摘" 要：為快速鑒別豬急性腹瀉綜合征（swine acute diarrhea syndrome，SADS）、豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）和豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis，TGE）這3種豬腹瀉疾病，本研究利用膠體金免疫層析技術(shù)，建立并優(yōu)化同步檢測(cè)這三種豬腹瀉疾病的方法。結(jié)果表明，SADS-PED-TGE三合一抗原快速檢測(cè)卡的最低檢測(cè)限分別為2×102、1×104和1×103 TCID50/mL，該卡與常見豬腹瀉的病原體及其他豬病的病原體均無(wú)交叉反應(yīng)，具有高度特異性，在常溫和4 ℃條件下可以分別穩(wěn)定保存9和12個(gè)月。該三聯(lián)檢測(cè)卡操作簡(jiǎn)便快速，且特異、靈敏、穩(wěn)定，能同時(shí)檢測(cè)3種豬腹瀉疾病，適用于基層工作人員現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。

關(guān)鍵詞：豬急性腹瀉綜合征；豬流行性腹瀉；豬傳染性胃腸炎；膠體金免疫層析；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）06-0024-08

作者簡(jiǎn)介：柯艷坤（1983－ ），女，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病檢疫、監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作；E-mail：84347158@qq.com

*通信作者：施遠(yuǎn)國(guó)（1974－ ），男，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病檢疫、監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作；E-mail：120956892@qq.com

豬急性腹瀉綜合征（swine acute diarrhea syndrome，SADS）是2017年首次在中國(guó)廣東省發(fā)現(xiàn)的一種由豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV）引起的一種新型豬腸道傳染病[1-3]，其臨床表現(xiàn)為急劇嘔吐、下痢、脫水，甚至死亡，不同年齡段的豬均可感染，新生仔豬的發(fā)病率和死亡率最高，5日齡以下仔豬死亡率達(dá)90％[3-4]。豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）和豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis，TGE）的臨床表現(xiàn)、易感宿主與SADS相似[5]，且病原體也為冠狀病毒[6]，分別為豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）。這3種豬傳染性疾病均為高度接觸性傳染病，可通過(guò)糞便、污染物和空氣傳播。由于缺乏特效治療藥物，仔豬死亡率居高不下[7-9]，對(duì)全國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。目前，三種疫病的防治主要遵循“預(yù)防為主、治療為輔、防重于治”的原則，加強(qiáng)豬舍清潔消毒工作，控制疫病傳播途徑，利用快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段區(qū)分疫病類型，及時(shí)控制及治療。

關(guān)于這三種病毒的檢測(cè)技術(shù)主要包括PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及膠體金免疫層析技術(shù)（golloidal gold immunochroma-tography assay，GICA）[11]等。PCR、LAMP和ELISA檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、特異性好，但容易受到人為、環(huán)境等多種因素的影響，且需要專業(yè)技術(shù)人員和配套的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，不適合非實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[12-13]。GICA利用膠體金作為示蹤標(biāo)記物，以硝酸纖維素膜為載體，將待檢樣本和膜上提前固定的抗體或抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的紅色斑點(diǎn)或條帶，用于指示出樣本中存在特定的具有生物活性的物質(zhì)。由于GICA具備操作簡(jiǎn)便、無(wú)需設(shè)備、方便攜帶、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)，更適用于基層工作人員現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[14]，快速區(qū)分疫病類型，以便進(jìn)行及時(shí)防控和治療。

本研究借助GICA技術(shù)，建立并優(yōu)化SADS、PED和TGE的GICA三聯(lián)檢測(cè)技術(shù)，將GICA三聯(lián)檢測(cè)技術(shù)與動(dòng)物疫病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基層工作人員對(duì)活體豬現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和診斷的目標(biāo)，控制豬場(chǎng)疫病傳播，指導(dǎo)養(yǎng)豬生產(chǎn)。

1" 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體1#和7#、豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體26#和33#、豬傳染性胃腸炎病毒培養(yǎng)液、豬流行性腹瀉病毒培養(yǎng)液均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒單克隆抗體N4和N5、豬急性腹瀉綜合征病毒培養(yǎng)液均由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自洛陽(yáng)佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；臨床樣本（糞便）采集于深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自Roche公司；氯金酸、TritonX-100、Tween-20、PVP-40均購(gòu)自Sigma公司；檸檬酸三鈉購(gòu)自Amresco公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、蔗糖均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鉀購(gòu)自西隴化工股份有限公司；海藻糖購(gòu)自南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司；聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）膠板購(gòu)自南通浩杰特貿(mào)易有限公司；硝酸纖維素膜Sartorius CN140購(gòu)自Sartorius公司；玻璃纖維SB06和8964以及吸水紙均購(gòu)自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

GTR116C高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；ZQ3500數(shù)控高速斬切機(jī)、HM3035三維劃膜噴金儀、CTS300數(shù)控裁條機(jī)和YK725壓殼機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；WKF-LYHm007連續(xù)劃膜儀（杭州格倫坤科技有限公司）；多功能薄膜封口機(jī)（溫州兄弟機(jī)械有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠體金溶液的制備

配制100 mL 0.01％氯金酸水溶液，煮沸后迅速加入1％檸檬酸三鈉溶液搖勻，持續(xù)加熱10 min，直至溶液呈透亮的酒紅色。不斷攪拌，冷卻至室溫，用超純水定容至100 mL，分裝至棕色試劑瓶中，2～8 ℃避光保存，備用。

1.3.2 金標(biāo)抗體的制備

使用0.1 mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH后，分別加入適量的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒單抗（N4）、豬流行性腹瀉病毒單抗（33#）以及豬傳染性胃腸炎病毒單抗（7#），低速振蕩混勻，室溫標(biāo)記30 min。分別加入10％的BSA溶液振蕩混勻后，室溫封閉30 min。" "4 ℃，2 000 g離心20 min，棄上清，加入含5％蔗糖的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸，振蕩混勻，2～" 8 ℃避光保存，備用。

1.3.3 檢測(cè)卡的組裝

樣本墊、金墊分別經(jīng)樣本墊處理液、金墊處理液浸泡30 min后，室溫干燥過(guò)夜。將金標(biāo)抗體分別轉(zhuǎn)移至金墊上，置于干燥房?jī)?nèi)，37 ℃烘干過(guò)夜。將羊抗鼠IgG抗體包被至硝酸纖維素膜（nitro cellulose，NC膜）上作為質(zhì)控線（C線），將豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒單抗（N5）、豬流行性腹瀉病毒單抗（26#）以及豬傳染性胃腸炎病毒單抗（1#）分別包被作為對(duì)應(yīng)試紙條的檢測(cè)線（T線），置于干燥房?jī)?nèi)，37 ℃烘干過(guò)夜。將制備完成的樣本墊、金墊、NC膜、吸水紙組裝在PVC底板上，用數(shù)控裁條機(jī)裁切成3.0 mm寬的試紙條，最后組裝成檢測(cè)卡，密封、干燥、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 檢測(cè)步驟

使用前將檢測(cè)卡、樣本稀釋液和待檢樣本平衡至室溫。用棉簽收集新鮮的豬糞便樣本或從活體豬直腸直接取樣，然后立即將棉簽插入裝有樣本緩沖液的收集管，在管內(nèi)壁反復(fù)用力旋轉(zhuǎn)，蓋緊管蓋，振蕩混勻后用膠頭滴管吸取樣本溶液，滴加2滴（約100 μL）至檢測(cè)卡樣本墊上，室溫反應(yīng)8～10 min，觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.3.5 結(jié)果判定

對(duì)于含有檢測(cè)抗原的陽(yáng)性樣本，病毒抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物會(huì)被T線包被的單克隆抗體捕獲，T線顯紅色，剩余未與病毒抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體會(huì)在C線處被包被的羊抗鼠IgG抗體捕獲，C線顯紅色；對(duì)于不含檢測(cè)抗原的陰性樣本，由于金標(biāo)抗體不能與T線包被的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合而不被截留在T線，T線不顯色，而C線包被的羊抗鼠IgG抗體會(huì)捕獲金標(biāo)抗體，因此C線顯紅色。若C線不顯紅色，則說(shuō)明檢測(cè)卡失效。

1.4 GICA檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)最佳的檢測(cè)靈敏度、特異性、穩(wěn)定性及顯色效果，分別對(duì)膠體金溶液pH、金標(biāo)抗體用量、T線和C線包被抗體量以及噴金量進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 檢測(cè)卡性能評(píng)價(jià)

1.5.1特異性試驗(yàn)

利用組裝的膠體金免疫層析檢測(cè)卡分別檢測(cè)SADS-CoV、PEDV、TGEV、豬δ冠狀病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）以及非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）7種病毒培養(yǎng)液，按1.3.4確定檢測(cè)卡的特異性。

1.5.2 靈敏度試驗(yàn)

用樣本稀釋液分別對(duì)SADS-CoV、PEDV和TGEV三種病毒培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，按1.3.4評(píng)估檢測(cè)卡的靈敏度。

1.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將制備的SADS-PED-TGE三合一抗原快速檢測(cè)卡置于室溫和4 ℃條件下密封、避光保存，每隔30 d隨機(jī)取出部分檢測(cè)卡對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估檢測(cè)卡的穩(wěn)定性。

2" 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)卡檢測(cè)條件優(yōu)化

2.1.1 最適pH的確定

當(dāng)膠體金溶液的pH未能達(dá)到抗體-膠體金結(jié)合最適點(diǎn)時(shí)，膠體金會(huì)聚沉，溶液將由橙紅色變?yōu)樗{(lán)色，因此保持紅色的最低pH，即為膠體金溶液的最適pH[15]。利用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)三種粒徑不同的膠體金溶液的pH，結(jié)果如圖1所示，用于制備SADS、TGE和PED金標(biāo)抗體的最適pH分別為7.5、8.0和8.5，加入0.1 mL 10％的氯化鈉溶液后，膠體金溶液顏色均為橙紅色，隨著pH的不斷增大，膠體金溶液顏色不變。

2.1.2 最佳抗體標(biāo)記量的確定

向裝有已完成最適pH調(diào)節(jié)的膠體金溶液的離心管中，分別加入單克隆抗體N4、33#及7#，振蕩混勻，靜置20 min。向上述管內(nèi)分別加入0.1 mL 10％氯化鈉溶液，振蕩混勻，靜置20 min，以未加入單克隆抗體的離心管作為空白對(duì)照組，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著溶液中單克隆抗體含量的增加，反應(yīng)體系逐漸趨于穩(wěn)定，當(dāng)膠體金溶液中加入的單克隆抗體N4、33#及7#終濃度分別為10、17和13 μg/mL時(shí)，顏色變?yōu)槌燃t色，膠體金標(biāo)記效果可滿足檢測(cè)卡要求。

在此基礎(chǔ)上分別增加20％即為最佳抗體標(biāo)記量，即制備金標(biāo)抗體N4、33#和7#的最佳抗體標(biāo)記量分別為12、20和15 μg/mL。

2.1.3 檢測(cè)線包被抗體最佳濃度的確定

分別用不同濃度的單克隆抗體N5、26#和1#包被T線，對(duì)SADS、PED和TGE陽(yáng)性樣本及陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，T線顯色效果隨著抗體包被濃度的增加而提高，當(dāng)單克隆抗體N5、26#和1#的包被濃度分別達(dá)到1.0、2.0和1.5 mg/mL時(shí)，顯色效果趨于穩(wěn)定；對(duì)陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，當(dāng)單克隆抗體包被濃度達(dá)到1.5、2.0和2.0 mg/mL時(shí)T線顯色，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。從實(shí)際生產(chǎn)的角度考慮，SADS、PED和TGE檢測(cè)卡的T線包被單克隆抗體N5、26#和1#的最佳濃度分別為1.0、1.8和1.5 mg/mL。

2.1.4 質(zhì)控線包被抗體最佳濃度的確定

分別用不同濃度的羊抗鼠IgG抗體包被C線，對(duì)SADS、PED和TGE陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)SADS、PED和TGE檢測(cè)卡的抗體包被濃度分別為1.0、1.5和1.5 mg/mL時(shí)，C線和T線的顯色效果趨于一致，條帶清晰。

2.1.5 最佳噴金量的確定

分別用不同濃度的噴金量制備檢測(cè)卡，對(duì)SADS、PED和TGE陽(yáng)性樣本及陰性樣本進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見圖5。由圖5可知，對(duì)陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，T線均未顯色；對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，T線顯色效果隨著噴金濃度的增加而提高，當(dāng)SADS、PED和TGE檢測(cè)卡噴金量達(dá)到2.0、2.5和2.5 μL/cm時(shí)，條帶清晰，顯色效果已滿足檢測(cè)需求。因此，考慮實(shí)際生產(chǎn)使用的需要，確定SADS、PED和TGE檢測(cè)卡的最佳噴金量分別為2.0、2.5和2.5 μL/cm。

2.2 檢測(cè)卡性能評(píng)價(jià)

2.2.1 特異性

分別用7種病毒（SADS-CoV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRV、PRRSV、ASFV）培養(yǎng)液對(duì)SADS、PED、TGE三種檢測(cè)卡進(jìn)行特異性測(cè)試，并設(shè)立陰性對(duì)照組，結(jié)果見圖6。由圖6可知，三種檢測(cè)卡檢測(cè)陰性樣本時(shí)，結(jié)果均為陰性；檢測(cè)陽(yáng)性樣本時(shí)，結(jié)果均為陽(yáng)性，且與常見豬腹瀉的病原體及其他豬病的病原體均無(wú)交叉反應(yīng)，具有高度特異性。

2.2.2 靈敏度

分別對(duì)三種病毒（SADS-CoV、PEDV、TGEV）培養(yǎng)液做梯度稀釋，對(duì)SADS、PED、TGE三種檢測(cè)卡進(jìn)行靈敏度測(cè)試，結(jié)果見圖7。由圖7可知，SADS、PED和TGE檢測(cè)卡的最低檢測(cè)限分別為2×102、1×104和1×103 TCID50/mL。

2.2.3 穩(wěn)定性

將制備的SADS-PED-TGE三合一抗原快速檢測(cè)卡分別置于室溫和4 ℃環(huán)境中，每隔30 d進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果表明，檢測(cè)卡在室溫環(huán)境中放置9個(gè)月，檢測(cè)卡的T線和C線顯色均無(wú)明顯變化，超過(guò)9個(gè)月檢測(cè)卡顯色效果略有降低。而在4 ℃環(huán)境中放置12個(gè)月，檢測(cè)卡的T線和C線顯色均無(wú)明顯變化，超過(guò)12個(gè)月檢測(cè)卡顯色效果略有降低。因此，本研究制備的SADS-PED-TGE三合一抗原快速檢測(cè)卡可以分別在室溫和" 4 ℃環(huán)境中穩(wěn)定保存9和12個(gè)月。

3" 討論

引發(fā)豬腸道疾病的冠狀病毒是一種正義單鏈RNA包膜病毒，隸屬于網(wǎng)巢病毒目冠狀病毒科，包括α、β、γ和δ四個(gè)冠狀病毒屬[16]。迄今為止，SADS-CoV是繼PEDV、TGEV之后在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的第3種引發(fā)豬腸道疾病的冠狀病毒[6]，由于三種病毒引起的疾病具有高度相似的癥狀，難以區(qū)分，增加了疫病確診的難度，此外，這3種疾病傳染性強(qiáng)，易反復(fù)暴發(fā)，且目前沒有特效藥進(jìn)行針對(duì)性治療，導(dǎo)致仔豬死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，同時(shí)檢測(cè)這3種疫病是至關(guān)重要的，以便能及時(shí)、有效地預(yù)防和控制其傳播。

目前，針對(duì)這三種豬腹瀉疾病的檢測(cè)方法有單一檢測(cè)法[17-19]或與其他豬病毒的多聯(lián)檢測(cè)法[20]，多聯(lián)檢測(cè)法相較單一檢測(cè)法而言，不僅能提高診斷效率及準(zhǔn)確性，還能節(jié)約時(shí)間、資源以及降低檢測(cè)成本，對(duì)基層人員快速、準(zhǔn)確檢測(cè)多種豬疾病具有重大意義。因此，建立并優(yōu)化多聯(lián)檢測(cè)方法已成為行業(yè)趨勢(shì)。劉影等[21]通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，建立了同時(shí)檢測(cè)PDCoV、SADS-CoV和PEDV三種冠狀病毒的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，完成了對(duì)豬病毒的多聯(lián)檢測(cè)，在特異性、敏感性、穩(wěn)定性及重復(fù)性等多個(gè)方面均表現(xiàn)出較好的結(jié)果；鄧可輝等[22]利用RT-LAMP技術(shù)和恒溫設(shè)備，在63～67 ℃恒溫條件下，成功建立了同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV和PDCoV三種冠狀病毒的多聯(lián)檢測(cè)法。上述方法雖然檢測(cè)效果良好，但均需專業(yè)技術(shù)人員及專門設(shè)備輔助檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的目的。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于SADS、PED和TGE三種豬腹瀉疾病的GICA三聯(lián)檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道較少，本研究針對(duì)三種典型的引發(fā)豬腹瀉的病毒（SADS-CoV、PEDV和TGEV），建立可同時(shí)檢測(cè)三種病毒的GICA方法，并對(duì)膠體金溶液pH、膠體金蛋白標(biāo)記量、T線和C線抗體包被量以及噴金量等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明本研究制備的三聯(lián)卡能達(dá)到聯(lián)檢目的，其檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好，且操作便捷，制作成本低，占用空間，方便攜帶，可應(yīng)用于豬場(chǎng)腹瀉疾病的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有非常高的應(yīng)用價(jià)值。

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