孟梁等

摘 要 結合水相分子印跡和光子晶體技術構建了嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠傳感器，并成功用于生物樣品中痕量嗎啡的篩查。以嗎啡為印跡模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基丙烯酸甲酯為交聯(lián)劑，填充至二氧化硅光子晶體模板孔隙中進行共價型分子印跡聚合，在1% HF溶液中除去光子晶體模板，并洗脫印跡模板分子，即可得到具有目標分子傳感功能的分子印跡光子晶體水凝膠傳感器。此傳感器在水相環(huán)境中對嗎啡分子的識別能力良好，可以在不需要標記的情況下，將目標分子的識別轉變?yōu)檠苌浞宓奈灰?，該光學信號通過傳感器顏色的變化表現(xiàn)出來，嗎啡濃度由10 pg/mL增加到1 μg/mL過程中，衍射峰最大偏移達到38 nm，并且抗干擾能力強，檢出限為0.1 μg/L，響應時間為 40 s，可以重復使用。此檢測平臺不需要對樣品進行處理，便可準確、靈敏、快速地檢測復雜樣品中的目標分析物。

關鍵詞 水相分子印跡； 光子晶體； 化學傳感器； 嗎啡； 快速檢測； 尿樣

1 引 言

阿片類毒品是目前世界上使用歷史最長、流行范圍最廣、危害最嚴重的毒品[1]。嗎啡是海洛因、嗎啡和可待因的最終代謝物[2，3]。盡管目前檢測嗎啡的方法很成熟而且靈敏有效[4～9]，但是都需要貴重的大型分析儀器和復雜的樣品前處理過程，耗時費力，難以滿足大規(guī)模樣品篩查以及現(xiàn)場快速檢測要求。由于缺少高專一性的抗體，快速篩查免疫試劑盒存在易干擾和靈敏度低的缺點[10]。因此，有必要建立一種快速有效、靈敏、專一并且適合現(xiàn)場篩查大量復雜樣品中嗎啡的方法。

在本研究中，采用水相分子印跡技術構建了嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠傳感器，由于該傳感器具有特殊的反蛋白石陣列結構，嗎啡分子的識別過程可以引起水凝膠體積的變化，從而引發(fā)陣列結構的Bragg衍射位移，使傳感器顏色發(fā)生改變。該新型化學傳感器平臺具有高選擇性、高靈敏度以及快速響應的特性，并且已經在藥物分析[11～14]、環(huán)境檢測[15]、生物分析[16，17]乃至生物大分子檢測[18，19]方面有了實際應用。對影響傳感器的識別能力和傳感性能的因素進行了優(yōu)化?？疾炝怂嘀苽涞膫鞲衅鞯膫鞲行阅芗捌浞肿幼R別效果，同時對傳感器的識別機理和光學響應機理進行了研究。此傳感器平臺在水相環(huán)境中具有良好的相容性，可用于生物樣品中的痕量嗎啡分子的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

EI Quanta FEG 650掃描電鏡（OR，USA）；General TU19紫外可見分光光度計（北京，中國）；Bruker VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀（Ettlingen，Germany）；Agilent 7890N 氣相色譜/5975C質譜聯(lián)用儀（GCMS，Agilent Technologies，USA）。發(fā)射365 nm波長的紫外光燈（FUSI Electric ST3，Japan）。普通數(shù)碼相機（Nikon D80，Japan）。

嗎啡鹽酸鹽（Morphine hydrochloride）、海洛因鹽酸鹽（Heroin hydrochloride）、O6單乙酰嗎啡鹽酸鹽（6Monoacetylmorphine hydrochloride）、可待因磷酸鹽（Codeine phosphate）、苯丙胺鹽酸鹽（Amphetamine hydrochloride）和氯胺酮鹽酸鹽（Ketamine hydrochloride）購于公安部物證鑒定中心（北京）。甲基丙烯酸（Methacrylic acid，MAA）、丙烯酸、丙烯酰胺和其它試劑購于北京化工廠。乙二醇二甲基丙烯酸甲酯（Ethylene glycol dimethylacrylate，EGDMA）和2， 2′偶氮二異丁腈（2，2′Azobisisobutyronitrile，AIBN）購于Alfa Aesar試劑公司（MA，USA）。無水甲醇購于TEDIA Company（OH，USA）。聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylmethacrylate，PMMA）載玻片（25 mm × 25 mm×1 mm）購于本地供應商。

2.2 嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠傳感器的制備

采用Stber法制備單一粒徑的單分散二氧化硅納米微球，本研究制備的單分散二氧化硅納米微球的粒徑為220 nm。采用蒸發(fā)誘導自組裝方法制備光子晶體模板。二氧化硅納米微球以及光子晶體模板具體制備過程參照文獻＼[13＼]。

嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠傳感器制備過程：0.025 mmol嗎啡（8.04 mg）、0.35 mmol MMA（29.70 μL）與0.05 mmol EGDMA（9.40 μL）超聲溶解于50 μL甲醇和30 μL水中，于陰暗處放置12 h。然后加入2 mg 引發(fā)劑AIBN，溶解后通入氮氣2 min以除去氧氣。將一片PMMA玻片蓋在光子晶體模板上，用鑷子夾住，然后用微量移液器將50 μL的前驅液從玻片的邊緣滴入，利用毛細作用力將前驅液吸入玻片之間以及光子晶體的間隙之間，當光子晶體模板由鮮艷的顏色變?yōu)橥该鲿r，表明溶液已經完全滲入。用夾子將兩片玻片夾好放在365 nm紫外燈下光聚合 2 h。然后浸入1% HF中以除去二氧化硅顆粒，并使兩片玻片分離，從而在PMMA玻片形成具有反蛋白石結構的分子印跡膜。然后，將其浸入乙酸/乙醇溶液（1∶99，V/V）2 h以洗脫嗎啡模板分子，反復洗脫，直到在洗脫液中用GCMS檢測不到嗎啡分子為止。最后，將得到的分子印跡膜用去離子水沖洗干凈后浸泡在磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.6，10 mmol/L）中使其達到平衡狀態(tài)，即可進行檢測和表征。作為對照實驗，采用上述同樣過程制備非分子印跡光子晶體水凝膠（NIPHs），只是在前驅液中不加入嗎啡分子。

2.3 嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠的表征

分子印跡光子晶體水凝膠膜的表面形貌使用掃描電鏡觀測。將空白分子印跡光子晶體水凝膠分別浸入濃度由低到高的待測分子緩沖溶液中，待穩(wěn)定后用紫外可見分光光度計測試傳感器的Bragg衍射峰的位置，同時在日光燈下用數(shù)碼相機對其拍照。紫外可見分光光度計和紅外光譜儀用于識別性能表征以及識別機理研究。如果沒有特殊說明，每個數(shù)據均取5次平行實驗的平均值（下同）。

3 結果與討論

3.1 最佳合成體系選擇

文獻＼[20，21＼]報道，在合成嗎啡分子印跡時使用MAA作為功能單體。EGDMA是常用的交聯(lián)劑，由于其具有一定的親水性，也適合用于水相分子印跡膜的合成。并且也有使用EGDMA作為交聯(lián)劑聯(lián)合甲基丙烯酸功能單體合成嗎啡分子印跡的文獻報道[20，21]。本研究中也證實使用MAA和EGDMA得到了良好的實驗結果。

在致孔劑中加入少量水，對生成具有高度多孔交聯(lián)結構以及較高內表面積的水相分子印跡水凝膠膜具有至關重要的作用，但是分子印跡過程中強極性水的參與可能會干擾氫鍵的生成并增強疏水作用力。在本研究中，由于嗎啡是強極性化合物，其在有機溶劑中的溶解度較低，為此需要增加致孔劑中水的含量，以增加嗎啡的溶解度。兼顧分子印跡水凝膠在水相中的識別能力以及嗎啡鹽酸鹽、甲基丙烯酸和EGDMA在前驅液中的溶解性，選擇50 μL甲醇與30 μL水的混合溶液作為致孔劑，制備出具有較好柔韌度和理想內表面特性的分子印跡水凝膠。但是此時水的含量已高達37.5%，這對印跡膜的識別能力有一定的影響。

由于致孔劑中含有比例高達37.5%的水以增加嗎啡的溶解度，強極性的水可能會干擾氫鍵的生成，并增強疏水作用力，以阻礙嗎啡模板分子與甲基丙烯酸功能單體之間形成穩(wěn)定的復合物。嗎啡分子與甲基丙烯酸之間存在4個強有力的作用位點[10]，因此在上述條件下還有可能制備出有一定識別能力的分子印跡膜。為了減弱水對分子間氫鍵形成的干擾，而增強嗎啡分子與甲基丙烯酸之間的作用力，就要確保有足夠多的功能單體參與反應，以抵抗水分子氫鍵的干擾，建立模板分子與功能單體之間高親和作用位點并確保結合位點充分形成。經過實驗優(yōu)化，考察模板分子與功能單體的物質的量比（1∶5，1∶7，1∶10，1∶14，1∶17），最終確定二者比例為1∶14。

通常，交聯(lián)劑和功能單體的最佳合適比依賴于模板分子的大小[22]。本研究中，加入了過量的功能單體，功能單體的分子數(shù)量增加會增長功能單體與交聯(lián)劑之間的鏈長，因此，為了穩(wěn)定水凝膠良好的柔韌性，就需要同時增加交聯(lián)劑鏈長，以形成穩(wěn)定的水凝膠網絡骨架結構[23，24]。通過實驗，考察了功能單體和交聯(lián)劑以不同比例（3∶1，5∶1，7∶1，10∶1）制備的分子印跡光子晶體水凝膠的傳感性能，確定功能單體和交聯(lián)劑的比例為7∶1。此平衡條件下制備的分子印跡光子晶體水凝膠不但具有強烈的Bragg衍射信號，而且對嗎啡分子具有一定的響應能力，從圖1a可見，將空白嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠分別浸入系列濃度（10 pg/mL～1 μg/mL）的嗎啡溶液中，隨著溶液中嗎啡分子濃度增大，Bragg衍射峰的位置也相應產生位移，Bragg衍射峰最大偏移可達到38 nm，具有較高的靈敏度，可以看到表觀顏色變化，可用于實際樣品中低濃度嗎啡的檢測。

3.2 嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠的傳感性能評價

合成體系中存在大量水，但制備的分子印跡光子晶體水凝膠同樣具有典型的反蛋白石結構，相互聯(lián)通的大孔結構規(guī)則排列，具有非常大的比表面積（圖2）。圖1a展示了分子印跡光子晶體水凝膠在最佳識別環(huán)境下對目標分子的識別傳感性能，Bragg衍射峰最大偏移達到38 nm。雖然38 nm的衍射峰位移在反映分子印跡光子晶體水凝膠的表觀顏色變化上有些困難，但是只要調控空白分子印跡光子晶體水凝膠的衍射峰位于兩種顏色的突躍處附近，那么隨著Bragg衍射峰的位移，其表觀顏色就容易發(fā)生變化，即可憑借肉眼觀測。圖1b所示，調控空白嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠在空白磷酸鹽緩沖溶液里呈綠色，而后在1 mg/L 嗎啡溶液里，其表觀顏色從綠色變到橙色。由于非特異性吸附可能會造成衍射峰的微小位移，將嗎啡分子引起衍射峰位移3 nm作為系統(tǒng)噪聲，采用紫外可見分光光度儀檢測傳感器移位，則可估算其檢出限為0.1 μg/L（S/N=3）。如果僅用裸眼觀測，10 μg/L嗎啡溶液就能引起傳感器裸眼可感知的表觀顏色變化。不論是使用紫外可見分光光度儀還是僅用裸眼觀測，此傳感器的檢出限均優(yōu)于傳統(tǒng)儀器分析方法[25，26]。

選擇海洛因、O6單乙酰嗎啡、可待因、苯丙胺和氯胺酮等物質進行了干擾實驗。由于受尺寸、形狀和作用點等因素影響，只有嗎啡分子能夠與分子印跡納米孔穴重新結合，從而引起水凝膠體積的變化，進而引起晶格參數(shù)及Bragg衍射峰的位置也相應發(fā)生變化（圖3）。在相同的測試條件下，使用非印跡光子晶體水凝膠做對照實驗，結果表明，其對嗎啡及其它藥物均無響應。

由于分子印跡光子晶體水凝膠三維有序大孔相互聯(lián)通，在比表面積很高的內表面上密布有效識別位點，較低的傳質擴散阻力使目標分子能快速到達內表面上的識別位點。另外，目標分子與識別位點之間的親和力也能加速目標分子的擴散[12]。實驗表明，將空白嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠浸入10 μg/L嗎啡溶液中， 僅需40 s即可到達響應平衡（圖4a）。在合成嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠時，同時增加了交聯(lián)劑EGDMA 和功能單體甲基丙烯酸的量，繼而得到了同樣具有良好的柔韌性并且穩(wěn)定的水凝膠網絡骨架結構，并采用分子自組裝法以非共價鍵合方式生成分子印跡，因此，嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠也很容易再生并重復使用。同一個分子印跡光子晶體水凝膠循環(huán)使用5次（嗎啡溶液的濃度為10 μg/L），衍射峰位移量的標準偏差小于5%，表明其具有良好的可重復利用性（圖4b）。

3.3 嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠的傳感機制研究

3.3.1 分子識別機理研究 本研究采用紫外光譜法和紅外光譜法對嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠的分子識別機理進行了研究。從甲基丙烯酸與嗎啡相互作用的紫外光譜圖（圖5）可見，隨著甲基丙烯酸量增大，最大吸收峰向長波方向移動，且吸收峰的強度增加。這是由于氫鍵對生色基團作為質子給予體分子的第一個ππ*吸收帶的影響所致；另外，甲基丙烯酸和嗎啡分子間的靜電作用力也起了一定的作用。同時這也是甲基丙烯酸和嗎啡分子間通過氫鍵和靜電作用力自組裝形成超分子體系的特征。與嗎啡溶液的紅外光譜圖相比，在甲基丙烯酸和嗎啡混合體系的紅外光譜圖（圖6）中，COC對稱振動吸收峰947 cm

3.3.3 光學響應機理研究

從Scathcard 分析數(shù)據可知，分子印跡光子晶體水凝膠吸附嗎啡的量遠小于其自身的質量，這表明低濃度的嗎啡即可引起水凝膠的膨脹，產生光學響應。由嗎啡分子濃度差導致的Donnan勢會驅使嗎啡分子涌入水凝膠，并填充印跡空穴，隨后嗎啡分子上的氨基與識別位點上的羧基相互作用使水凝膠內部的離子強度也增大，兩個作用共同導致了光子晶體水凝膠晶格結構的膨脹，從而使Bragg衍射峰紅移[15，29]。另外，實驗中發(fā)現(xiàn)在前驅液中盡可能多加入印跡分子的量，以生成更多的分子印跡納米孔穴，從而提高分子印跡光子晶體水凝膠的識

別效率，提高檢測靈敏度[12]。但是由于嗎啡分子在前驅液中的溶解度較低，從而導致其內部的分子印跡納米孔穴的量相對較少，影響分子識別效率。

3.4 嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠在生物樣品中的傳感性能

考察了嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠在真實生物樣品（人尿）中的傳感性能。吸毒者的尿樣來自公安局法醫(yī)物證鑒定中心（n=3），并采用GCMS分析確認含有嗎啡。待檢測尿液需要用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.6）以體積比1 ∶ 2稀釋。分子印跡光子晶體水凝膠在空白尿液緩沖溶液中無響應，這表明生物樣品基質不干擾分子印跡光子晶體水凝膠的識別能力。在吸毒者的尿中，分子印跡光子晶體水凝膠由初始的綠色變成了橙色（圖8），結果表明，嗎啡分子印跡光子晶體水凝膠在有干擾存在的生物樣品中依然保持著高選擇性和高靈敏度的響應能力，證明此傳感器具有良好的實用性能。

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