摘要 熒光傳感技術(shù)在快速檢測和可視化分析研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究采用兩步合成法制備了一種新型熒光小分子SA-AP-PPh3。此熒光小分子由三苯基膦和水楊醛-苯胺席夫堿組成,具有激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)特性和較大的斯托克斯位移,可以選擇性檢測Cu2+,檢測范圍為0.5~15 μmol/L,檢出限低至261 nmol/L,可用于實際水樣中Cu2+濃度的測定。此熒光小分子具備線粒體靶向功能,能夠?qū)崿F(xiàn)細胞線粒體的可視化成像,可用于細胞內(nèi)Cu2+的檢測。
關(guān)鍵詞 聚集誘導(dǎo)發(fā)光;激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移;銅離子;檢測;細胞成像
銅(Cu)廣泛應(yīng)用于石油化工、機械制造和建筑等領(lǐng)域[1],同時也是人體必須的微量元素之一。Cu2+在許多生理活動過程中發(fā)揮著重要作用,是許多活性酶的關(guān)鍵組分,如超氧化物歧化酶、細胞色素C 氧化酶和酪氨酸酶等[2-3]。過量的Cu2+可能會導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)和代謝紊亂疾病,如Wilson 病[4]、Menke 綜合征[5]、帕金森病[6]和阿爾茨海默病[7-8]等。然而,由于人類活動,Cu2+排放量不斷增加,對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了日益嚴(yán)重的威脅[9]。因此,開發(fā)選擇性好和靈敏度高的Cu2+檢測方法具有重要意義。
相比于原子吸收、電感耦合等離子體質(zhì)譜和電化學(xué)等方法,熒光檢測法在重金屬離子的快速檢測和可視化分析研究中備受關(guān)注[10]。激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)型熒光分子探針由于具有合成簡單以及光學(xué)性質(zhì)多樣等特征,近年來引起了廣泛關(guān)注[11–14]。此外,許多ESIPT 分子在聚集態(tài)下不僅可以有效地限制分子內(nèi)的振轉(zhuǎn)運動,還能穩(wěn)定分子內(nèi)的氫鍵,促進ESIPT 過程,使酮式發(fā)射效率大幅提升[15],因此,這些ESIPT 分子常具有大的斯托克斯位移和聚集誘導(dǎo)發(fā)光(Aggregation-induced emission, AIE)特性,具有ESIPT 性質(zhì)的熒光探針易獲得更好的檢測效果[16]。
本研究設(shè)計并合成了一種帶有三苯基膦基團和水楊醛縮羥基苯胺結(jié)構(gòu)的席夫堿分子(SA-AP-PPh3)。該分子具有典型的ESIPT性質(zhì)和較大的斯托克斯位移,在水溶液中,Cu2+能夠淬滅該分子的熒光,基于此建立了一種全新的Cu2+熒光檢測方法。此外,該分子具備對細胞線粒體進行成像的能力,因此可用于細胞內(nèi)Cu2+的檢測。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
Avance Neo 400 M 核磁共振儀(NMR,德國Bruker 公司);UV-2550型紫外-可見分光光譜儀(日本島津公司);F97 熒光分光光度計(棱光技術(shù)公司);Thermo Scientific Q Exactive 型質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技公司);NanoBrook Omni 粒徑電位分析儀(DLS,美國Brookhaven 公司);Leica TCS SP8 型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica 公司);SpectraMax i3x 型酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司)。
CuSO4、AgNO3、CaCl2、CoCl2、KCl、MnCl2、NaCl、NH4Cl、NiCl2、Sr(NO)2、CrCl3、AlCl3、CdSO4、FeCl3、FeCl2、HgCl2、BaSO4、MgSO4、NaOH、三苯基膦(PPh3)、對氨基苯酚(AP)和水楊醛(SA)均為分析純,購于阿拉丁生化科技股份有限公司;2-(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基)乙烷-1-磺酸(HEPES,99%)、噻唑四唑藍溴化鹽(MTT,98%)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.2~7.4)和MitoTracker?Red CM-H2XRos(MTR)購于翌圣生物科技(上海)股份有限公司;四氫呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、乙腈(MeCN)和二甲亞砜(DMSO)等均為分析純,購于科隆化工試劑廠。
1.2 SA-AP-PPh3 的制備
SA-AP-PPh3 的合成路線如圖1所示。參考文獻[17]的方法合成化合物SA-PPh3,具體步驟如下:向干燥的100 mL圓底燒瓶中加入SA(1.7 g,10 mmol)、PPh3(3.1 g,12 mmol)和40 mL四氫呋喃,攪拌回流6 h,待反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫,過濾,真空干燥得到3.9 g固體物質(zhì)SA-PPh3,產(chǎn)率為91%。1H NMR(400 MHz,DMSOd6):δ 10.99(s,1H),10.16(s,1H),7.97~7.87(m,3H),7.84~7.58(m,12H),7.24(s,1H),7.08(d,J=8.7 Hz,1H),6.90(d,J=8.5 Hz,1H),5.12(d,J=15.2 Hz,2H)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6):δ 189.79,161.42,138.44,138.37,135.53,134.58,134.45,130.65,130.56,130.48,122.98,122.94,118.74,118.49,118.38,117.62,28.04。
向干燥的100 mL 圓底燒瓶中加入SA-PPh3(2.5 g,5.8 mmol)、AP(0.76 g,6.96 mmol)和30 mL 乙醇,加熱回流5 h,將溶液濃縮至5 mL。向圓底燒瓶中加入10 mL四氫呋喃,待完全析出后過濾,并用四氫呋喃洗滌3 次,真空干燥后得到2.6 g 固體粉末SA-AP-PPh3,產(chǎn)率為83%。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6): δ 13.32(s,1H),9.77(s,1H),8.60(s,1H),7.92(t,J =7.5 Hz,3H),7.79~7.68(m,12H),7.26(d,J=9.1 Hz,2H),7.18(s,1H),6.91~6.78(m,4H),5.14(d,J=14.8 Hz,2H)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6): δ 160.28,158.65,157.66,139.43,135.56,135.53,135.05,134.56,134.46,134.26,130.68,130.55,123.18,118.71,117.86,117.56,116.44,53.37。LC-MS m/z: calculated for C32H27NO2P+([M-Cl]+)488.18, found 488.12。
1.3 粒徑測試
向5 mL 離心管中加入100 μL SA-AP-PPh3 溶液(0.1 mmol/L)和1.82 mL HEPES 緩沖液(10 mmol/L,pH=7.0),再加入80 μL Cu2+(10–3 mol/L)溶液,混勻,測定其DLS 數(shù)據(jù),取5 組數(shù)據(jù)的平均值。空白組用蒸餾水代替Cu2+溶液。
1.4 Cu2+的熒光檢測方法
分別將不同體積的Cu2+(10–3 mol/L)溶液加入到含有50 μL SA-AP-PPh3(0.1 mmol/L)和800 μL HEPES緩沖液(10 mmol/L, pH=7.0)的1.5 mL EP管中,補加HEPES緩沖液至總體積為1 mL,漩渦混合均勻,在395 nm激發(fā)波長下,測量待測液的熒光光譜??瞻捉M用等體積的HEPES代替Cu2+溶液。
1.5 選擇性分析
分別將150 μL 不同金屬離子(Cu2+、Ag+、Ca2+、Co2+、K+、Mn2+、Na+、NH4+、Ni2+、Sr2+、Cr3+、Al3+、Cd2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ba2+和Mg2+,濃度均為0.1 mmol/L)溶液加入到含有50 μL SA-AP-PPh3(0.1 mmol/L)和800 μL HEPES緩沖溶液(10 mmol/L, pH=7.0)的1.5 mL EP管中,漩渦混合均勻,在395 nm激發(fā)波長下,測量待測液的熒光光譜??瞻捉M用等體積的HEPES代替金屬離子溶液。
1.6 實際水樣中Cu2+的加標(biāo)回收實驗
實際水樣為實驗室自來水,經(jīng)0.22 μm 微濾薄膜過濾后,采用1.4 節(jié)建立的熒光檢測方法進行水樣中Cu2+(1、5 和10 μmol/L)的加標(biāo)回收實驗,計算回收率。
1.7 細胞實驗
MTT 法測定細胞毒性 向96 孔板中加入Hela 細胞(每孔105 個細胞),于37 ℃、含有5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向各孔添加含不同濃度SA-AP-PPh3 的DMEM 培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后每孔加入12 μL MTT 的PBS 緩沖溶液,在37 ℃、5% CO2 的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處的吸光度,分析細胞的生長和變化情況。
細胞共定位實驗 將HeLa 細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中,用含10%胎牛血清、1%鏈霉素和1%青霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,然后加入SA-AP-PPh3(20 μmol/L)和MTR(50 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)60 min,用PBS 緩沖溶液沖洗3 次,采用激光共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片。
細胞中Cu2+的檢測 將HeLa 細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中,用含10%胎牛血清、1%鏈霉素和1%青霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)皿中加入SA-AP-PPh3(20 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)60 min,隨后加入20 μmol/L Cu2+溶液,培養(yǎng)30 min,用PBS 沖洗細胞3 次,采用激光共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片。向含有HeLa 細胞的共聚焦培養(yǎng)皿中加入SA-AP-PPh3(20 μmol/L)作為對照組。
2 結(jié)果與討論
2.1 SA-AP-PPh3 的設(shè)計及基本光學(xué)性質(zhì)
如圖1 所示,通過席夫堿反應(yīng)將SA-PPh3 與AP結(jié)合,制備SA-AP-PPh3。此分子中三苯基膦基團是典型的線粒體靶向基團[18],而水楊醛縮苯胺部分常具有ESIPT 性質(zhì)和離子結(jié)合能力。因此,將兩部分相互結(jié)合有可能獲得一種具有線粒體靶向能力的Cu2+熒光探針。
SA-AP-PPh3 在DMSO 中(10 μmol/L)的最大吸收波長約為360 nm,最大發(fā)射波長約為440 nm, 440 nm處的熒光所對應(yīng)的最大激發(fā)波長約為395 nm(圖2A)。如圖2B 所示,CHCl3 的最大發(fā)射峰在520 nm 處,并且在440 nm 附近有一個弱的發(fā)射峰;乙腈分別在440 和515 nm 處也出現(xiàn)了雙發(fā)射峰,但515 nm 處的熒光強度明顯上升;而DMSO 的主要發(fā)射峰在440 nm 附近。上述光譜數(shù)據(jù)表明,隨著溶劑極性的增加(溶劑極性順序:CHCl3
2.2 Cu2+的檢測
如圖3A 所示,Cu2+能夠降低SA-AP-PPh3 的熒光強度,并且隨Cu2+濃度增加,熒光強度逐漸降低,因此,SA-AP-PPh3 可作為熒光探針用于Cu2+的檢測。為獲得最佳檢測效果,對檢測條件進行了優(yōu)化。考察了室溫條件下加入Cu2+前后熒光的動態(tài)曲線,發(fā)現(xiàn)加入Cu2+后立即測定熒光光譜,熒光強度已經(jīng)降低,并保持穩(wěn)定(圖3B)。為保證實驗的一致性,選擇加入Cu2+并混合3 min 后測定熒光值。如圖3C 所示,在10~40 ℃范圍內(nèi),熒光降低程度幾乎一致,對檢測效果的影響可忽略,因此在室溫下進行后續(xù)實驗。考察了pH 值對SA-AP-PPh3 檢測效果的影響,如圖3D 所示,在中性及偏堿性(pH 7~8)的環(huán)境下Cu2+的檢測效果最優(yōu)。為與后續(xù)的細胞實驗條件保持一致,最終選擇pH=7.0 進行后續(xù)實驗。
在含有SA-AP-PPh3 的HEPES 緩沖溶液(10 mmol/L, pH=7.0)中加入不同濃度的Cu2+(0~40 μmol/L),測定其熒光光譜(圖4A)。結(jié)果表明,未加入Cu2+時,溶液熒光強度最大,隨著溶液中Cu2+濃度增大,體系的熒光強度逐漸降低,505 nm 處的熒光強度與Cu2+濃度之間的關(guān)系如圖4B 所示,表明SA-AP-PPh3 探針對Cu2+具有較好的熒光響應(yīng)。在0.5~15 μmol/L 范圍內(nèi),Cu2+濃度與探針在505 nm 處的熒光強度存在良好的線性關(guān)系,線性方程為I=–175.8728C+5053.0449(圖4C),檢出限為261 nmol/L(S/N=3),遠低于我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749—2022)[22]中規(guī)定的Cu2+的最高限量(1.0 mg/L,約15.6 μmol/L)。此結(jié)果表明本方法能夠滿足環(huán)境中Cu2+的檢測需求。
考察了探針檢測Cu2+的選擇性,如圖4D 所示,Cu2+的加入使得溶液的熒光強度大幅下降,而其它離子在相同濃度下不能或者僅能微弱地降低體系的熒光強度,表明此探針分子對Cu2+具有良好的選擇性。
考察了SA-AP-PPh3 探針對實際樣品中Cu2+的檢測效果。將此探針應(yīng)用于實際自來水樣品中Cu2+的檢測,結(jié)果如表1 所示,Cu2+的加標(biāo)回收率為98.4%~105.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.3%~4.1%,表明此探針可用于實際樣品中Cu2+的檢測,效果良好。
2.3 檢測機理
Cu2+能夠降低SA-AP-PPh3 探針的熒光強度。粒徑測試結(jié)果(圖5A)表明, SA-AP-PPh3 在水中存在納米尺度的聚集現(xiàn)象,與之前測定的吸收光譜中的帶邊抬起現(xiàn)象一致(圖2D),這表明盡管分子中含有親水性的季膦鹽結(jié)構(gòu),但由于分子中含有較多剛性的共軛結(jié)構(gòu)(5 個苯環(huán)),疏水性依然較強,濃度較大時僅能分散在水中。加入Cu2+后,粒徑進一步增加,表明SA-AP-PPh3 與Cu2+之間存在相互作用,這與文獻[23-24]報道的結(jié)果一致。核磁共振氫譜見圖5B,在加入50 μmol/L Cu2+后, SA-AP-PPh3 中的羥基質(zhì)子對應(yīng)的峰消失,表明Cu2+可與SA-AP-PPh3 中的羥基結(jié)合,導(dǎo)致探針分子的ESIPT 過程受到抑制,熒光強度下降[18]。加入Cu2+前后的瞬態(tài)熒光光譜如圖5C 所示,加入Cu2+后,探針分子的壽命有一定程度下降,這說明本方法存在動態(tài)淬滅過程。
2.4 細胞成像
利用MTT 實驗評估了不同濃度的SA-AP-PPh3 探針對Hela 細胞的細胞毒性,結(jié)果表明, 25 μmol/LSA-AP-PPh3 與Hela 細胞孵育24 h 后,MTT 代謝產(chǎn)物的吸光度與空白相比稍有降低,細胞存活率高于80%,表明此探針具有良好的生物相容性,最終選取20 μmol/L SA-AP-PPh3 進行細胞實驗。
三苯基膦鹽基團具有線粒體靶向特性[25]。選取商業(yè)化的線粒體染料MTR作為參照,進行細胞共定位實驗,以考察SA-AP-PPh3 在細胞內(nèi)的分布情況。SA-AP-PPh3 和MTR 共同孵育60 min 后,共聚焦圖像如圖6A~6C所示。在SA-AP-PPh3 的綠色通道(圖6A)和MTR的紅色通道(圖6B)中分別檢測到綠色熒光和紅色熒光。由圖6A~6C 中3 個劃線位置的熒光信號強度圖(圖6D~6F)可知,綠光通道與紅光通道的發(fā)光位置幾乎一致,信號強度也呈現(xiàn)出高度的一致性。兩個成像通道的熒光疊加圖(圖6C)顯示, SA-AP-PPh3的藍色熒光與MTR的紅色熒光重疊較高。通過圖像處理軟件Image J對兩個通道的共定位情況進行分析,計算發(fā)現(xiàn)重合率為77%。以上結(jié)果表明, SA-AP-PPh3 主要附著于細胞的線粒體,具有線粒體靶向功能。
考察了SA-AP-PPh3 探針檢測細胞中Cu2+的應(yīng)用潛力。向含有Hela 細胞的共聚焦培養(yǎng)皿中加入探針SA-AP-PPh3,孵育60 min 后,向其中一組加入Cu2+,繼續(xù)孵育30 min,采用PBS 沖洗后觀測細胞共聚焦成像結(jié)果。如圖7A 所示,僅加入探針的細胞中能夠觀測到較強的熒光信號,而加入探針和Cu2+的細胞中的熒光信號明顯降低(圖7B)。兩張共聚焦照片所采集的平均光密度結(jié)果(圖7C)表明,加入Cu2+后,熒光強度僅為原來的1/5。以上實驗結(jié)果表明,SA-AP-PPh3 探針可用于細胞內(nèi)Cu2+的檢測。
3 結(jié)論
以含有PPh3 官能團的SA 衍生物和AP 為原料,通過席夫堿反應(yīng)合成了一種新型有機熒光小分子探針SA-AP-PPh3,用于水中Cu2+的熒光測定。合成的SA-AP-PPh3 具有明顯的ESIPT 性質(zhì),與Cu2+結(jié)合后,ESIPT 過程受阻,進而引起熒光強度降低。Cu2+濃度在0.5~15 μmol/L 范圍內(nèi),此探針對Cu2+表現(xiàn)出優(yōu)異的線性響應(yīng),檢出限為261 nmol/L,可用于實際水樣中Cu2+的定量分析。此外,細胞實驗表明,此探針能夠定位細胞線粒體,具有檢測細胞中Cu2+的能力。本方法為Cu2+的高效和靈敏檢測提供了新思路。
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