摘要 熒光傳感技術(shù)在快速檢測和可視化分析研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究采用兩步合成法制備了一種新型熒光小分子SA-AP-PPh3。此熒光小分子由三苯基膦和水楊醛-苯胺席夫堿組成，具有激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）特性和較大的斯托克斯位移，可以選擇性檢測Cu2+，檢測范圍為0.5～15 μmol/L，檢出限低至261 nmol/L，可用于實際水樣中Cu2+濃度的測定。此熒光小分子具備線粒體靶向功能，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞線粒體的可視化成像，可用于細胞內(nèi)Cu2+的檢測。

關(guān)鍵詞 聚集誘導(dǎo)發(fā)光；激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移；銅離子；檢測；細胞成像

銅（Cu）廣泛應(yīng)用于石油化工、機械制造和建筑等領(lǐng)域[1]，同時也是人體必須的微量元素之一。Cu2+在許多生理活動過程中發(fā)揮著重要作用，是許多活性酶的關(guān)鍵組分，如超氧化物歧化酶、細胞色素C 氧化酶和酪氨酸酶等[2-3]。過量的Cu2+可能會導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)和代謝紊亂疾病，如Wilson 病[4]、Menke 綜合征[5]、帕金森病[6]和阿爾茨海默病[7-8]等。然而，由于人類活動，Cu2+排放量不斷增加，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了日益嚴(yán)重的威脅[9]。因此，開發(fā)選擇性好和靈敏度高的Cu2+檢測方法具有重要意義。

相比于原子吸收、電感耦合等離子體質(zhì)譜和電化學(xué)等方法，熒光檢測法在重金屬離子的快速檢測和可視化分析研究中備受關(guān)注[10]。激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）型熒光分子探針由于具有合成簡單以及光學(xué)性質(zhì)多樣等特征，近年來引起了廣泛關(guān)注[11–14]。此外，許多ESIPT 分子在聚集態(tài)下不僅可以有效地限制分子內(nèi)的振轉(zhuǎn)運動，還能穩(wěn)定分子內(nèi)的氫鍵，促進ESIPT 過程，使酮式發(fā)射效率大幅提升[15]，因此，這些ESIPT 分子常具有大的斯托克斯位移和聚集誘導(dǎo)發(fā)光（Aggregation-induced emission， AIE）特性，具有ESIPT 性質(zhì)的熒光探針易獲得更好的檢測效果[16]。

本研究設(shè)計并合成了一種帶有三苯基膦基團和水楊醛縮羥基苯胺結(jié)構(gòu)的席夫堿分子（SA-AP-PPh3）。該分子具有典型的ESIPT性質(zhì)和較大的斯托克斯位移，在水溶液中，Cu2+能夠淬滅該分子的熒光，基于此建立了一種全新的Cu2+熒光檢測方法。此外，該分子具備對細胞線粒體進行成像的能力，因此可用于細胞內(nèi)Cu2+的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Avance Neo 400 M 核磁共振儀（NMR，德國Bruker 公司）；UV-2550型紫外-可見分光光譜儀（日本島津公司）；F97 熒光分光光度計（棱光技術(shù)公司）；Thermo Scientific Q Exactive 型質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；NanoBrook Omni 粒徑電位分析儀（DLS，美國Brookhaven 公司）；Leica TCS SP8 型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；SpectraMax i3x 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）。

CuSO4、AgNO3、CaCl2、CoCl2、KCl、MnCl2、NaCl、NH4Cl、NiCl2、Sr（NO）2、CrCl3、AlCl3、CdSO4、FeCl3、FeCl2、HgCl2、BaSO4、MgSO4、NaOH、三苯基膦（PPh3）、對氨基苯酚（AP）和水楊醛（SA）均為分析純，購于阿拉丁生化科技股份有限公司；2-（4-（2-羥乙基）哌嗪-1-基）乙烷-1-磺酸（HEPES，99%）、噻唑四唑藍溴化鹽（MTT，98%）購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）和MitoTracker?Red CM-H2XRos（MTR）購于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；四氫呋喃（THF）、乙醇（EtOH）、乙腈（MeCN）和二甲亞砜（DMSO）等均為分析純，購于科隆化工試劑廠。

1.2 SA-AP-PPh3 的制備

SA-AP-PPh3 的合成路線如圖1所示。參考文獻[17]的方法合成化合物SA-PPh3，具體步驟如下：向干燥的100 mL圓底燒瓶中加入SA（1.7 g，10 mmol）、PPh3（3.1 g，12 mmol）和40 mL四氫呋喃，攪拌回流6 h，待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過濾，真空干燥得到3.9 g固體物質(zhì)SA-PPh3，產(chǎn)率為91%。1H NMR（400 MHz，DMSOd6）：δ 10.99（s，1H），10.16（s，1H），7.97～7.87（m，3H），7.84～7.58（m，12H），7.24（s，1H），7.08（d，J=8.7 Hz，1H），6.90（d，J=8.5 Hz，1H），5.12（d，J=15.2 Hz，2H）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）：δ 189.79，161.42，138.44，138.37，135.53，134.58，134.45，130.65，130.56，130.48，122.98，122.94，118.74，118.49，118.38，117.62，28.04。

向干燥的100 mL 圓底燒瓶中加入SA-PPh3（2.5 g，5.8 mmol）、AP（0.76 g，6.96 mmol）和30 mL 乙醇，加熱回流5 h，將溶液濃縮至5 mL。向圓底燒瓶中加入10 mL四氫呋喃，待完全析出后過濾，并用四氫呋喃洗滌3 次，真空干燥后得到2.6 g 固體粉末SA-AP-PPh3，產(chǎn)率為83%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）： δ 13.32（s，1H），9.77（s，1H），8.60（s，1H），7.92（t，J =7.5 Hz，3H），7.79～7.68（m，12H），7.26（d，J=9.1 Hz，2H），7.18（s，1H），6.91～6.78（m，4H），5.14（d，J=14.8 Hz，2H）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）： δ 160.28，158.65，157.66，139.43，135.56，135.53，135.05，134.56，134.46，134.26，130.68，130.55，123.18，118.71，117.86，117.56，116.44，53.37。LC-MS m/z： calculated for C32H27NO2P+（[M-Cl]+）488.18， found 488.12。

1.3 粒徑測試

向5 mL 離心管中加入100 μL SA-AP-PPh3 溶液（0.1 mmol/L）和1.82 mL HEPES 緩沖液（10 mmol/L，pH=7.0），再加入80 μL Cu2+（10–3 mol/L）溶液，混勻，測定其DLS 數(shù)據(jù)，取5 組數(shù)據(jù)的平均值。空白組用蒸餾水代替Cu2+溶液。

1.4 Cu2+的熒光檢測方法

分別將不同體積的Cu2+（10–3 mol/L）溶液加入到含有50 μL SA-AP-PPh3（0.1 mmol/L）和800 μL HEPES緩沖液（10 mmol/L， pH=7.0）的1.5 mL EP管中，補加HEPES緩沖液至總體積為1 mL，漩渦混合均勻，在395 nm激發(fā)波長下，測量待測液的熒光光譜?？瞻捉M用等體積的HEPES代替Cu2+溶液。

1.5 選擇性分析

分別將150 μL 不同金屬離子（Cu2+、Ag+、Ca2+、Co2+、K+、Mn2+、Na+、NH4+、Ni2+、Sr2+、Cr3+、Al3+、Cd2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ba2+和Mg2+，濃度均為0.1 mmol/L）溶液加入到含有50 μL SA-AP-PPh3（0.1 mmol/L）和800 μL HEPES緩沖溶液（10 mmol/L， pH=7.0）的1.5 mL EP管中，漩渦混合均勻，在395 nm激發(fā)波長下，測量待測液的熒光光譜?？瞻捉M用等體積的HEPES代替金屬離子溶液。

1.6 實際水樣中Cu2+的加標(biāo)回收實驗

實際水樣為實驗室自來水，經(jīng)0.22 μm 微濾薄膜過濾后，采用1.4 節(jié)建立的熒光檢測方法進行水樣中Cu2+（1、5 和10 μmol/L）的加標(biāo)回收實驗，計算回收率。

1.7 細胞實驗

MTT 法測定細胞毒性 向96 孔板中加入Hela 細胞（每孔105 個細胞），于37 ℃、含有5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向各孔添加含不同濃度SA-AP-PPh3 的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入12 μL MTT 的PBS 緩沖溶液，在37 ℃、5% CO2 的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處的吸光度，分析細胞的生長和變化情況。

細胞共定位實驗 將HeLa 細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清、1%鏈霉素和1%青霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，然后加入SA-AP-PPh3（20 μmol/L）和MTR（50 nmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)60 min，用PBS 緩沖溶液沖洗3 次，采用激光共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片。

細胞中Cu2+的檢測 將HeLa 細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清、1%鏈霉素和1%青霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)皿中加入SA-AP-PPh3（20 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)60 min，隨后加入20 μmol/L Cu2+溶液，培養(yǎng)30 min，用PBS 沖洗細胞3 次，采用激光共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片。向含有HeLa 細胞的共聚焦培養(yǎng)皿中加入SA-AP-PPh3（20 μmol/L）作為對照組。

2 結(jié)果與討論

2.1 SA-AP-PPh3 的設(shè)計及基本光學(xué)性質(zhì)

如圖1 所示，通過席夫堿反應(yīng)將SA-PPh3 與AP結(jié)合，制備SA-AP-PPh3。此分子中三苯基膦基團是典型的線粒體靶向基團[18]，而水楊醛縮苯胺部分常具有ESIPT 性質(zhì)和離子結(jié)合能力。因此，將兩部分相互結(jié)合有可能獲得一種具有線粒體靶向能力的Cu2+熒光探針。

SA-AP-PPh3 在DMSO 中（10 μmol/L）的最大吸收波長約為360 nm，最大發(fā)射波長約為440 nm， 440 nm處的熒光所對應(yīng)的最大激發(fā)波長約為395 nm（圖2A）。如圖2B 所示，CHCl3 的最大發(fā)射峰在520 nm 處，并且在440 nm 附近有一個弱的發(fā)射峰；乙腈分別在440 和515 nm 處也出現(xiàn)了雙發(fā)射峰，但515 nm 處的熒光強度明顯上升；而DMSO 的主要發(fā)射峰在440 nm 附近。上述光譜數(shù)據(jù)表明，隨著溶劑極性的增加（溶劑極性順序：CHCl3

2.2 Cu2+的檢測

如圖3A 所示，Cu2+能夠降低SA-AP-PPh3 的熒光強度，并且隨Cu2+濃度增加，熒光強度逐漸降低，因此，SA-AP-PPh3 可作為熒光探針用于Cu2+的檢測。為獲得最佳檢測效果，對檢測條件進行了優(yōu)化。考察了室溫條件下加入Cu2+前后熒光的動態(tài)曲線，發(fā)現(xiàn)加入Cu2+后立即測定熒光光譜，熒光強度已經(jīng)降低，并保持穩(wěn)定（圖3B）。為保證實驗的一致性，選擇加入Cu2+并混合3 min 后測定熒光值。如圖3C 所示，在10～40 ℃范圍內(nèi)，熒光降低程度幾乎一致，對檢測效果的影響可忽略，因此在室溫下進行后續(xù)實驗。考察了pH 值對SA-AP-PPh3 檢測效果的影響，如圖3D 所示，在中性及偏堿性（pH 7～8）的環(huán)境下Cu2+的檢測效果最優(yōu)。為與后續(xù)的細胞實驗條件保持一致，最終選擇pH=7.0 進行后續(xù)實驗。

在含有SA-AP-PPh3 的HEPES 緩沖溶液（10 mmol/L， pH=7.0）中加入不同濃度的Cu2+（0～40 μmol/L），測定其熒光光譜（圖4A）。結(jié)果表明，未加入Cu2+時，溶液熒光強度最大，隨著溶液中Cu2+濃度增大，體系的熒光強度逐漸降低，505 nm 處的熒光強度與Cu2+濃度之間的關(guān)系如圖4B 所示，表明SA-AP-PPh3 探針對Cu2+具有較好的熒光響應(yīng)。在0.5～15 μmol/L 范圍內(nèi)，Cu2+濃度與探針在505 nm 處的熒光強度存在良好的線性關(guān)系，線性方程為I=–175.8728C+5053.0449（圖4C），檢出限為261 nmol/L（S/N=3），遠低于我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749—2022）[22]中規(guī)定的Cu2+的最高限量（1.0 mg/L，約15.6 μmol/L）。此結(jié)果表明本方法能夠滿足環(huán)境中Cu2+的檢測需求。

考察了探針檢測Cu2+的選擇性，如圖4D 所示，Cu2+的加入使得溶液的熒光強度大幅下降，而其它離子在相同濃度下不能或者僅能微弱地降低體系的熒光強度，表明此探針分子對Cu2+具有良好的選擇性。

考察了SA-AP-PPh3 探針對實際樣品中Cu2+的檢測效果。將此探針應(yīng)用于實際自來水樣品中Cu2+的檢測，結(jié)果如表1 所示，Cu2+的加標(biāo)回收率為98.4%～105.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.3%～4.1%，表明此探針可用于實際樣品中Cu2+的檢測，效果良好。

2.3 檢測機理

Cu2+能夠降低SA-AP-PPh3 探針的熒光強度。粒徑測試結(jié)果（圖5A）表明， SA-AP-PPh3 在水中存在納米尺度的聚集現(xiàn)象，與之前測定的吸收光譜中的帶邊抬起現(xiàn)象一致（圖2D），這表明盡管分子中含有親水性的季膦鹽結(jié)構(gòu)，但由于分子中含有較多剛性的共軛結(jié)構(gòu)（5 個苯環(huán)），疏水性依然較強，濃度較大時僅能分散在水中。加入Cu2+后，粒徑進一步增加，表明SA-AP-PPh3 與Cu2+之間存在相互作用，這與文獻[23-24]報道的結(jié)果一致。核磁共振氫譜見圖5B，在加入50 μmol/L Cu2+后， SA-AP-PPh3 中的羥基質(zhì)子對應(yīng)的峰消失，表明Cu2+可與SA-AP-PPh3 中的羥基結(jié)合，導(dǎo)致探針分子的ESIPT 過程受到抑制，熒光強度下降[18]。加入Cu2+前后的瞬態(tài)熒光光譜如圖5C 所示，加入Cu2+后，探針分子的壽命有一定程度下降，這說明本方法存在動態(tài)淬滅過程。

2.4 細胞成像

利用MTT 實驗評估了不同濃度的SA-AP-PPh3 探針對Hela 細胞的細胞毒性，結(jié)果表明， 25 μmol/LSA-AP-PPh3 與Hela 細胞孵育24 h 后，MTT 代謝產(chǎn)物的吸光度與空白相比稍有降低，細胞存活率高于80%，表明此探針具有良好的生物相容性，最終選取20 μmol/L SA-AP-PPh3 進行細胞實驗。

三苯基膦鹽基團具有線粒體靶向特性[25]。選取商業(yè)化的線粒體染料MTR作為參照，進行細胞共定位實驗，以考察SA-AP-PPh3 在細胞內(nèi)的分布情況。SA-AP-PPh3 和MTR 共同孵育60 min 后，共聚焦圖像如圖6A～6C所示。在SA-AP-PPh3 的綠色通道（圖6A）和MTR的紅色通道（圖6B）中分別檢測到綠色熒光和紅色熒光。由圖6A～6C 中3 個劃線位置的熒光信號強度圖（圖6D～6F）可知，綠光通道與紅光通道的發(fā)光位置幾乎一致，信號強度也呈現(xiàn)出高度的一致性。兩個成像通道的熒光疊加圖（圖6C）顯示， SA-AP-PPh3的藍色熒光與MTR的紅色熒光重疊較高。通過圖像處理軟件Image J對兩個通道的共定位情況進行分析，計算發(fā)現(xiàn)重合率為77%。以上結(jié)果表明， SA-AP-PPh3 主要附著于細胞的線粒體，具有線粒體靶向功能。

考察了SA-AP-PPh3 探針檢測細胞中Cu2+的應(yīng)用潛力。向含有Hela 細胞的共聚焦培養(yǎng)皿中加入探針SA-AP-PPh3，孵育60 min 后，向其中一組加入Cu2+，繼續(xù)孵育30 min，采用PBS 沖洗后觀測細胞共聚焦成像結(jié)果。如圖7A 所示，僅加入探針的細胞中能夠觀測到較強的熒光信號，而加入探針和Cu2+的細胞中的熒光信號明顯降低（圖7B）。兩張共聚焦照片所采集的平均光密度結(jié)果（圖7C）表明，加入Cu2+后，熒光強度僅為原來的1/5。以上實驗結(jié)果表明，SA-AP-PPh3 探針可用于細胞內(nèi)Cu2+的檢測。

3 結(jié)論

以含有PPh3 官能團的SA 衍生物和AP 為原料，通過席夫堿反應(yīng)合成了一種新型有機熒光小分子探針SA-AP-PPh3，用于水中Cu2+的熒光測定。合成的SA-AP-PPh3 具有明顯的ESIPT 性質(zhì)，與Cu2+結(jié)合后，ESIPT 過程受阻，進而引起熒光強度降低。Cu2+濃度在0.5～15 μmol/L 范圍內(nèi)，此探針對Cu2+表現(xiàn)出優(yōu)異的線性響應(yīng)，檢出限為261 nmol/L，可用于實際水樣中Cu2+的定量分析。此外，細胞實驗表明，此探針能夠定位細胞線粒體，具有檢測細胞中Cu2+的能力。本方法為Cu2+的高效和靈敏檢測提供了新思路。

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