蛋白（如AFP、CEA、人絨毛膜促性腺激素、抗體和凝集素）、外泌體、CTCs、細菌和病毒等生物靶標上均攜帶有聚糖鏈且聚糖鏈上的順式1，2-和1，3-二醇位點可與苯硼酸（PBA）基團選擇性共價交聯(lián)[61]，因此，可通過硼酸鹽親和作用將電活性探針標記到相關靶標的聚糖鏈上，對其進行高靈敏電化學檢測。受此啟發(fā)， Hu 研究組利用核酸適體對靶標進行捕獲，并通過硼酸鹽親和作用將大量Fc 探針標記到靶標的聚糖鏈上，實現(xiàn)了對AFP[119]和LPS[120]的高靈敏電化學檢測， LOD 分別為0.037 ng/mL 和0.34 pg/mL。為進一步提高傳感器的抗干擾性能和重現(xiàn)性，他們以近端修飾有MB 探針的核酸適體作為固定化BRE，通過將大量Fc 探針標記到靶標的聚糖鏈上，分別實現(xiàn)了對CA15-3[ 121]和貝伐珠單抗（BevMab）[122]的高靈敏比率型電化學檢測，檢測原理如圖3 所示。此外， Lv 等[123]以親和肽為固定化BRE，對人絨毛膜促性腺激素（hCG）進行特異性識別與捕獲，利用NaIO4 將靶標聚糖鏈上的鄰位羥基位點氧化為醛基，生成的醛基進一步將Ag+還原成金屬Ag，并原位沉積在電極表面，對金屬Ag 進行Ag/AgCl固態(tài)伏安溶出分析，進而實現(xiàn)對hCG 的高靈敏電化學檢測， LOD 為0.45 mIU/mL。借助靶標自身攜帶的聚糖鏈引入大量電活性探針的策略具有成本低、操作簡便和檢測時間短等優(yōu)良特性，在攜帶有聚糖鏈的生物靶標的即時檢驗（POCT）中具有良好的應用前景。

3 結論與展望

本文歸納總結了電化學生物傳感中常用的BRE 與信號放大策略，著重介紹了近年來電化學生物傳感器在有機小分子、蛋白質（含酶）、核酸、外泌體、CTCs、細菌和病毒等生物靶標檢測中的研究和應用進展。相較于傳統(tǒng)的基于質譜與光譜原理的儀器分析方法，電化學生物傳感器具有測量范圍寬、易于集成與微小型化、靈敏度和選擇性高、儀器設備簡單且便攜、響應速度快等優(yōu)勢，在醫(yī)學診斷、健康護理和環(huán)境監(jiān)測等領域展示出巨大的應用前景。利用酶-底物或受體-配體間的特異性識別，可實現(xiàn)相應靶標的高選擇性檢測。其中，酶-底物型識別可用于酶活性以及底物濃度的檢測，而受體-配體型識別只能用于檢測靶標濃度。得益于天然酶的高特異性和高催化效率，基于酶-底物識別的電化學生物傳感器通常具有靈敏度高和可靠性好等優(yōu)點。在受體-配體型電化學生物傳感方面，核酸類靶標可通過Watson-Crick 堿基互補配對原則利用互補的單鏈探針捕獲，而非核酸類靶標利用抗體、核酸適體或親和肽識別與捕獲。借助核酸分子雜交和抗原-抗體免疫識別，可實現(xiàn)相應靶標的可靠識別與捕獲；相較而言，核酸適體和親和肽的結構穩(wěn)定性較差且易酶解，在實際樣品中對靶標識別的可靠性尚不理想。圍繞生物靶標的高靈敏電化學檢測，現(xiàn)有策略主要是將等溫核酸擴增、催化反應、功能納米載體或聚合物材料引入電極界面實現(xiàn)信號放大。然而，除了經(jīng)典的葡萄糖酶電極已成功實現(xiàn)商業(yè)化并已被廣泛應用于血糖的日常分析外，目前尚缺少電化學生物傳感器實際應用的案例。究其原因，主要包括以下4 個方面：（1）不同于血糖分析時的高靶標濃度（空腹血糖的正常范圍為4.4～6.1 mmol/L），血清等實際樣品中的絕大多數(shù)生物靶標（如外泌體和CTCs）的濃度通常處于很低的水平，利用信號放大策略對靶標進行高靈敏檢測會導致操作復雜化以及可控性差；（2）生物識別元件功能化電極界面的穩(wěn)定性較差，易產生“假陽性”和“假陰性”結果，使得電化學生物傳感器的重現(xiàn)性不能滿足實際應用需求；（3）實際樣品中存在大量與靶標組成、結構或性質相似的干擾性組分，并且電極表面易發(fā)生非特異性吸附；（4）目前的研究主要聚焦于材料的合成與表征以及檢測靈敏度的提高，而在提高電極界面的穩(wěn)定性、檢測結果的可重現(xiàn)性、用戶友好性、成本效益以及實際樣品中靶標的可靠性識別等方面尚無實質性突破。電化學生物傳感器的相關研究工作應充分考慮靶標在實際檢測場景下的濃度范圍，而不應盲目追求過低的LOD。由于糖蛋白、外泌體、CTCs、細菌和病毒等生物靶標上均攜帶有聚糖鏈，充分利用靶標自身所攜帶的聚糖鏈對其進行高靈敏檢測，有望顯著提升電化學生物傳感器的實用性，并大幅降低檢測成本。為滿足POCT 等場景的實際應用需求，電化學生物傳感器應具有較高的集成度與簡便性，應能夠快速直接給出靶標的具體濃度（或活性）信息。隨著與大數(shù)據(jù)、人工智能、移動電子設備、無線通信技術、3D 打印和物聯(lián)網(wǎng)等的深度融合，電化學生物傳感器將持續(xù)朝著便攜化、集成化、自動化、數(shù)字化、高通量、微小型化以及可植入式等方向發(fā)展。

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廣東省科協(xié)青年科技人才培育計劃（No. SKXRC202414）、廣東省普通高校特色創(chuàng)新項目（No. 2024KTSCX154）、廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（No. 2022A1515010618）、廣州市科學技術協(xié)會青年科技人才托舉項目（No. QT20230101007）和廣州大學大學生創(chuàng)新訓練項目（No. S202411078056）資助。